专利名称：橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种植物遗传转化方法，具体涉及一种以橡胶树体
细胞子叶胚切片胚性愈伤组织为转化受体材料的橡胶树高效遗传转化方法。
背景技术：
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg)是四大工业原料之一的天然橡胶 的主要来源，同时又是能源植物，天然橡胶的化学成分橡胶烃经过生物改良，可作为化石能 源的替代品。橡胶树是多年生、异花授粉植物，常规育种周期长，一般30a，同时橡胶树种内 基因狭窄，杂交育种难以有大的突破。因此基因工程育种成为橡胶树生物技术研究、品种改 良的核心内容，通过转基因技术可定向改良性状，弥补常规育种中的不足，大大縮短育种周 期，节省人力、物力。橡胶树的遗传转化具有重要的意义一是改良天然橡胶树性能，提高其 胶乳的产量、抗风性、抗寒性、抗病性等多种性状，并通过转基因途径可使育种周期大大縮 短。二是橡胶树具有特殊的乳管系统，通过割胶可获得大量的胶乳，橡胶树可作为一种天然 生物反应器，使其表达具有高价值的外源蛋白质。 1991年Arokiaraj等首次通过农杆菌接种橡胶皮下组织并得到含有由农杆菌诱 导形成的章鱼碱，肿瘤的形成包含了质粒的转移，并表明质粒携带的控制某些代谢物(如 冠瘿碱、植物激素合成)的基因在肿瘤细胞中得到表达，这是最早关于橡胶树基因工程的 报道。之后，1994-1998年Arokiaraj等应用基因枪法和农杆菌介导法，都成功地将P _葡 糖苷酸酶(GUS)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入橡胶中(GL 1 clone)，在增殖培养 的第3代无性系中仍正常表达，表现出高度的稳定性，而这正是转基因植物所需具备的一 个重要特征，初步建立了橡胶树的遗传转化体系，从此利用脱分化愈伤组织为转化受体，以 及利用NPT II为筛选基因进行转化成了巴西橡胶树转化的基本方法，但是转化效率极低。 2000年法国国际农业研究与发展中心的Montoro等利用继代的易碎内珠被愈伤组织和NPT II筛选基因，研究了钙在橡胶树(PB 260 clone)农杆菌转化中的作用，但并没有得到转基 因植株。2000年李维国以花药脱分化愈伤为受体，NPT II为筛选基因，将木薯SOD基因导 入橡胶，并得到转基因胚状体(海垦2clone)。 2003年印度橡胶研究所的Jayashree等以 花药脱分化愈伤组织为受体，利用农杆菌介导法将GUS基因、SOD基因、NPT II筛选基因成 功转入橡胶树中(RRII 105clone)，并在转基因后代中稳定表达。2006年Montoro等通过 橡胶树内珠被易碎愈伤组织，并进行悬浮培养，并利用农杆菌介导法将GUS基因和NPT II 筛选基因转入橡胶树(PB260clone)，得到转基因植株，但转化过程中有大量玻璃化苗产生， 相关组培技术还不完善。2006年陈雄庭等用基因枪轰击橡胶花药脱分化愈伤组织进行转 化实验，将GUS基因、NPT 1I基因、GAI矮化基因导入巴西橡胶树(海垦2clone)，对基因枪 转化橡胶树愈伤组织的方法进行了探索，并初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中， 但橡胶愈伤组织经过基因枪轰击后，褐化程度比较严重，胚状体再生率和出苗率都比较低。 2007年赵辉等通过橡胶花药培养得到大量易碎的胚性愈伤组织，并进行长期继代增殖和植 株再生体系研究，并将该再生体系应用于农杆菌转化，通过农杆菌介导法将新疆小拟南芥
