一种籼稻花药诱导培养改良培养基配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种籼稻花药诱导培养改良培养基配方，具体涉及一种高效率地诱导 籼稻花药愈伤组织的诱导培养基配方，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 花药培养育种，是将花粉培育成单倍体植株，再经染色体自然或人工加倍得到纯 合二倍体的一种育种方法。这种染色体加倍产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生 性状分离，因此，花培育种能极早稳定分离后代、缩短育种年限。在同一选择周期中，单倍体 选择效率要比二倍体高得多。同时，花培加倍后的纯合二倍体植株，可排除杂合体中显性因 子掩盖隐性因子造成的干扰，提高选择的准确性和可靠性。由于花粉植株是由单倍体直接 加倍形成的，故隐性性状得以纯合表现。而且花粉植株表现丰富的多样性，如株高、生育期、 育性及抗性等。这些性状相互交叉，组成了具有多种形态特征的花培株系，因此，花培育种 既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。 花培育种的这些显著优点，引起了世界各国育种工作者的浓厚兴趣。我国于20世纪70 年代开始了花药培养育种，迄今己取得了巨大的成就，并处于世界领先地位。花药培养育种 已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，发展形成了一套育种 技术体系。花培育种是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一，在传统 农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用，是一种快速有效的育种途径。
[0003] 籼稻，栽培稻的一个亚种，是最先由野生稻驯化形成的栽培稻。籼稻和粳稻是我国 自古以来栽培稻的两大类型，籼、粳稻在特征特性上存在明显的差别。籼稻的许多性状比粳 稻更近似于普通野生稻，因而认为籼稻是基本型，而粳稻是变异型。籼稻是适宜于低炜度、 低海拔湿热地区种植的栽培稻亚种，主要分布在中国和南亚、东南亚各国以及热带非洲，中 国主要分布在淮河、秦岭以南地区和云贵高原的低海拔地区。
[0004] 籼、粳稻在生理生化性质上存在许多明显的差别，在花培培养力而言，粳稻培养效 率较高，而籼稻培养力极低。与粳稻相比，籼稻的平均出愈率平均培养力只有0. 5%左右，很 难超过3%，绿苗率大多在20%以下，有些材料不能诱导出愈伤组织或者难以得到花粉植株。 目前通过花培选育的籼稻品种不多，至20世纪末通过花药培养选育的品种仅5个，其中江 西省农业科学院选育4个品种，推广面积也不大。 不同的研宄者针对提高籼稻花培效率进行了研宄，其中通过对培养基进行优化，可使 不同材料的籼稻的花药培养力有不同程度的提高。包括培养基的改良、附加成分的增减、单 倍体的加倍技术、培养条件的改善等等，其目的都在于提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分 化率。其中培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是 影响花培效率的一个很重要的因素。
[0005] 通过多年籼稻花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且 不断尝试加入一些提高籼稻花药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索 出了一种高效率地诱导籼稻花药诱导培养的培养基配方。我们的研宄结果对于进一步推广 和应用水稻单倍体育种和理论研宄无疑有较大的现实意义和实用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种籼稻花药诱导培养基配方，该培养基的配方如下： KNO3 3150 ~3450mg/L，（NH4)2SO4 330 ~410mg/L，KH2PO4 460 ~560mg/L，CaCl2* 2H20 220 ~270mg/L，MgS04· 7H 20 210 ~260mg/L，氯化 2-羟乙基三甲铵 225 ~275mg/L， Na2-EDTA70~80mg/L，FeS04,7H 20 50 ~60mg/L，MnS04,4H20 8.0 ~10.0mg/L，ZnS04,7H20 1.8~2.211^/1^，!131303 5.0~6.〇11^/1^，1(10.9~1.111^/1^，肌醇45~5511^/1^，丙三醇2.5~ 3. 5mg/L，Na3C6H5O7* H 20 0· 4 ~0· 5mg/L，叶酸 0· 4 ~0· 5mg/L，甘氨酸 L 8 ~2. 2mg/L，赖 氨酸1.3~1.511^/]^，脯氨酸0.4~0.6区凡，维生素1311.8~2.211^/]^，维生素136 1.8~ 2. 2mg/L，3-吡啶甲酸L 8~2. 2mg/L，蔗糖42~48g/L，植物凝胶5~6g/L ; 2.4- D 1. 4 ~I. 8mg/L，NAA 2. 3 ~2. 9mg/L，KT 0· 9 ~I. lmg/L，水解蛋白 0· 35 ~ 0· 45g/L，牛磺酸0· 07~0· 09mg/L，生物素0· 07~0· 09mg/L，甲基亚硝基脲L 8~2. 2g/ L，胰岛素 7. 0 ~9. Omg/L，PH 5. 8-6. 0。
