专利名称：一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法
技术领域：
一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。
背景技术：
普鲁兰酶(pullulanase，EC 3. 2. I. 41)是专ー性分解普鲁兰、淀粉、支链淀粉和相应分支低聚糖中α-1，6-糖苷键的ー种脱支 酶。与其他普鲁兰水解酶相比，普鲁兰酶特异地水解普鲁兰中α-1，6-糖苷键，生成以麦芽三糖为主的末端产物。该性质决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工エ业、食品、洗涤剂、纺织等中有着重要的用途和良好的市场前景。普鲁兰酶最早是Bender在出芽短梗霉的发酵液中发现并对其酶学性质做了研究。此后，科研工作者从自然界中分离得到了大量产普鲁兰酶的微生物及植物。这些来源的酶性质差别较大，如来源于planticola，最适pH在5. O,最适温度在40°C ;而来源于植物的普鲁兰酶(称R-enzyme),最适的pH和温度分别是5. 6和37°C。尽管如此，从普鲁兰酶的发现到20世纪70年代末，普鲁兰酶的研究一直处于产酶微生物的筛选和酶学性质的鉴定上，并没有出现普鲁兰酶的规模化生产。直到20世纪80年代初，丹麦诺维信公司从马来西亚的土壌中筛选到一株可以产普鲁兰酶的芽孢杆菌(ガadVAAs acidopulIulytics、。该菌株所生产的普鲁兰酶具有耐热耐酸的特性(60°C，pH4.5)比较适合于淀粉糖化エ业的需要。此后，诺维信公司投入巨资对该普鲁兰酶进行研究，并于1983年在日本和欧洲市场同时推出商品化的普鲁兰酶(商品名为PiOmozyme)。目前，诺维信公司占据了中国乃至世界的普鲁兰酶市场。直到1995年杰能科公司利用地衣芽孢杆菌异源表达了 Bacillus deramificans的普鲁兰酶,其酶学性质与ガ.acidopullulytics普鲁兰酶相近,从而使杰能科成为了普鲁兰酶的第二大生产商。由于普鲁兰酶エ业化生产菌株较少，我国在普鲁兰酶上的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选、诱变及优化等方面，效果均不太理想。如1998年山东大学肖敏等人从白酒发酵现场分离得到一株产普鲁兰酶的微生物，其生产的普鲁兰酶耐热性较差，当温度大于50°C后迅速失活，但是pH稳定性较好，在中性和微酸性条件下可于冰箱中长期保存。2001年唐宝英等人从土壤中分离得到一株产普鲁兰酶的芽孢杆菌，其产普鲁兰酶有较好的酶学性质(75°C，pH 4. 6)，但是野生菌株的产酶能力不高，只有1.6 U/mL，经过诱变育种最终才使其产酶水平提高到8. 8 U/mL。近年来随着分子生物学发展，人们开始利用基因工程手段表达外源普鲁兰酶基因，如2006年夏子芳等利用大肠杆菌表达系统表达海栖热袍菌的普鲁兰酶基因，但仅获得胞内酶活；2008年张明炎等将来源于ガaciBiAs Iicheniformis的普鲁兰酶编码基因克隆到大肠杆菌中进行表达，但是最終的酶活也只有5. 6 U/mL ；2010年，王淑军等利用大肠杆菌的表达系统实现了来源于深海古菌sicuIi HJ21的普鲁兰酶编码基因的异源表达，但是异源表达的效果较差，且仅获得胞内酶活。综上所述，在普鲁兰酶的微生物发酵生产过程中，不论是野生菌还是工程菌，主要存在的问题就是胞外酶活较低，造成了普鲁兰酶的生产成本上升，形成エ业化生产的障碍。自诱导(auto-induction)是最早由纽约厄普顿的布鲁克黑文国家实验室的Studier等提出的ー种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法，即首先以葡萄糖为碳源支持大肠杆菌生长至饱和，待葡萄糖消耗殆尽，培养基中另ー种成分乳糖在Iac Y与lac Z的基因产物透过酶(lactose permease)和β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启T7表达系统的方法。乳糖除了作为诱导物之外，其代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖)也可作为细菌生长的碳源。与传统的IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导方法相比，在接种之后自诱导表达过程不需要对细胞的生长情况进行监测，从而減少了在培养过程中对培养物的处理，极大地方便了高通量筛选。而且，以价格低廉、无毒的乳糖替代价格高昂的IPTG可以大大地降低生产的成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。此外，针对重组蛋白的诱导分泌表达，采用双温度分阶段调控策略已成功用于葡萄糖基转移酶分泌 蛋白的活性表达，如先在37°C条件下培养增加菌体量，然后降低温度到25°C减缓重组蛋白的合成速率以促进其分泌至胞外。然而，目前自诱导培养基主要应用于核磁共振分析的同位素标记重组蛋白的表达，尚无将自诱导培养基用于重组普鲁兰酶发酵生产的报道。而且，将自诱导培养方式和双温度调控的联合策略用于重组普鲁兰酶发酵生产也鲜有报道。本发明将自诱导培养基和双温度调控方式成功应用于普鲁兰酶基因工程菌的培养和酶蛋白表达，与传统的LB培养基和IPTG诱导方法相比，胞外重组普鲁兰酶的发酵酶活从 11 U/mL 提升到 70 U/mL。
发明内容
( I)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是将普鲁兰酶基因在大肠杆菌中重组表达，而且利用自诱导培养基和双温度调控方式进ー步提高重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力和产量，从而开发新型重组普鲁兰酶的生产エ艺和应用价值。(2)技术方案
本发明首先将来源于黑座克雷伯氏菌(variicola) CCTCC NO M 2012108的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，在此基础上，将自诱导培养基和双温度调控方式用于重组菌的培养和重组普鲁兰酶的发酵生产。一、普鲁兰酶基因的获得
黑座克雷伯氏菌GWeZwieWa variicola ) CCTCC NO M 2012108培养基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨 15 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 · 7H20 O. I g/L，NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L, pH 6. 5。将黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108菌种接种于培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中，于37°C、200 rpm振荡培养72 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗漆两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VI0GENE 公司)提取基因组。合成引物I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，合成引物2 :5，_ CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’。引物 I 含有MeI 限制性酶切位点，引物2含有EcoRl限制性酶切位点。PCR 反应体系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因组 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。PCR 反应过程94°C 预变性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min，72°C 4 min，进行 30个循环；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。DNA溶液中加入1/10体积的こ酸钠溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍体积无水こ醇，-20°C沉淀I小时。12000 rpm于4°C离心30 min。加入75%こ醇500 μ L洗涤，12000
