一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法
【专利摘要】本发明公开了一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，该方法首先以澳洲坚果为供试材料，采集花蕾期为27～29 d的花蕾放入冰箱中冷藏一定时间后，用水冲洗处理后的花蕾，转入超净工作台，经酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗后放在灭菌滤纸上吸干表面水份后备用；然后，用接种针剥开花蕾上的萼片，纵向切开花蕾，去掉花丝，取出花药接于愈伤组织诱导培养基中暗培养；最后将得到的愈伤组织转入增殖培养基中增殖。通过本发明的方法获得的花药愈伤组织多、再分化力强，为澳洲坚果遗传转化、新品种选育及种苗繁育奠定基础。
【专利说明】
一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法
技术领域
[0001]本发明涉及澳洲坚果栽培技术领域，具体涉及澳洲坚果花药诱导愈伤组织的快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]澳洲坚果属于山龙眼科，是一种原产于澳洲的树生坚果，享有“干果之王”的美誉。澳洲坚果花为总状花序，成对或3、4朵为一组着生于小萼片腋的花梗上，花序长10?15厘米;花蕾较小，花被管长8?11毫米，直立，被短柔毛；花丝短，花药长约1.5毫米，药隔稍突出，短、钝。在澳洲坚果组织培养中，大部分试验利用澳洲坚果的成熟茎段进行组织培养，如澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法(申请号为201510868889.X )，该发明截取澳洲坚果的含芽茎段经消毒处理后接种在1/2MS+6-BA 0.2?0.4 mg/L+GA 0.2?0.3 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖25 8凡诱导培养基上。然后，将新长腋芽苗切下接于1/41^+6-840.1?2.0 mg/L+GA
0.5?1.0 mg/L+乙稀醇0.01?0.5 mg/L+鱼骨粉I.2?I.5 g/L+竹醋液22?26 mg/L+杜仲提取物0.5?0.7 g/L+卩引噪丁酸0.8?1.0 mg/L+α-萘乙酸3?6 mg/L+维生素B6 0.65?0.75mg/L+琼脂4 g/L+蔗糖25 g/L生根培养基上培养生根。然而，到目前为止本领域中尚未见利用花药进行澳洲坚果组织培养快速繁殖的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于解决利用澳洲坚果花药进行组织培养快速繁殖的关键技术问题，提供一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法。
[0004]本发明实现过程如下:
首先，本发明采用这样一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，它包括以下步骤:
O以澳洲坚果为供试材料，采集花蕾期为27?29 d的花蕾放在入4°C冰箱中冷藏备用；
2)用水冲洗步骤I)中花蕾，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)待步骤2)处理完成后，用接种针剥开花蕾萼片，纵向切开花蕾，去除花丝，取出花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养；
4)将步骤3)中获得的愈伤组织接于增殖培养基中增殖培养。
[0005]其次，本发明实施过程中的关键技术在于:
步骤I)中花蕾处理时间为24 ho
[0006]步骤2)中水冲洗时间至少I h，酒精消毒时间30 S，升汞浸泡时间10 min，无菌水冲洗四次以上，每次冲洗8 min。
[0007]步骤3)中花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养时间为20?27d;愈伤组织诱导培养基为MS +2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 2.0 mg/L + 蔗糖70 g/L + 琼脂7.0 g/L，pH5.8。
[0008]步骤4)中采用的增殖培养基为MS+ZT 0.05 mg/L +NAA 0.01 mg/L +IBA 0.05mg/L + 鹿糖30 g/L + 琼脂7.0 g/L，pH5.8。
[0009]本发明的有益效果:本发明是在离体条件下进行澳洲坚果愈伤组织的诱导。在本领域中，通过茎段获得的愈伤组织较少、且分化力弱，而通过本发明的方法获得的花药愈伤组织较多、再分化力强，为澳洲坚果的新品种选育及遗传转化开辟一条新的道路。
【具体实施方式】
[0010]为加深对本发明理解，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。在本发明基础上作出的修改或改进，若对本领域技术人员是显而易见的，则属于本发明要求保护的范围。以下内容中如涉及数量或比例，如无特别说明，均表示质量单位或质量比例。