3抗冻调节基因CBF及其下游功能基因C0R15a，以及NPT II基因转入橡胶组织中，得到大量 转基因胚状体(热研7-33-97clone)。 大量橡胶基因转化实验证明，转化受体及相应的再生体系是转化成功的关键因 素。在橡胶树的转化再生体系中，花药和内珠被培养是巴西橡胶树组织培养中研究较早和 较多的方向，其基本过程是1)拨取橡胶处于单核晚期的雄花花药或切取幼嫩橡胶树种子 的内珠被进行脱分化培养，约30 60天；2)将形成的脱分化愈伤转入橡胶胚诱导培养基， 进行胚诱导培养过程，约3 4个月；3)经胚诱导过程后，会从部分脱分化愈伤上形成胚性 愈伤，胚性愈伤经进一步发育会逐步形成棒状、心形、鱼雷形胚(以上为成熟胚)等，这些都 是胚性组织；4)将成熟胚依次转入芽诱导和根诱导培养基内进行芽和根的培养，当长到适 宜高度后再转入自然环境锻炼和定植。迄今，我国花药和内珠被植株的大田栽培面积已有 近千亩，与传统的芽接苗相比，花药和内珠被植株植株具有生长速度快、干胶产量高、抗逆 性强的特点，未来可能成为主要的种植材料。目前，花药和内珠被植株培养中存在的主要问 题是外植体取材受橡胶开花和结果时间的限制，脱分化愈伤成胚率低且难以长期继代保 存，因而植株再生频率低，生产成本高，后期靠体胚植株茎段微繁技术也很难满足生产中对 组培苗的大量需求和建立高效遗传转化体系等生物技术实验的需要。 2007年赵辉等发明了一种橡胶树易碎胚性愈伤组织诱导及继代增殖方法，并应用 于橡胶树基因转化技术研究，弥补了橡胶花药和内珠被组培外植体取材受季节等自然条件 限制的缺点，为橡胶转化技术提供了新的技术路线，也为建立橡胶花药悬浮培养和橡胶原 生质体培养提供了大量的好材料。 2008年赵辉等发明了橡胶树体细胞子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，并利用 该再生体系进行了基因转化技术研究，实验表明该再生体系是适宜基因转化的高效转化再 生体系。胚性愈伤组织具有卵细胞特性，接受外源基因的能力强，其诱导的胚状体是单细胞 起源不会出现嵌合体，是理想的基因转化受体系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法，其是利用橡 胶树花药或内珠被组织培养，橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，并成功结合基 因枪和农杆菌介导法，大大提高橡胶树遗传转化效率的方法。
本发明所采用的技术方案 —种橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法，包括胚性组织的选取与处理过 程、体细胞胚高效胚性愈伤组织的诱导与选择过程、遗传转化过程、转化后的胚性愈伤诱导 成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程。 1、胚性组织的选取与处理过程在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上，选择 花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康，长lcm以上的子叶胚为外植体， 进行切片处理。所述子叶胚的切片处理是切成宽2 3mm、长3 5mm的米粒状切片。切片 的质量影响愈伤诱导效率，切片过小，难以诱导出愈伤，切片太大浪费材料的同时也难诱导 出理想的愈伤。 2、体细胞胚高效胚性愈伤组织的诱导与选择过程将米粒状子叶胚切片接种到胚 性愈伤诱导培养基上于26 2『C进行暗培养20 30天。其中20 30天的愈伤出胚效率最高，应选择为转化的受体材料，体胚愈伤在胚诱导培养基上培养45天后观察，出胚愈 伤率可达40 60%，出胚率可达200 300% ， 20天以前的愈伤量很少，40天以后的愈伤 出胚效率明显降低，都不宜选择为转化受体材料。所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基 为基础培养基，并添加0. 5 2ppm2，4-D、0. 5 2卯m KT、0 l卯m BA、0 2卯m NAA、0 2卯m ZT、蔗糖70 90g/L、椰子水50ml/L、0. 1 2g/L天门冬酰胺和0. 1 0. 2g/L肌醇。