rpm于4°C离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或_20°C保存。ニ、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建 目的基因及质粒pET28a(+)的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET28a(+)。按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。反应体系组成10XHBuffer 4 μ L, DNA 10 μ L，NheI 2 μ L，EcoRI 2 μ L,ddH20将体系补足40 μし目的基因与质粒pET28a(+)的连接
将外源基因与质粒pET28a(+)连接，反应体系组成如下质粒pET28a(+) 0.8 yL，外源基因4. 2 μ L，Ligation Solution 5 μ L，ddH20将体系补足10 μし混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接12 h。利用限制性内切酶NheI和EcoRI对扩增得到的CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因与载体pET28a(+)进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a(+)-pul A ；
重组质粒转化大肠杆菌
在100 μ L大肠杆菌^: cWi BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42°C水浴中，热击90 S。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入700 μ L LB液体培养基，37°C 100 rpm摇床温育培养I h。培养后菌液3000rpm离心2 min,弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/pET28a (+)-pul A。
诱导表达培养
LB培养基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要时使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL),固体培养基添加I. 5%琼脂粉。挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C, 200 rpm振荡培养过夜。取I mL培养液转接于50 mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37で、200 rpm振荡培养至OD6tltl约为O. 6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度(Tl mmol/L，在培养温度3(T37°C下进行诱导培养12小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的測定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为11 U/mL。普鲁兰酶测定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH5. O醋酸缓冲中的10 g/L普鲁兰相混合于50で水浴中保温30分钟。加入DNS试剂300μ L摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出以流动流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以O. 5cm比色杯,测定反应液的吸光度值。酶活单位定义在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于Iμ mo I葡萄糖的还原糖所需的醒为I个酶活単位(U)。三、重组大肠杆菌的自诱导培养和双温度调控发酵产酶
自诱导培养基α-乳糖10 -20g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L,痕量元素溶液200 yL/L,用超纯水配置。痕量元素溶液
50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2Η20,10 μ M MnCl2 · 4Η20,10 μ M ZnSO4 · 7Η20, 2 μ MCoCl2 · 6Η20, 2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3, 2 μ M H3B4O7,用超纯水配置。将重组大肠杆菌^:coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的LB固体培养上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37°C，200 rpm振荡培养，随时监测培养基中0D_的变化情況。待OD6tltl达到2 3吋，按5% 10%接种量接种于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自诱导培养基中。将接种之后的自诱导培养基于37°C，200 rpm培养2 4小时后，将培养的温度降低到25°C继续培养48 72小吋。培养结束后，10000 rpm离心去除菌体，收集发酵上清液为普鲁兰酶的粗酶液。自诱导培养基成分及发酵条件的优化
分别考察了碳源、氮源及培养基添加物对工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA生 长及分泌重组普鲁兰酶的影响，最終确定了发酵生产胞外普鲁兰酶的优化自诱导培养基组成
α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨，10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 μ L/Lo分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对胞外酶活的影响，最終确定了工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA产酶的培养条件为起始ρΗ5· O，装液量10% 20%，培养温度为37°C先培养4小时后，再转入25°C培养56小吋。采用优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到6(Γ70U/mL ο(3)有益效果