[0011]实施例1:
该澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，采用澳洲坚果的花药为试验材料，通过适宜的预处理、消毒、接种及诱导，获得澳洲坚果愈伤组织。
[0012]步骤1、低温预处理:
选取澳洲坚果品种Own choiceC0.C)为供试材料，采取澳洲坚果花蕾带回后放在4°C冰箱中分别冷藏12 h，24 h和48 h，以未处理的花蕾为对照。
[0013]步骤2、外植体表面灭菌:
用少量洗洁精水将花蕾表面脏物洗净后，流水冲洗至少I h。转入超净工作台上，经75%的酒精和0.1%的升汞分别处理不同时间。花蕾酒精消毒时间设15、30和45 s三个水平，升汞消毒时间设定为8、10和12 min三个水平，完全组合设计，共9个处理。消毒完成后，用无菌水冲洗4次，每次冲洗时间为8 min。将外植体表面水分吸干，用接种针将花蕾纵剖，取出花药，去除花丝，接种在相同愈伤组织诱导培养基上。每处理接种25个花药，3次重复，30 d统计污染率、成活率及出愈率。
[0014]步骤3、花蕾不同发育期比较:
取不同发育期(花蕾发育23 d, 25 d, 27d, 29 d, 31 d)的澳洲坚果(0.C)花蕾，放入4°C冰箱中处理后，流水冲洗至少I h，表面灭菌以步骤2筛选出的方法进行。设5个处理，花药接种方法、接种培养基、统计方法均同步骤2。同时取不同发育时期的花蕾进行显微观察，筛选出的哪个发育期的小孢子处于单核靠边期。
[0015]步骤4、花药愈伤组织诱导培养基筛选:
将0.C花蕾处理后接种在MS附加不同浓度的2，4-D (0.1、0.5和1.0 mg/L) ,6-BA(1.0、2.0和3.0 mg/L)和蔗糖(30、50和70 g/L)完全组合设计，试验共计27个处理，每处理接种25个花药，3次重复，观察并记录愈伤组织的诱导情况及愈伤组织的质量，统计愈伤组织的诱导率。
[0016]步骤5、愈伤组织的继代与增殖:
将初代培养诱导出来的愈伤组织切割成约0.5 cmX0.5 cm大小，接种到愈伤组织增殖培养基中。生长调节剂ZT (0.01 mg/L、0.05 mg/L及0.1 mg/L)、ΝΑΑ(0.005 mg/L、0.01 mg/L及0.05 mg/L)、IBA (0.01 mg/L,0.05 mg/L及0.1 mg/L)完全组合设计，共计27个处理。每处理接种25个外植体，重复3次，30 d转瓶I次，观察并记录愈伤组织的生长状态，60 d统计愈伤组织增殖系数。
[0017]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以澳洲坚果为供试材料，采集花蕾期为27?29d的花蕾放入4°C冰箱中冷藏备用； 2)用水冲洗步骤I)中花蕾，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用； 3)待步骤2)处理完成后，用接种针剥开花蕾萼片，纵向切开花蕾，去除花丝，取出花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养； 4 )将步骤3 )中获得的愈伤组织接种于增殖培养基中增殖。2.根据权利要求1所述的澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于:步骤I)中花蕾处理时间为24 ho3.根据权利要求1所述的澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于:步骤2)中水冲洗时间至少I h，酒精消毒时间30 S，升汞浸泡时间10 min，无菌水冲洗四次以上，每次冲洗8 minο4.根据权利要求1所述的澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于:步骤3)中的愈伤组织诱导培养基为MS +2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 2.0 mg/L +蔗糖70 g/L +琼脂7.0 g/L，pH5.8ο5.根据权利要求1所述的澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于:步骤3)中花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养时间为20?27 do6.根据权利要求1所述的澳洲坚果花药诱导愈伤组织的方法，其特征在于:步骤4)中的愈伤组织增殖培养基为MS +ZT 0.05 mg/L +NAA 0.01 mg/L +IBA 0.05 mg/L + 蔗糖30 g/L+琼脂7.0 g/L，pH5.8。
【文档编号】A01H4/00GK106035077SQ201610358271
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】刘荣, 范建新, 刘红, 韩树全, 王代谷
【申请人】贵州省亚热带作物研究所