专利名称：：提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法
技术领域：
：本发明涉及提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的新方法，特别是涉及外植体的处理方法。技术背景草坪草(turfgrass)是指构成草坪植被的草本植物，主要包括禾本科和少数几种莎草科植物以及一些符合草坪草特性的其它植物，目前约有40种草评草用于草坪建植。草坪草具有保持水土、改造自然、美化环境等功能。除城市林网及园林景观，草坪是城市面积最大的绿色生命之源。为了满足多种多样草坪草的需求，草坪草的改良已有50多年的发展历史。草坪草的性状改良目前主要还是采用传统的育种技术，存在比较费时、费力、困难大的明显弱点，已经不能满足草坪发展的需要。而运用植物遗传工程技术可极大縮短育种年限，加快育种进程，且更有目的地获得具有更理想性状的新品种。胚性愈伤组织的诱导是进行遗传工程改良植物性状的前提和基础。首先，胚性愈伤组织可以在物理或化学方法的诱导下产生体细胞的变异，通过分化再生得到变异改良的植株。其次，在所有的外源基因受体系统中，胚性愈伤组织受体系统一直以其数量多，易再生，稳定性好而成为首选；胚性愈伤组织成为外源优良目的基因的受体，在外源基因转体后分化再生得到转基因植株。因此，提高胚性愈伤组织的诱导率，并在此基础上，建立高频胚性愈伤组织诱导、再生体系显得尤为重要。
发明内容本发明的目的旨在提供一种为草坪草高频胚性愈伤组织再生体系的建立提供基础的，可提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法。本发明的目的是通过下述方式实现的1)将成熟种子无胚的一端切除，以胚端的半粒种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织；所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)将材料放置于25土2。C，黑暗培养；每隔20天左右更换一次诱导培养基；25土2。C，黑暗培养；所述新鲜培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2,4-二氯苯氧乙酸；3)待愈伤组织长到直径为2至5國大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基上进行继代培养，每隔20天左右更换一次继代培养基25土2。C，黑暗培养至出愈数不再增加。所述的消毒处理是将成熟胚经75%酒精消毒1min后，再用0.1%升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗45次，晾干。所述愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-8mg/1。所述愈伤组织诱导培养基中还含有浓度为300mg/l的水解酪蛋白和500mg/i的脯氨酸，或者含有浓度为25g/l的甘露糖。愈伤组织色泽鲜黄颗粒状为好。自从运用植物遗传工程技术对草坪草品质进行改良以来，有关其胚性愈伤组织再生体系的建立、转化受体系统的建立都有了十分广泛的研究。但在一些种的草坪草中，一直存在胚性愈伤组织诱导率低的问题，而且，就将成熟种子无胚的一端切除，提高胚性愈伤组织诱导率还未见报道。本发明具体实施过程为1.将成熟种子无胚的一端切除，以胚端的半粒种子为外植体，经75X酒精消毒lm[n后，再用O.P/。升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗4至5次，晾干后接种在诱导培养基上；诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D，每隔20天左右更换一次新鲜诱导培养基；2.待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜继代培养基。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在25土2'C左右。3.自接种后，每天观察材料，每三天作一次纪录，纪录内容包括愈伤组织最初出愈时间、出愈数目、愈伤组织色泽和形态；25土2'C，黑暗培养至出愈数不再增加，最后记录每三角瓶中愈伤组织出愈数。愈伤组织诱导率=(诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数)X100%在上述过程中用到的水解酪蛋白的浓度为300mg/l;脯氨酸的浓度为500mg/l;甘露糖的浓度为25g/l;2，4-D的浓度为2至8mg/1。具体实施方式实施例1、提高草地早熟禾的胚性愈伤组织诱导率的新方法(l)从草地早熟禾优异、巴林、肯塔基三个品种中，挑选饱满、成熟的种子分成两部分，一部分不做任何处理设为对照组，一部分将无胚的一端切除设为试验组。分别以完整种子和胚端的半粒种子为外植体，经75%酒精消毒1min后，再用0.1%升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗4至5次，晾干后分别接种在诱导培养基上，每三角瓶中接种25个外植体，每种外植体接种10-12瓶。诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D，每隔20天左右更换一次新鲜培养基。(2)待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基(与诱导培养基相同)上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜培养基。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在25土2'C。(3)自接种后，每天观察材料，每三天作一次纪录，纪录内容包括愈伤组织最初出愈时间、出愈数目、愈伤组织色泽和形态；25土2'C，黑暗培养至出愈数不再增加，最后分别记录对照组和试验组每三角瓶中愈伤组织出愈数。