目的基因转化苹果的方法及其在苹果中瞬时表达目的基因中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中目的基因转化苹果的方法及其在苹果中瞬时表达目 的基因中的应用。
【背景技术】
[0002] 新疆野苹果(Malus sieversii Roem.)主要分布在中亚天山山脉，被认为是现代 栽培苹果的祖先种，且具有丰富的遗传多样性，是常用苹果砧木中抗旱能力最强的一种，对 其抗旱基因的分离研究，有助于揭示果树对逆境的响应机制。胚性愈伤组织作为一种良好 的试验试材，广泛应用于植物的遗传转化、再生植株等研究，是游离原生质体的良好试材； 无细胞壁的原生质体的代谢过程、信号转导途径、对环境因素和外来刺激的反应等，都与完 整的植物细胞或组织基本相同，通过向原生质体中导入功能基因与报告基因融合的DNA，利 用报告基因在植物原生质体中的瞬时表达可以快速准确地进行蛋白质及细胞器定位、相关 基因功能研究、蛋白质互作研究及细胞代谢过程研究等，为在细胞水平上研究植物的生理 变化、基因表达、信号传递等提供了简便有效的实验体系。
[0003] 目前新疆野苹果稳定遗传转化体系尚未构建成功，相关基因在本属植物中的功能 研究无法顺利开展。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何在野生苹果中进行目的基因的瞬时表达。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了苹果转化方法。
[0006] 本发明所提供的苹果转化方法，包括以苹果胚原生质体为受体进行苹果转化；
[0007] 所述苹果胚原生质体的制备方法包括下述A1)和A2):
[0008] A1)将苹果胚性愈伤组织进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞；
[0009] A2)用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细胞得到所述苹果胚原生质体。
[0010] 上述方法中，所述将苹果胚性愈伤组织进行悬浮继代培养包括:将所述苹果胚性 愈伤组织在悬浮系继代培养基中进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞；
[0011] 所述悬浮系继代培养基为向MS培养基中加入BA、2,4-D、维生素 C和蔗糖得到的培 养基;所述悬浮系继代培养基中所述BA、所述2,4-D、所述维生素 C和所述蔗糖的浓度可分别 为0.511^凡、311^凡、211^凡和质量百分比浓度3%4!1为5.8。
[0012] 上述方法中，所述A1)具体可包括:研磨所述苹果胚性愈伤组织，得到研磨物;将所 述研磨物在所述悬浮系继代培养基中进行继代培养，得到所述悬浮细胞。
[0013] 上述目的基因转化苹果的方法中，所述研磨苹果胚性愈伤组织可为用网筛研磨所 述苹果胚性愈伤组织。所述网筛可为不锈钢网筛，如40目不锈钢网筛。
[0014] 上述方法中，所述以苹果胚原生质体为受体进行苹果转化可为用含有目的基因的 侵染液侵染所述苹果胚原生质体。所述用含有目的基因的侵染液侵染所述苹果胚原生质体 可为利用PEG介导的原生质体瞬时表达方法完成所述侵染。
[0015] 上述方法中，所述侵染时间可为10_30min，如15min或20min。
[0016] 上述方法中，所述悬浮继代培养的次数可大于等于2次，每次悬浮继代培养的时间 可为7-10d，如8d。所述悬浮继代培养可在黑暗、150r/min下进行。所述悬浮继代培养的温度 可为22-24°C。
[0017] 上述方法中，所述用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细胞前还包括将所述悬浮细 胞用CPW13M进行处理；所述CPW13M为向细胞-原生质体清洗液（cell protoplast wash medium，以下简称CPW溶液）中加入甘露醇得到的溶液;所述CPW13M中甘露醇的质量百分比 浓度可为(如13%)。
[0018] 其中，所述CPW溶液由水和溶质组成，所述CPW溶液的溶质及其浓度分别为 KH2P〇427.2mg/L、KN〇3 101.0mg/L、CaCl2.2H20 1480.0mg/L、MgS〇4.7H20 246.0mg/L、KI 0.16mg/L及CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L。
[0019] 上述方法中，用所述CPW13M处理所述悬浮细胞的时间可为0.5-2h。所述用所述 CPW13M处理所述悬浮细胞的浸泡时间具体可为lh。
[0020] 上述方法中，所述纤维素酶、所述果胶酶和所述CPW13M处理的悬浮细胞的比例可 为100U:15U:10mL。
[0021] 上述方法中，所述A2)可包括A21)和A22):
[0022] A21)用含有所述纤维素酶和所述果胶酶酶的酶液浸泡所述悬浮细胞，得到酶-原 生质体混合液；