成功克隆了黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因，该基因全长3309 bp，编码1102个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为SEQ IDNO :1，其氨基酸组成为SEQ ID NO :2。将黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因插入表达载体pET28a(+)中并转化入相应表达宿主万.coli BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株^: coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A。将自诱导培养基和双温度调控方式用于重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A的培养和普鲁兰酶的发酵产酶，优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到6(T70 U/mL。这些工作为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能カ和产量的提高提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产エ艺和应用价值具有重要意义。生物材料样品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏单位中国典型培养物保藏中心，简写CCTCCJii :中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO M2012108，保藏日期为2012年4月11日。
具体实施例方式实施例I
自诱导培养基α-乳糖10 g/L，葡萄糖0.5 g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo将重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37°C培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm摇床中震荡培养，至0D_达到2. (Γ3. O左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，于37°C培养60小时(此时OD6tltl达到15左右)，结束发酵。
通过此重组菌培养和发酵产酶エ艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到15 U/mL。实施例2
自诱导培养基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo将重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37°C培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm摇床中震荡培养，至OD_达到2. (Γ3. O左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，于25°C培养60小时(此时OD_达到15左右)，结束发酵。通过此重组菌培养和发酵产酶エ艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到35 U/mL。实施例3
自诱导培养基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo将重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37°C培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50mL LB培养基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm摇床中震荡培养，至0D_达到2. (Γ3. O左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有50 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm摇床中培养4小时后，再将摇床的温度调低到25°C继续培养56小时(此时OD6tltl达到15左右)，结束发酵。通过此重组菌培养和发酵产酶エ艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到50 U/mL。实施例4
自诱导培养基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4
O.24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L,Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液 200 μ L/L。将重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌种划线于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上于37°C培养箱中培养过夜。从平板上挑取单个菌落接种于装有50 mL LB培养基(50 μ g/ml卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm摇床中震荡培养，至0D_达到2. (Γ3. O左右。将此种子培养液以5%的接种量接种于装有25 mL上述自诱导培养基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm摇床中培养4小时后，再将摇床的温度调低到25°C继续培养56小时(此时OD6tltl达到15左右)，结束发酵。通过此重组菌培养和发酵产酶エ艺，发酵上清中胞外普鲁兰酶的酶活达到70 U/mL。
权利要求
1.一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于将重组大肠杆菌万.COli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A接种于自诱导培养基中，并采用双温度调控方式，即将接种之后的自诱导培养基于37°C、200 rpm培养2 4小时后，将培养的温度降低到25°C继续培养48 72小吋，培养结束后，收集发酵上清液获得胞外普鲁兰酶；步骤为 (I)将来源于黑座克雷伯氏菌OWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达 a、普鲁兰酶基因的获得 CCTCC NO M 2012108培养基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超纯水配制，pH 6. 5 ； CCTCC NO M 2012108菌种接种于培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中，于37°C、·200 rpm振荡培养72 h ;培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用VI0GENE 公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组DNA ； 黑座克雷伯氏菌OWeAsieWa variicolaXClCC NO M 2012108普鲁兰酶，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，其氨基酸组成为SEQ ID NO 2 ； 合成引物 I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，引物 I 含有 MeI限制性酶切位点； 合成引物 2:5’- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’，引物 2 含有^bo/PI限制性酶切位点； PCR 反应体系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5μ L,50 ρ θ1/μΙ^|_1:1 μ L, 50 pmol/yL 引物 2:1 μ L，基因组DNA 5 μ L, 5 U/ μ L ^Taq DNA polymerase 0. 