一种喇叭唇石斛的无激素组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业技术领域，具体涉及一种喇叭唇石斛的无激素组织培养方法。
【背景技术】
[0002]喇卩Λ唇石斛(Dendrobium lituiflorum)为兰科石斛属多年生草本植物,石斛是传统名贵中药材，在《神农本草经》、《本草纲目》等古书中均有记载，现已证实它具有滋阴清胃、生津益胃、止咳润肺、润喉明目、提高人体免疫功能、防治肿瘤及心血管疾病、改善睡眠等功效。喇叭唇石斛加工成的枫斗味甘、柔韧、黏性强，被视为仅次于铁皮枫斗的药材珍品。近年来，随着人们的大量采挖，加之生长条件和分布的局限，野生石斛资源处于极度濒危状态，为保护野生石斛资源、持续发展石斛产业，国家鼓励开展石斛快繁技术研究，推广人工种植优质石斛品种。
[0003]喇叭唇石斛种子极小，无胚乳，自然条件下很难萌发，而传统的分株、扦插等方式繁殖率低。但是通过组培技术，种子可在无菌条件下进行萌发，经过原球茎阶段形成植株，由于每个石斛蒴果内都含有大量的种粉，此技术可在短时间内培育出大量优质石斛种苗，满足快繁的需要。喇叭唇石斛组织培养技术的研究推广可有效挽救濒危的野生石斛资源，对石斛种质资源的保存具有重要意义。
[0004]关于喇叭唇石斛的组织培养也有相关报道，2004年，常俊等人在《中国中药》上发表了 “喇叭唇石斛组织培养的研究”，但在组织培养的过程中添加了一定的激素，激素的长期使用容易导致组培苗发生变异、优良性状退化等，严重扰乱了植物的自然生长规律，作为药用植物来讲，外源激素的使用不利于人的健康，而产品质量安全目前已成为人们在选购产品前最关心的问题，所以激素的使用在一定程度上制约着石斛产业的发展。本发明使用的方法不添加任何激素，用土豆泥、香蕉泥、西瓜汁等添加物代替激素作用，并减少继代次数，缩短了培养周期，既能满足市场种苗需求，又保障了石斛产品质量，降低了组培生产成本。
【发明内容】
[0005]本发明是针对目前石斛组培过程中普遍使用各种激素的问题提供一种绿色、环保、安全、简单便捷的喇叭唇石斛的无激素组织培养方法。该方法操作简单，成本低廉，较好地解决了目前石斛组织培养过程中成本高、激素使用过量等问题，既可满足市场种苗需求，又能有效保障石斛产品质量。
[0006]喇叭唇石斛的无激素组织培养方法，具体包括以下步骤:
[0007](1)种子的无菌萌发
[0008]将成熟未开裂的喇叭唇石斛蒴果经消毒处理，种子均匀播入3/4MS培养基+ 土豆泥40?70g/L培养基中，培养条件:培养温度23?26°C，先暗培养7?12d，再光照培养，每天光照10h，光照强度1500?30001x ；
[0009](2)原球茎的增值分化
[0010]将绿色原球茎转入3/4MS培养基+ 土豆泥100?120g/L+香蕉泥20?40g/L培养基中培养，培养条件:培养温度23?26°C，每天光照10h，光照强度1500?30001x ；
[0011](3)无菌苗的生根壮苗培养
[0012]将原球茎分化出的2?3cm的幼苗转入1/2MS培养基+ 土豆泥80?100g/L+香蕉泥20?30g/L+西瓜汁20?30g/L+活性炭0.4g/L培养基中培养，培养条件:培养温度25?28°C，每天光照10h，光照强度2000?30001x ；
[0013](4)无菌苗的炼苗及移栽
[0014]炼苗:当瓶内80%以上的苗长至株高5?8cm，有5?8条3cm以上的粗壮根时可进行出瓶，方法是将可以出瓶的瓶苗从培养室内移置遮光率为70%?85%的温室大棚内，放置20d，之后再打开瓶盖继续放置7d，棚内要保持通风透气，控制好光照，使瓶苗逐渐接受自然光，适应自然环境；