[0007] 本发明所述的培养基具有高效率地诱导籼稻花药愈伤组织，可以大幅度地提高籼 稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1 配制如下配方的培养基： KNO3 3300mg/L, (NH4)2SO4 370mg/L,KH2PO4 510mg/L, CaCl2* 2H 20 245mg/L,MgSO4* 7H 20 235mg/L，氯化 2-羟乙基三甲铵 250mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeS04· 7H 20 55mg/L， MnS04,4H20 9.0mg/L，ZnS04,7H20 2.0mg/L，H3B03 5.5mg/L，KI l.Omg/L，肌醇 50mg/L，丙三 醇 3. Omg/L，Na3C6H5O7* H2O 0· 45mg/L，叶酸 0· 45mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，赖氨酸 I. 4mg/L， 脯氨酸〇.5g/L，维生素 BI 2.0mg/L，维生素 B6 2.0mg/L，3-吡啶甲酸2.0mg/L，鹿糖45g/ L，植物凝胶5.5g/L; 2.4- D I. 6mg/L，NAA 2. 6mg/L，KT 1.0 mg/L，水解蛋白 0· 4g/L，牛磺酸 0· 08mg/L，生物 素 0.08mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，胰岛素 8.0mg/L，PH 5.9。
[0009] 选取籼稻品种鸡嘴川和地谷作为花药培养花药供体，采集单核晚期花药作为供试 材料，表面消毒后，6°C下低温预处理3天。预处理后，外植体灭菌（0. 1%升汞溶液，15 min)， 抖药法接种花药于该诱导培养基中诱导愈伤组织，每个三角瓶接种50枚花药，在温度为 28°C、湿度为60%-70%的环境下暗培养。愈伤组织形成后（长到2 mm左右)，计算愈伤组织 诱导率。
[0010] 实施例2 配制如下配方的培养基(氯化2-羟乙基三甲铵添加浓度的优选）： KNO3 3300mg/L, (NH4)2SO4 370mg/L,KH2PO4 510mg/L, CaCl2* 2H 20 245mg/L,MgSO4* 7H 20 235mg/L, Na2-EDTA 75mg/L, FeSO4* 7H 20 55mg/L, MnSO4* 4H 20 9. Omg/L, ZnSO4* 7H 20 2. Omg/ L，H3BO3 5. 5mg/L，KI 1.0 mg/L，肌醇 50mg/L，丙三醇 3. Omg/L，Na3C6H5O7* H 20 0· 45mg/L，叶 酸（λ 45mg/L，甘氨酸2. Omg/L，赖氨酸L 4mg/L，脯氨酸(λ 5g/L，维生素 BI 2. Omg/L，维生 素 B6 2. 0mg/L，3-吡啶甲酸2. Omg/L，蔗糖45g/L，植物凝胶5. 5g/L ; 2.4- D I. 6mg/L，NAA 2. 6mg/L，KT 1.0 mg/L，水解蛋白 0· 4g/L，牛磺酸 0· 08mg/L，生物 素0.08mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，胰岛素8.0mg/L，PH 5.9。
[0011] 氯化2-羟乙基三甲铵的添加浓度设置以下8种：0 ;50mg/L;100mg/L;150mg/L; 200mg/L ；300mg/L ；350mg/L ；400mg/L〇
[0012] 同样选取该两个籼稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0013] 实施例3 配制如下配方的培养基(凝固剂的优选）： KNO3 3300mg/L, (NH4)2SO4 370mg/L,KH2PO4 510mg/L, CaCl2* 2H 20 245mg/L,MgSO4* 7H 20 235mg/L，氯化 2-羟乙基三甲铵 250mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeS04· 7H 20 55mg/L， MnS04,4H20 9.0mg/L，ZnS04,7H20 2.0mg/L，H3B03 5.5mg/L，KI l.Omg/L，肌醇 50mg/L，丙三 醇 3. Omg/L，Na3C6H5O7* H2O 0· 45mg/L，叶酸 0· 45mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，赖氨酸 I. 4mg/L， 脯氨酸〇.5g/L，维生素 BI 2.0mg/L，维生素 B6 2.0mg/L，3-吡啶甲酸2.0mg/L，鹿糖45g/ L ； 2.4- D I. 6mg/L，NAA 2. 6mg/L，KT 1.0 mg/L，水解蛋白 0· 4g/L，牛磺酸 0· 08mg/L，生物 素0.08mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，胰岛素8.0mg/L，PH 5.9。
[0014] 凝固剂设置为以下2种：植物凝胶2. 75g/L，琼脂3. 5g ;琼脂7g。
[0015] 同样选取该两个籼稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0016] 实施例4 配制如下配方的培养基(脯氨酸添加浓度的优选的优选）： KNO3 3300mg/L, (NH4)2SO4 370mg/L,KH2PO4 510mg/L, CaCl2* 2H 20 245mg/L,MgSO4*