一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抑制外植体褐变的领域，特别是一种木荷大树离体培养中抑制外 植体褐变的方法。
【背景技术】
[0002] 褐变现象是植物组织培养过程中常见的现象，制约了外植体的生长分化，有时会 决定组培的成败。褐变的发生与外植体的基因型、生理状态、大小、部位、伤害程度、培养基 及培养条件等关系紧密。外植体褐变是植物组织培养常见的现象，会影响培养效果，特别是 木本植物组织培养的一大难题。褐变是指在外植体培养过程中，由于多酚氧化酶的催化作 用，将酚类物质氧化为醌，醌很快聚合成为褐色素从而引起组织褐变，使外植体受到毒害。 木荷大树所含酚类等物质较多，在其离体培养过程中褐变现象严重，能否控制外植体褐变 成为其组织培养成功的关键，目前尚未有其抑制褐变技术的研究报道。
[0003]本发明提供的是一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法，它是通过外植 体预处理以及调节培养基的硬度、基本培养基的类型、及添加种类和浓度不同的褐变抑制 剂来抑制在木荷大树离体培养中外植体的褐变。采用这种抑制外植体褐变的方法后，可以 有效地抑制木荷大树离体培养中外植体的褐变，将其褐变对外植体的影响降到最低，保证 了外植体的生长分化，也保证了组织培养的成功。
【发明内容】
[0004] 为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：一种木荷大树离体培养中抑制 外植体褐变的方法，是由外植体经过简单的处理后，通过预处理、调节培养基的硬度、调节 基本培养基、及添加浓度不同的褐变抑制剂来抑制在木荷大树离体培养中外植体的褐变。
[0005] 为了可以有效的防止外植体的褐变，以消毒后用质量分数5%的PVP处理外植体， 可以抑制多酚氧化及吸附氧化物两种途径来减轻对外植体的毒害。
[0006] 为了可以有效防止外植体的褐变，通过调节培养基的硬度来抑制或者减轻外植体 的褐变，当选用硬度小时，褐变现象严重，当选用硬度过大时，前期不会发生褐变，后期褐变 现象严重，当加入8g/L琼脂对外植体的褐变的抑制或者减轻的效果最佳。
[0007] 为了可以有效防止外植体的褐变，采用改良1/2MS作为基本培养基可以在一定程 度上降低褐变率。
[0008] 为了可以有效防止外植体的褐变，可以添加2000mg/L的PVP。
[0009]预处理方法：将外植体采回后流水冲洗2h以后沥干，放在超净工作台上用70%的 酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，0. 1 %升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸 吸干水分。
[0010] 通过采用上述技术方案，本发明设计的一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变 的方法，可以将采用不同方法的预处理的外植体，通过改变其培养基的硬度、采用不同的培 养基、和添加不同浓度的褐变抑制剂等方法来抑制木荷大树离体培养中外植体的褐变，将 其褐变对外植体的影响降到最低，保证了外植体的生长分化，也保证了组织培养的成功。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1
[0012] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡0. 5h，将浸泡后外植体 采回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70%的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入MS培养 基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L，PVP 2000mg/L〇
[0013] 实施例2
[0014] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入MS培养 基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L，PVP 2000mg/L〇
[0015] 实施例3
[0016] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡2h，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入MS培养 基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L，PVP 2000mg/L〇
[0017] 各种预处理方法能在一定程度上减轻外植体的褐变程度，其中以消毒后用质量分 数5%的PVP浸泡处理1小时的效果最好，接种后观察发现，外植体褐变程度较轻，颜色为青 绿色。
[0018] 表1不同预处理方法
[0023] 实施例4
[0024] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入1/2MS 培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L， PVP2000mg/L〇
[0025] 基本培养基类型对外植体褐变有明显影响。在试验的2种培养基中，以改良1/2MS 的效果最好，第20天观察时褐变率为32%，MS的效果较差，第20天的褐变率为64%。这 与无机盐浓度有关，低浓度的盐能抑制酚类物质的大量外渗，减少醌类物质的合成，从而减 轻外植体的褐变。
[0026] 实施例5
[0027] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入1/2MS 培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂6g/L， PVP2000mg/L〇