[0015]移栽:移栽时将苗从瓶内取出，用自来水将附在根上的培养基清洗干净，然后放进稀释2000倍的多菌灵、百菌清等杀菌剂溶液中消毒3?5min，捞起放在透气塑料筐上晾干水分，按3株/丛，株行距5cmX5cm移栽到铺好基质的苗床上,基质选用透气的椰壳+水苔，栽后注意保持环境通风、遮阳，苗床上无积水，湿度保持在75%?85%之间，待苗抽出新芽、新叶、新根后即可移栽大田；
[0016]以上培养基PH值均为5.8?6.0，白糖25g/L，琼脂4.8g/L，土豆泥为新鲜土豆去皮切丝煮20min后用果汁机打碎成泥，香蕉泥为新鲜香蕉去皮煮20min用果汁机打碎成泥，西瓜汁为新鲜西瓜削去青色外皮把白色的皮和瓤一起煮20min后用果汁机打成汁。
[0017]目前在石斛组织培养过程中普遍使用激素，而激素的使用会给生产带来许多问题，如生产成本高、产品质量存在隐患等。本发明在组织培养过程中不添加任何激素，采用天然附加物(新鲜的香蕉、土豆、西瓜)代替激素的使用，在不同培养阶段，通过调节添加物的使用量和比例提供给种苗充足的营养物质，快速繁殖喇叭唇石斛优质种苗。该方法对喇叭唇石斛在组织培养的各个阶段的正常生长没有影响，与常规种苗组培快繁相比，生产成本降低了 25 %，污染率降低了 4 %，生长周期缩短了 70?80d，移栽成活率提高到95 %以上，环保、安全、放心，符合目前绿色农业的发展需求，能促进石斛产业健康快速发展。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实例来进一步说明本发明的实质性内容。
[0019]实施例1:
[0020]喇叭唇石斛的无激素组织培养
[0021](1)采自云南省德宏热带农业科学研究所石斛种质资源圃成熟未开裂的喇叭唇石斛蒴果，常规消毒后，将种子均匀地播在3/4MS培养基+ 土豆泥50g/L培养基上，培养条件:培养温度23?26°C，先暗培养7d，再光照培养，每天光照10h，光照强度1500?30001x。
[0022]在上述培养过程中，种子培养18d后慢慢转绿，30d后种胚开始膨大，逐渐形成绿色的原球茎，之后原球茎不断增加，重叠堆积在培养基上。
[0023](2)将绿色原球茎转入3/4MS培养基+ 土豆泥100g/L+香蕉泥20g/L培养基中培养，培养条件:培养温度23?26°C，每天光照10h，光照强度1500?30001x。
[0024]在上述条件培养中，原球茎不断增值、分化，20d后开始有分化苗出现，50d后，80%以上的分化苗长成2?3cm的幼苗，叶片大于2片，颜色正常，开始有微量根系长出，根长 0 ?0.5cm。
[0025](3)将原球茎分化出的2cm以上的幼苗转入1/2MS培养基+ 土豆泥80g/L+香蕉泥20g/L+西瓜汁20g/L+活性炭0.4g/L培养基中培养，苗间距为1.5?2cm，2株/丛，培养条件:培养温度25?28°C，每天光照10h，光照强度2000?30001x。
[0026]上述条件培养60d后，85%以上的幼苗生成5cm以上的大苗，且叶色浓绿，根系发达，有5?8条长3cm以上粗壮根。
[0027](4)无菌苗的炼苗及移栽
[0028]炼苗:当瓶内80%以上的苗长至株高5?8cm，有5?8条长3cm以上粗壮根时可进行出瓶，方法是将可以出瓶的瓶苗从培养室内移置遮光率为70%?85%的温室大棚内，放置20d，之后再打开瓶盖继续放置7d，棚内要保持通风透气，控制好光照，使瓶苗逐渐接受自然光，适应自然环境。
[0029]移栽:移栽时将苗从瓶内取出，用自来水将附在根上的培养基清洗干净，然后放进稀释2000倍的多菌灵、百菌清等杀菌剂溶液中消毒5min，捞起放在透气塑料筐上晾干水分，按3株/丛，株行距5cmX 5cm移栽到铺好基质的苗床上,基质选用透气的椰壳+水苔，栽后注意保持环境通风、遮阳，苗床上无积水，湿度保持在75%?85%之间，