一种海南石斛组织培养繁育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种海南石斛组织培养繁育方法。
【背景技术】
[0002]海南石斛(Dendrobium hainanense Rolfe)，为兰科石斛属多年生植物，生于海拔1000-1700米的山地阔叶林中树干上。分布于中国香港和海南、越南、泰国，具有较高的园艺价值。
[0003]目前海南石斛已经有人工栽培，主要通过分株繁育或扦插方式繁殖，但所需时间很长，繁殖倍率低，生产上难以实现大面积栽培。虽然海南石斛也有种子，但种子不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌共生下，才能促进种子萌发生长，且发芽率非常低，通过种子繁育也无法满足生产需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种海南石斛组织培养繁育方法，能够有效快速地提高海南石斛种苗的繁殖速度和质量，实现海南石斛优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
[0005]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种海南石斛组织培养繁育方法，包括以下步骤:
[0006](I)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0007](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(I)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ;
[0008](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加2.0-4.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、
2.0-4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0009]本发明的突出优点在于:
[0010](I)采用生物技术对海南石斛进行组织培养快速繁殖，通过海南石斛丛生芽的繁殖，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的海南石斛幼苗，保障海南石斛种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
[0011](2)采用本发明所述的培养方法得到的海南石斛丛生芽增殖系数达到15-20倍， 丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0013]实施例1
[0014]本发明所述的海南石斛的组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0015](I)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0016](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(I)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ;
[0017](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、2.0mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为15.5。
[0018]实施例2
[0019]本发明所述的海南石斛的组织培养快速繁殖方法的另一个实例，包括以下步骤:
[0020](I)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0021](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ;
[0022](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加4.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、4.0mg/L的萘乙酸NAA、0.lmg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为18.7。
[0023]实施例3
[0024]本发明所述的海南石斛的组织培养快速繁殖方法的再一个实例，包括以下步骤:
[0025](I)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0026](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ;
[0027](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、3.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为22.5。
[0028]实施例4
[0029]本发明所述的海南石斛的组织培养快速繁殖方法的又一个实例，包括以下步骤:
[0030](I)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0031](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ;
[0032](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加3.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、2.5mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为20.8。
【主权项】
1.一种海南石斛组织培养繁育方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)外植体的选择与消毒:取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2% (v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1% (v/v)升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水； (2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(I)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS培养基中添加2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8 ; (3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养.90天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中添加2.0-4.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、.2.0-4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
【专利摘要】一种海南石斛组织培养繁育方法，包括如下步骤：(1)取海南石斛健康植株新萌发的嫩芽作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽。采用本发明所述的培养方法得到的海南石斛丛生芽增殖系数达到15-20倍，能够在短时间内提供成活率高的海南石斛优质种苗，有效解决海南石斛的规模化育苗问题。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105028206
【申请号】CN201510518073
【发明人】韦坤华, 彭玉德, 刘凡, 吕惠珍, 李林轩, 缪剑华, 李翠, 王晓峰
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月21日