一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。
【背景技术】
[0002]走马胎(Ari/isia gigantifolia Stapf)又名大叶紫金牛、走马风、豆收，为紫金牛科紫金牛属植物。全株药用，民间有“两脚行不开，不离走马胎”之说，具有活血化瘀、祛风湿、壮筋骨、止血生肌等功效，治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤、产后血瘀、痈疽溃疡等症。近年来，随着对走马胎化学成分和药理研究的不断深入，还含有显著的抗恶性肿瘤、抗血栓、抗炎、抗氧化等疗效的生物活性成分。走马胎的药用价值不断被挖掘，应用也越来越广，市场需求量不断增加。
[0003]走马胎为常绿小灌木，根茎粗壮，主要分布在广西、广东、江西等地，多生于海拔1300 m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮湿处。目前，走马胎药材主要来源于野生资源，需要生长三年以上，周期长，且产量不高。在走马胎野生分布区，药农长期的采而不种，造成野生自然资源过度采挖，使得走马胎分布点越来越少，资源日渐匮乏。
[0004]随着走马胎供需矛盾日益尖锐，人工栽培势在必行。然而苗木供应紧张制约了走马胎的人工栽培。目前，走马胎的繁殖方式为扦插繁殖和种子繁殖，都难以提供大量种苗。主要由于以下两方面的原因:扦插繁殖存在母本数量少和繁殖系数低等问题；而种子繁殖则存在野生资源分散、成熟时间不一致造成种子采集困难等问题，且种子萌芽需要的时间长。植物组织培养具有不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点，在植物种苗繁育上广泛应用。在走马胎组织培养研究过程中，由于走马胎为木本植物，取嫩芽为外植体时存在灭菌难等问题，而通过灭菌的种子在培养基上萌芽获得无菌植株，以其芽繁殖芽进行丛生芽诱导，存在增殖系数低、继代时间长等问题，造成培养成本高，严重阻碍了走马胎组培苗在人工栽培中的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，通过走马胎愈伤组织诱导、分化成芽来提高走马胎出芽数量，该方法操作简单、稳定高效，并能大大降低组培苗的培养成本。
[0006]实现本发明目的的技术方案是:
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，包括以下步骤:
(I)在超净工作台上，将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌I min，无菌水清洗I次，再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10 min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，接入MS培养基上培养30?50 d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35?45 d，诱导率为100% ；
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5g/L, pH 值为 5.8 ;
(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cmX0.2 cm小块，接入增殖培养基中培养30 d，增殖系数为3.7?6.2 ;
所述增殖培养基为:MS+2, 4-D0.5 ?2.0 mg/L+6-BA0.1 ?0.5 mg/L+TDZ0.5 ?2.0 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5 g/L, pH 值为 5.8 ;
(3)在超净工作台上，取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5 cmX0.5 cm小块，接入分化培养基中培养30 d，分化率为100%，分化系数为4.2?13.7 ;
所述分化培养基为:MS+ZT0.5 ?3.0 mg/L+IBA0.1 ?0.5 mg/L + TDZ0.5 ?2.0 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5 g/L, pH 值为 5.8 ;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30?40d，芽长到2?5 cm ；
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为
5.8 ；
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45?55d，得到走马胎组培苗；
所述生根培养基为 1/2MS+NAA2.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5 g/L, pH值为5.8。
[0007]所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3°C，光照时间为12 h/d，光照强度为2000 Lx0
[0008]所述培养基中，2，4-D为2，4- 二氯苯氧乙酸，6_BA为苄氨基嘌呤，TDZ为噻重氮苯基脲，ZT为玉米素，IBA为吲哚-3- 丁酸，NAA为a-萘乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。
[0009]所述培养基中附加TDZ对走马胎愈伤组织增殖和分化具有促进作用，在研究细胞分裂素(6-BA、KT、ZT)对走马胎愈伤组织分化影响试验中发现，ZT效果显著。
[0010]所述增殖系数为增殖后的体积与增殖前的体积的比值。
[0011]所述分化率是分化出芽的愈伤组织块数与总的愈伤组织块数比值；所述分化系数是愈伤组织分化出的芽数与愈伤组织块数的比值。
[0012]本发明走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株，以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导。愈伤组织为植物器官、组织脱分化的分生细胞经持续分裂增生成细胞团，是植物快繁的新手段。通过愈伤组织分化成芽的途径可以快速获得大量芽，从而弥补一些植物组织培养阶段的丛生芽增殖系数低的缺陷。
[0013]本发明的优点:采用本发明方法可以在愈伤组织分化阶段快速增加走马胎的芽数，可在短时间内获得大量走马胎组培苗，从而降低培养成本，节约能耗。而且本方法操作简单，生产成本低，可工厂化生产走马胎的种苗，为走马胎可持续利用和保护生态环境多样性奠定基础。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，包括以下步骤:
(I)在超净工作台上，将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌I min，无菌水清洗I次，再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10 min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，接入MS培养基上培养40 d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养40 d，诱导率为100% ；
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5g/L, pH 值为 5.8 ;
(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2 cmX0.2 cm小块，接入增殖培养基中培养30 d，增殖系数为3.7，愈伤组织为青色致密组织；
所述增殖培养基为:MS+2，4-D0.5 mg/L+6-BA0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 5 g/L, pH 值为 5.8 ;
(3)在超净工作台上，取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5 cmX0.5 cm小块，接入分化培养基中培养30 d，分化率为100%，分化系数为4.2，芽较壮，叶色翠绿；
所述分化培养基为:MS+ZT0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5g/L, pH 值为 5.8 ;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30d，芽长到2?5 cm；
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为
5.8 ；
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45d，得到走马胎组培苗；