毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，具体地说涉及一种毛竹种胚诱导愈伤 组织形成的方法。
【背景技术】
[0002] 毛竹（Phyllostachys Pubescens)，别名楠竹、孟宗竹、江南竹，属于禾本科 (Gramineae)、竹亚科（Bambusoideae)、刚竹属（Phyllostachys)植物，多年生常绿散生竹 类植物，是中国的传统经营竹种，集材用、食用、观赏等众多用途于一体，并具固土防风作 用，广泛应用于建材、建筑、绿色食品、医疗保健、家具农具、日用品、旅游工艺品、文体文艺 器材及环境绿化美化等各个领域。
[0003] 全国有毛竹林约300万hm2,约占全国竹林总面积的65%。毛竹林是我国发展高 效林业、使农民迅速致富和增强地区财政发展的的重点扶持工程。传统的毛竹培育技术已 经严重制约了毛竹产业的发展，培育优良品质、经济和生态效益更高的毛竹新品种，对实现 竹材资源培育的可持续发展具有重大意义。现代生物技术为竹类的育种工作开辟了一条新 的途径，例如可以通过植物组织培养技术来进行高效无性繁殖，甚至还可以在竹子组织培 养的基础上开展基因工程育种的研宄。
[0004] 目前，近90%的竹子组织培养成功的报道是丛生竹种，以毛竹为代表的散生竹种 一直是组织培养的难点。关于毛竹组织培养的研宄，从已有的报道来看，用新发毛竹笋作为 外植体，褐化现象较严重。而且多受季节和植物发育时期的限制，取材困难。成熟种子相对 来说具有易保存、操作简单、不受季节和植物发育时期等因素限制的优点，研宄较为方便， 但是成熟种子愈伤组织诱导率低（低于50% )、污染率较高（高于30% )，成为毛竹培育技 术的瓶颈。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种诱导率高、污染率低的毛竹种胚诱导愈伤 组织形成的方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：毛竹种胚诱导愈伤组织形成 的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)种子的筛选
[0008] 取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活 力高于75%的毛竹种子；
[0009] (2)种胚的消毒
[0010] 取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50%以上的胚乳，用流水冲洗2- 4小时，然 后置于70- 75% (v/v)乙醇中浸泡2-4分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无 明显异物，然后于无菌条件下，置于1 一2% (v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡15-20分钟，再 用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有3-5 滴吐温-80的0. 05 - 0.1 % (w/v)升汞中浸泡振荡30- 40分钟，再去除表面水分备用； [0011] ⑶愈伤组织的诱导与增殖
[0012] 将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，暗培养7 -10天使愈伤组织形成，然后将 愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20- 30天即可。
[0013] 进一步的，所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加3 - 5mg/L的 2,4-D、0. 1-0· 3mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋 白，所述N6/B5/MS复合培养基包括1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、170mg/L的磷 酸二氢钾、370mg/L的七水合硫酸镁、440mg/L的二水合氯化钙、0· 75mg/L的碘化钾、3. Omg/ L的硼酸、10.0 mg/L的一水合硫酸锰、2. Omg/L的七水合硫酸锌、0. 25mg/L的二水合钼酸钠、 0. 025mg/L的六水合氯化钴、0. 025mg/L的五水合硫酸铜、37. 25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、 27. 85mg/L的七水合硫酸亚铁、0· lmg/L的盐酸硫胺素、0· 5mg/L的盐酸吡卩多醇、0· 5mg/L的 烟酸、2. Omg/L的甘氨酸、28g/L的蔗糖和8g/L的琼脂；
[0014] 所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加3 - 5mg/L的2,4-D、500mg/L的脯氨 酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
[0015] 本发明的有益效果为：
[0016] 1.本发明选取毛竹种子的种胚作为外植体，可以直接将毛竹种子的外种皮与内在 种胚之间的缝隙处藏纳的污垢、泥土和细菌等污染物，以及因啮齿类动物的咀嚼而残留的 细菌等去除，从而有效降低污染率。
[0017] 2.本发明切除了种胚的50%以上的胚乳（从种胚形态学上端开始切除），可以进 一步去除污染源（胚乳中含有大量污染菌），降低污染率，而且虽然切除了大部分胚乳，但 是本发明提供的诱导培养基完全能够提供种胚生长发育所必须的养分，不会影响种胚愈伤 组织的形成。
[0018] 3.本发明对种胚的消毒采取流水、次氯酸钠溶液、加有吐温-80的升汞进行反复 处理，可以有效清除种胚表面大部分的污染物，保证消毒效果，有效降低污染率。
[0019] 4.本发明的愈伤组织诱导率可以达到64. 3%，而污染率能控制在20%以下，并且 愈伤组织的形态优良，生长状态好。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：
[0021] 下述实施例中所使用的毛竹种子均为购买于云南昆明的当年生毛竹种子，购买后 于4°C的条件下遮光储存。
[0022] 实施例1
[0023] 毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
[0024] (1)种子的筛选
[0025] 取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活 力为80 %的毛竹种子；
[0026] (2)种胚的消毒
[0027] 取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除70%的胚乳，用流水冲洗2小时，然后置于 75% (v/v)乙醇中浸泡2分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后 于无菌条件下，置于2% (v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡15分钟，再用无菌水冲洗至表面光 滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有4滴吐温-80的0. 1 % (w/v) 升汞中浸泡振荡35分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
[0028] (3)愈伤组织的诱导与增殖
[0029] 将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱（25°C )中暗培养7天使愈 伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养25天即可；
[0030] 所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加4mg/L的2,4-D、0. 2mg/L 的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白；
[0031] 所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加4mg/L的2,4-D、500mg/L的脯氨酸、 500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
[0032] 实施例2
[0033] 毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
[0034] (1)种子的筛选
[0035] 取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活 力为85 %的毛竹种子；
[0036] (2)种胚的消毒
[0037] 取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50%的胚乳，用流水冲洗3小时，然后置于 70% (v/v)乙醇中浸泡4分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后 于无菌条件下，置于I. 5% (v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡18分钟，再用无菌水冲洗至表 面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有3滴吐温-80的0. 05% (w/v)升汞中浸泡振荡40分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
[0038] (3)愈伤组织的诱导与增殖
[0039] 将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱（25°C )中暗培养10天使 愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20天即可；
[0040] 所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加3mg/L的2,4-D、0. lmg/L 的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白；
[0041] 所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加5mg/L的2,4-D、500mg/L的脯氨酸、 500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
[0042] 实施例3
[0043] 毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
[0044] (1)种子的筛选
[0045] 取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活 力为90 %的毛竹种子；
[0046] (2)种胚的消毒
[0047] 取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除60%的胚乳，用流水冲洗4小时，然后置于 72% (v/v)乙醇中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后 于无菌条件下，置于1% (v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡20分钟，再用无菌水冲洗至表面光 滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有5滴吐温-80的0. 08% (w/ v)升汞中浸泡振荡30分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
[0048] (3)愈伤组织的诱导与增殖
[0049] 将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱（25°C )中暗培养8. 5天使 愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养30天即可。
[0050] 所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加5mg/L