3、遗传转化过程利用基因枪或农杆菌介导法，以暗培养20 30天的子叶胚胚性 愈伤组织为转化受体进行遗传转化。 4、转化后的胚性愈伤诱导成胚过程将转化后的子叶胚胚性愈伤接到胚诱导培养 基上于24 26t:进行暗培养至生成子叶胚。经抑菌或筛选过程20 30天可观察到体胚 的发育，40 60天时能大量形成子叶胚，60 90能得到许多成熟胚。这些子叶胚长到lcm 以上时便可进一步切片诱导高效胚性愈伤进行体胚的循环增殖，或者接入成苗培养基内诱 导形成自根苗。所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10 50%，微量元素增加0. 5 2倍，并添加0. 5 3卯m BA、0. 5 3卯m KT、0 0. 5卯mNAA、 0. 2 l卯m GA、0 5卯m ABA、水解酪氨酸50 300mg/l、加0. 1 0. 2g/L肌醇、麦芽糖 0 20g/L、蔗糖50 70g/L和椰子水50ml/L。 5、成熟胚的选取与诱导成苗过程选取经筛选过程产生的健康、完整、高1. 5cm以 上的子叶胚接到自根苗培养基上于28 3(TC进行光培养至抽出健状茎段。约10天子叶 胚可抽出健状的主根，约20天子叶胚可抽出10cm的健状茎段。所述自根苗培养基是以MS 培养基为基础培养基，其中大量元素减少10 30%，并添加0 2ppm BA、0. 5 2ppm KT、 0. 2 lppm NAA、0. 5 1. 5ppmGA、糖30 50g/L和椰子水50ml/L。
本发明的优点 1、以体细胞子叶胚高效胚性愈伤组织为转化受体克服了脱分化愈伤组织在转化 中的严重不足，子叶胚胚性愈伤组织耐受转化因子作用强，并且成胚率极高，解决了转化过 程中胚诱导率低的问题。 2、胚性愈伤组织具有卵细胞特性，接受外源基因的能力强，其诱导的胚状体是单 细胞起源不会出现嵌合体，是理想的基因转化受体系统。 一般从花药或内珠被诱导出脱分 化愈伤组织需要50 60天，再从脱分化愈伤组织再诱导出易碎胚性愈伤组织需要3 4 个月时间；而从体细胞子叶胚切片能直接诱导出高效的胚性愈伤组织，并且只需要20 30 天，这大大縮短了胚性愈伤组织的诱导时间，能很快为基因转化提供高效胚性受体材料，因 此能大大提高转化工作效率。 3、子叶胚胚性愈伤组织进行基因转化后，直接进入胚状体诱导阶段进行抑菌或筛 选过程，除受抑菌剂或筛选剂的影响外，继代过程不影响体胚的形成，能最大限度的保持橡 胶树子叶胚高效再生体系的高效成胚率。 4、经常剥取花药或内珠被诱导脱分化愈伤组织费工、费钱，还受花期、果期及气候 等自然条件的极大限制，利用体细胞子叶胚高效再生体系可以长期继代增殖子叶胚，反复 切取子叶胚诱导胚性愈伤组织进行基因转化，这可以弥补以上不足，提高实验和生产效率。
5、取转化后的抗性胚状体用于分子检测，实验表明有大量抗性胚状体为转基因胚 状体，说明了橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法不但有高效的成胚率，还有高的转 化效率。
本发明工艺流程简单，成本低，转化后成胚率和转化率均高，具有很大的科学研究 及应用价值。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例 1、在橡胶树花药组织培养的基础上，选择花药脱分化愈伤经胚诱导过程3个月产 生的新鲜、健康，长1 3cm以上的子叶胚为外植体，在超净工作台上进行切片处理，先纵切 再横切成宽2 3mm、长3 5mm的米粒状小切片。 2、将子叶胚切片接种到子叶胚胚性愈伤诱导培养基上培养，用9cm的培养皿，每 个培养皿接10 15个切片，切片均匀放置，培养室温度保持在26 2『C，暗培养。其中 20 30天的愈伤出胚效率最高，应选择为转化受体材料，20天以前的切片愈伤量很少，40 天以后的愈伤出胚效率明显降低都不宜选择为受体材料。 3、遗传转化过程利用基因枪或农杆菌介导法，以25天的子叶胚胚性愈伤组织 为受体进行遗传转化。与橡胶花药脱分化愈伤组织的对比实验表明，橡胶树子叶胚胚性愈 伤组织是更适宜转化的好材料，在转化、抑菌、筛选、成胚各环节都表现出相当明显的优越 性，具体表现为子叶胚胚性愈伤组织再生能力和抗褐化能力强，转化后诱导成胚能力仍然 很强，受抑菌、筛选等转化过程的副作用小；通过筛选过程产生的子叶胚可进一步进行切 片处理，通过橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法达到胚性组织循环增殖的目的， 这样可以得到大量的转基因植株；转化工作的安排较随意，操作过程不大受时间限制。在 D06。。0. 8 1. 0、25t:、侵染10 15分钟、共培养2天、抑菌良好的情况下进行农杆菌转化， 脱分化愈伤组织的诱导成胚率为0，然而用子叶胚胚性愈伤组织进行转化，诱导成胚率可达 80%以上。 4、选取经体胚诱导过程产生的健康、完整、高1.5cm以上的子叶胚接到自根苗培 养基上，约10天子叶胚可抽出健状的主根，约20天子叶胚可抽出10cm的健状茎段。培养 室温度保持在28 3(TC，光培养，每天12小时光照。