[0023] A22)将所述酶-原生质体混合液加至CPW25S上，得到下层为CPW25S上层为酶-原生 质体混合液的分层液体1;将所述分层液体1进行离心，使原生质体位于所述分层液体1的界 面处，分离原生质体，得到所述苹果胚原生质体；
[0024] 所述CPW25S为向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S中蔗糖质量百 分比浓度具体可为23 % -27 % (如25 % )。
[0025] 上述方法中，所述酶液由溶质和溶剂组成;所述溶剂为所述CPW溶液，所述溶质及 其浓度分别为100000U/1所述纤维素酶、15000U/L所述果胶酶、0.65mol/L D-mannitol、 1.0% (质量百分比浓度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1 % (质量百分比浓度)MES和0.1 % (质量 百分比浓度沖34，？!1为5.6。
[0026] 上述方法中，用所述酶液浸泡所述悬浮细胞可在弱光（如5001ux以下）、22-24Γ、 40r/min下进行。用所述酶液浸泡所述CPW13M处理的悬浮细胞的时间可为15-25h，如20h。
[0027] 上述方法中，所述纤维素酶可为Cellulase R-10。所述果胶酶可为Pectolase Y-23。所述Cellulase R-10具体可为北京优尼康生物科技有限公司产品，货号为C8260-100。 所述Pectolase Y-23具体可为北京美莱博医学科技有限公司产品，货号为MMF-1069。
[0028] 上述方法中，所述苹果胚性愈伤组织的制备方法可包括:将苹果胚在诱导培养基 上进行诱导培养得到苹果胚性愈伤组织；
[0029] 所述诱导培养基为向MS培养基中加入BA、2,4_D和蔗糖得到的固体培养基；
[0030] 其中，所述诱导培养基中BA、2,4-D和蔗糖的浓度分别可为3mg/L、lmg/L和3% (质 量百分比浓度）。
[0031] 上述方法中，所述诱导培养可在22-24Γ、黑暗下进行。所述诱导培养的培养时间 可为 7-21d，如 14d。
[0032] 上述方法中，所述苹果胚为盛花后60-80d的苹果胚。
[0033] 上述方法中，所述盛花后60-80d具体可为盛花后70d。
[0034] 上述方法中，所述苹果胚性愈伤组织的制备方法还包括将所述苹果胚性愈伤组织 在继代培养基上进行继代培养；
[0035]所述继代培养基为向MS培养基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固体培养基；
[0036]其中所述继代培养基中BA、2,4-D和蔗糖的浓度分别可为4mg/L、2mg/L和3% (质量 百分比浓度）。
[0037] 上述方法中，所述继代培养可在22-24Γ、黑暗下进行。所述继代培养的培养时间 可为 7-21d，如 14d。
[0038] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1或P2的方法：
[0039] P1、所述苹果胚原生质体的制备方法；
[0040] P2、所述苹果胚性愈伤组织的制备方法。
[0041] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ml或M2的产品：
[0042] Ml、用于制备苹果胚原生质体的成套试剂，为所述悬浮系继代培养基、所述 CPW13M、所述CPW25S、所述CPW溶液、所述纤维素酶、所述果胶酶、所述诱导培养基和所述继 代培养基中的至少两种；
[0043] M2、用于诱导苹果胚性愈伤组织的试剂，为所述诱导培养基和/或所述继代培养 基。
[0044] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0045] XI、所述苹果转化方法在苹果中瞬时表达目的基因中的应用；
[0046] X2、所述苹果胚原生质体的制备方法在苹果中瞬时表达目的基因中的应用；
[0047] X3、所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在苹果中瞬时表达目的基因中的应用；
[0048] X4、所述产品在苹果中瞬时表达目的基因中的应用；
[0049] X5、所述苹果转化方法在植物基因功能验证中的应用；
[0050] X6、所述苹果胚原生质体的制备方法在植物基因功能验证中的应用；
[0051] X7、所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在植物基因功能验证中的应用；
[0052] X8、所述产品在植物基因功能验证中的应用。
[0053] X9、所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在制备苹果胚原生质体的中的应用；
[0054] X10、所述苹果胚性愈