[0028] 实施例6
[0029] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入1/2MS 培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂6g/L， PVP2000mg/L〇
[0030] 表3不同硬度培养基对外植体褐变的影响
[0031]
[0032] 培养基的硬度对外植体褐变的影响较大。使用6g/L的琼脂，培养基硬度小，芽体 容易在培养基中倒伏，接种第10天进行观察，褐化程度较大，芽体生长受阻，培养基变褐， 当培养到第20天时，褐变率达92%。在适当加大培养基硬度时，褐变程度减轻，但培养基硬 度过大时，由表2中显示加入10g/L琼脂，接种IOd进行观察，基本不发生褐变或褐变程度 很轻，只有在外植体切口有少量褐色物质，当接种20d时褐变率则为93%。本试验结果表 明，以加入8g/L琼脂的防止褐变的相对效果最好。
[0033] 实施例7
[0034] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入1/2MS 培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L， PVP500mg/L〇
[0035] 实施例8
[0036] 将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡lh，将浸泡后外植体采 回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70 %的酒精消毒30S，无菌水冲洗3次，再用 〇. 1 %的升汞灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体放入1/2MS 培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA0.Img/L，6-BA2.0mg/L，蔗糖30g，琼脂8g/L， PVP4000mg/L。
[0037] 表4不同浓度的吸附剂对外植体褐变的影响
[0038]
[0039] PVP是酚类物质的专一吸附剂，能够有效地吸收有害物质，从而降低了褐变程度， 外植体长势较好，其中以2000mg/L的PVP效果最好，观察发现，外植体颜色青绿色，芽体粗 壮。
[0040] 褐变现象是植物组织培养过程中常见的现象，制约了外植体的生长分化，有时会 决定组培成败的主要因素。褐变的发生与外植体的基因型、生理状态、大小、部位、伤害程 度、培养基及培养条件等关系紧密。本试验结果表明，选择适宜硬度的培养基能够在一定程 度上减轻外植体的褐变，以加入8g/L的琼脂效果最好。实验发现硬度小时，褐变现象严重， 这因为培养基较稀时，酚类、醌类物质容易渗入到培养基中，使培养基变色，同时与它接触 的外植体也变为褐色；然而，硬度过大时，虽然前期基本不发生褐变，但后期褐变现象严重， 因为培养基硬度大时，在培养初期限制了有毒物质外渗的量，但由于硬度过大，不利于有毒 物质的扩散，导致培养后期褐变率仍然很高。使用改良1/2MS基本培养基可以在一定程度 上降低褐变率，但到培养后期时由于低盐导致外植体生长不良，所以采用改良1/2MS作为 基本培养基效果最好。
[0041] 尽管上述实施例已对本发明的技术方案进行了详细地描述，但是本发明的技术方 案并不限于以上实施例，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所 做的任何改动都将落入本发明的权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法，其特征在于： 步骤（1)将木荷大树离体培养中的外植体消毒前用5%的PVP浸泡0. 5h-2h ; 步骤（2)浸泡后外植体采回后流水冲洗2h后沥干，于超净工作台上用70%的酒精消 毒30S，无菌水冲洗3次，再用0. 1 %的升萊灭菌6~8min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸 干水分； 步骤（3)将外植体放入MS或改良1/2MS培养基中进行培养，且在培养基中添加NAA 0.1mg/L，6-BA 2.0mg/L，蔗糖 30g，琼脂 6-10g/L，PVP 500-2000mg/L。2. 根据权利要求1所述的一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法，其特征在 于：步骤1中的消毒前用5%的PVP浸泡1小时。3. 根据权利要求1所述的一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法，其特征在 于：步骤3中的培养基选用采用改良1/2MS作为基本培养基。4. 根据权利要求3所述的一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法，其特征在 于：步骤 3 中 NAA 0? lmg/L，6-BA 2. Omg/L，蔗糖 30g，琼脂 8g/L，PVP 2000mg/L。
【专利摘要】本发明涉及一种抑制外植体褐变的领域，特别是一种木荷大树离体培养中抑制外植体褐变的方法。它是通过外植体预处理以及调节培养基的硬度、基本培养基的类型、及添加种类和浓度不同的褐变抑制剂来抑制在木荷大树离体培养中外植体的褐变。采用这种抑制外植体褐变的方法后，可以有效地抑制木荷大树离体培养中外植体的褐变，将其褐变对外植体的影响降到最低，保证了外植体的生长分化，也保证了组织培养的成功。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105028198
【申请号】CN201510394239
【发明人】蒋泽平
【申请人】江苏省林业科学研究院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月7日