实验结果表明与对照材料比较，经过处理的种子出愈时间縮短了IO天左右，诱导率由39.29%上升为78.7%。通过方差分析，其诱导率差异极显著(表l)。表1去除胚乳对愈伤组织诱导的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2、提高高羊茅的胚性愈伤组织诱导率的新方法(1)从高羊茅猎狗五号、沸浪、交战二号肯塔基三个品种中，挑选饱满、成熟的种子分成两部分，一部分不做任何处理设为对照组，一部分将无胚的一端切除设为试验组。分别以完整种子和胚端的半粒种子为外植体，经75%酒精消毒1min后，再用0.1%升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗4至5次，晾干后分别接种在诱导培养基上，每三角瓶中接种25个外植体，每种外植体接种8瓶。诱导培养基是在MS基本培养基基础上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D，每隔20天左右更换一次新鲜培养基。(2)待愈伤组织长到直径为2至5國大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基(与诱导培养基相同)上进行继代培养，每隔20天左右更换一次新鲜培养基。继代培养基的成份与诱导培养基相同。愈伤组织的诱导与继代培养在黑暗条件下进行，全部培养过程的温度都控制在25t2°C。(3)自接种后，每天观察材料，每三天作一次纪录，纪录内容包括愈伤组织最初出愈时间、出愈数目、愈伤组织色泽和形态；25土2'C,黑暗培养至出愈数不再增加，最后分别记录对照组和试验组每三角瓶中愈伤组织出愈数。实验结果表明与对照材料比较，经过处理的种子出愈时间縮短了IO天左右，平均诱导率由52%上升为69.17%。通过方差分析，其诱导率差异极显著(表1-8)。表1-8去除胚乳对愈伤组织诱导的影响Table1—8Effectsofexcisingendospermforcallus，inductiviry品种Variety处理方式Treatmentmethod接种数Plantednumbers出愈数Callusnumbers出愈率nP-valuePercentageofcallus猎狗五号HuntdogV沸浪Finelawn交战二号CrossfireII胚端半粒种子Excisingendosperm完整种子Reservingendosperm胚端半粒种子Excisingendosperm完整种子Reservingendosperm胚端半粒种子Excisingendosperm完整种子Reservingendosperm10010080100100100745746387661745757.53876610.0016150.0005430.016298权利要求1.提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)将成熟种子无胚的一端切除，以胚端的半粒种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织；所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)将材料放置于25±2℃，黑暗培养；每隔20天左右更换一次诱导培养基；25±2℃，黑暗培养；3)待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基上进行继代培养，每隔20天左右更换一次继代培养基25±2℃，黑暗培养至出愈数不再增加。2.根据权利要求1提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于，所述继代培养基的成份与诱导培养基相同。3.根据权利要求1所述的提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于所述成熟胚经75。/。酒精消毒lmin后，再用0.1%升汞消毒15min，然后用无菌水冲洗45次，晾干后接种在诱导培养基上。4.根据权利要求1所述的提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-8mg/1。5.根据权利要求1或2所述的提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基中还含有浓度为300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有浓度为25g/l的甘露糖。6.根据权利要求1所述的提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于愈伤组织色泽鲜黄颗粒状为好。全文摘要提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法，该方法包括以下步骤将成熟种子无胚的一端切除，以胚端的半粒种子为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织；所述诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；将材料放置于25±2℃，黑暗培养；每隔20天左右更换一次诱导培养基；25±2℃，黑暗培养；待愈伤组织长到直径为2至5mm大小时，及时将颖壳及胚芽切除，将愈伤组织转移到继代培养基上进行继代培养，每隔20天左右更换一次继代培养基25±2℃，黑暗培养至出愈数不再增加。本发明解决了草坪草组织培养过程中的一个关键问题，即如何提高草坪草胚性愈伤组织诱导率。本发明为草坪草高频胚性愈伤组织再生体系的建立提供了基础，具有重要的理论及实践意义。文档编号A01H4/00GK101147467SQ200710035928公开日2008年3月26日申请日期2007年10月18日优先权日2007年10月18日发明者易自力,辛艾,蒋建雄,覃静萍,陈智勇申请人:湖南农业大学