5 μ L ； PCR 反应过程94°C 预变性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min,72°C 4 min，进行 30 个循环；72°C延伸 10 min ； 利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断 DNA溶液中加入1/10体积的3 mol/L、pH 5. 2的こ酸钠溶液和2倍体积无水こ醇，-20°C沉淀I小时；于4°C、12000 rpm离心30 min ;加入75%こ醇500 “し洗涤，于4で、·12000 rpm离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20°C保存； b、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建 将CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，重组质粒转化大肠杆菌万.coB BL21(DE3)感受态细胞，通过含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板筛选获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌万.coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A ;步骤为: 目的基因及质粒pET28a(+)的酶切 利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit,北京博大泰克生物基因技术有限公司提供，提取质粒pET28a(+)； 按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成10 X H Buffer 4 μ L,DNA 10 μ L,Nhel 2 μ L, EcoRl 2 μ L，ddH20 将体系补足40 μ L ; 目的基因与质粒pET28a(+)的连接 将CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，反应体系组成如下质粒 pET28a(+) O. 8 μ L,外源基因 4. 2 μ L, Ligation Solution 5 μ L ;混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接12 h ； 利用限制性内切酶NheI和EcoRI对扩增得到的CCTCC NO M 2012108普鲁兰酶编码基因与载体pET28a(+)进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a(+)-pul A ； 重组质粒转化大肠杆菌 在100 μ L大肠杆菌^: cWi BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min ;转入42°C水浴中，热击90 s ;快速转移至冰浴中，冷却2min;加入700 μ L LB液体培养基，37°C 100 rpm摇床温育培养I h;培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养；获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A ； (2)重组大肠杆菌的自诱导培养和双温度调控发酵产酶 自诱导培养基α-乳糖10-20 g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L，痕量元素溶液200 yL/L，用超纯水配制；痕量元素溶液含 50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2H20，10 μ M MnCl2 · 4Η20，10 μ MZnSO4 · 7Η20,2 μ M CoCl2 · 6Η20，2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3和2 μΜ H3B4O7，用超纯水配制； 产酶的培养条件为将重组大肠杆菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37°C、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD6tltl的变化情況，待OD6tltl达到2 3吋，按5% 10%接种量接种于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自诱导培养基中，将接种之后的自诱导培养基于37で、200 rpm培养2 4小时后，将培养的温度降低到25°C继续培养48 72小时，培养结束后，10000 rpm离心去除菌体，收集发酵上清液为普鲁兰酶的粗酶液。
2.根据权利要求I所述应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于发酵生产胞外普鲁兰酶的优化自诱导培养基组成为 α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 yL/L，用超纯水配制； 工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA产酶的优化培养条件为起始ρΗ5· 0 8· 0，装液量10% 20%，培养温度为37°C、200 rpm先培养4小时后，再转入25°C培养56小时； 采用优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活达到6(T70 U/mL。
全文摘要
一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明将黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108普鲁兰酶编码基因插入表达载体pET28a(+)中构建重组质粒，并转化大肠杆菌获得含有目的普鲁兰酶基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自诱导培养基，并采用先37℃培养2~4小时后25℃继续培养48~72小时的双温度调控方式，将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA进行培养和发酵产酶。采用优化后的自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70U/mL。本发明为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。
文档编号C12N15/56GK102676480SQ20121018706
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者徐岩, 聂尧, 陈文波 申请人:江南大学