权利要求
一种橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法，其特征在于包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤组织的诱导与选择过程、遗传转化过程、转化后的胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程；1)、胚性组织的选取与处理过程在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康，长1cm以上的子叶胚为外植体，进行切片处理；2)、体细胞胚高效胚性愈伤组织的诱导与选择过程将子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于26～28℃进行暗培养20～30天；所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0.5～2ppm 2，4-D、0.5～2ppm KT、0～1ppm BA、0～2ppm NAA、0～2ppm ZT、蔗糖70～90g/L、椰子水50ml/L、0.1～2g/L天门冬酰胺和0.1～0.2g/L肌醇；3)、遗传转化过程利用基因枪或农杆菌介导法，以暗培养20～30天的子叶胚胚性愈伤组织为转化受体进行遗传转化；4)、转化后的胚性愈伤诱导成胚过程将转化后的子叶胚胚性愈伤接到胚诱导培养基上于24～26℃进行暗培养至生成子叶胚；所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10～50％，微量元素增加0.5～2倍，并添加0.5～3ppm BA、0.5～3ppm KT、0～0.5ppmNAA、0.2～1ppm GA、0～.5ppm ABA、水解酪氨酸50～300mg/l、加0.1～0.2g/L肌醇、麦芽糖0～20g/L、蔗糖50～70g/L和椰子水50ml/L；5)、成熟胚的选取与诱导成苗过程选取经筛选过程产生的健康、完整、高1.5cm以上的子叶胚接到自根苗培养基上于28～30℃进行光培养至抽出健状茎段；所述自根苗培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10～30％，并添加0～2ppm BA、0.5～2ppm KT、0.2～1ppm NAA、0.5～1.5ppmGA、糖30～50g/L和椰子水50ml/L。
2. 根据权利要求1所述的橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法，其特征在于所 述子叶胚的切片处理是切成宽2 3mm、长3 5mm的米粒状切片。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种橡胶树子叶胚胚性愈伤高效遗传转化方法，其特征是在橡胶树花药或内珠被组织培养，以子叶胚为外植体，进行诱导、遗传转化，然后将转化后的胚性愈伤诱导成胚，对成熟胚进行选取后诱导成苗。本发明工艺流程简单，转化效率极高，成本低，克服了橡胶树遗传转化体系成胚率低、胚性愈伤组织诱导时间长等严重缺陷；同时也弥补了橡胶树转化受体材料的获得易受季节等自然条件限制的缺点，大大缩短了转化周期，是一种高效的橡胶树遗传转化方法，具有很大的科研及应用价值，为橡胶树转化体系的建立开创了展新的技术路线。
文档编号A01H5/00GK101775408SQ20101011391
公开日2010年7月14日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者彭明, 曾会才, 王旭, 赵辉 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所