专利名称：橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及一种植物遗传转化方法，具体涉及一种以继代增殖的 胚性愈伤组织为转化受体材料的橡胶树高效遗传转化方法。
背景技术：
1991年马来西亚橡胶研究所的Arokiaraj等在2周龄离体橡胶 苗的茎部用皮下注射器注入致癌农杆菌541/71进行接种，3周后形 成肿瘤，8周后肿瘤直径可达2cm，该肿瘤切下后可在不含激素的MS 基本培养基上自主生长，用TLC可检测到肿瘤组织中含有由农杆菌诱 导形成的章鱼碱。肿瘤的形成包含了质粒的转移，并表明质粒携带的 控制某些代谢物(如冠瘿碱、植物激素合成)的基因在肿瘤细胞中得 到表达，这是最早关于橡胶树基因工程的报道。1994-1998年 Arokiaraj等应用基因枪法和农杆菌介导法，都成功地将P-葡糖苷 酸酶(6Z/5")和新霉素磷酸转移酶基因转入橡胶中，在扩繁的第3代 无性系中仍正常表达，表现出高度的稳定性，而这正是转基因动植物 所需具备的一个重要特征，初步建立了橡胶的遗传转化体系，从此， 利用脱分化愈伤组织进行转化成了巴西橡胶转化的基本技术路线，但 是转化效率极低。2000年法国热带农业研究中心的Montoro等人利 用继代的易碎内珠被脱分化愈伤组织为受体进行转化，研究了钙在橡 胶农杆菌转化中的作用，但并没有得到转基因植株。2000年中国橡
胶研究所的李维国以花药脱分化愈伤组织为受体，将木薯5Z "基因导 入橡胶，并得到转基因胚状体和瓶苗，但转基因瓶苗不能增殖。2003 年印度橡胶研究所的Jayashree等以花药脱分化愈伤组织为受体，利 用农杆菌介导法将6Z^基因和6Z^基因成功转入橡胶中，并在转基因 后代中稳定表达。2005年Montoro等在橡胶内珠被脱分化愈伤组织 继代及相关悬浮培养技术的基础上，利用农杆菌介导法成功得到转基 因植株，但转化过程中有大量玻璃化苗产生，相关组培技术还不完善。 2006年中国热带农业科学院生物技术研究所陈雄庭等以6KS"基因为 报告基因，T^77/基因为筛选标记基因，用基因枪轰击橡胶花药脱分 化愈伤组织进行转化实验，将W/矮化基因导入巴西橡胶，对基因 枪转化橡胶愈伤组织的方法进行了探索，并初步确定W/基因已经 整合到橡胶基因组中，但橡胶愈伤组织经过基因枪轰击后，褐化程度 比较严重，胚状体再生率和出苗率都比较低。2007年中国热带农业 科学院生物技术研究所彭明实验室以长期继代增殖的橡胶胚性愈伤 组织为转化受体，过农杆菌介导法将新疆小拟南芥抗冻调节基因C9尸 及其下游功能基因aW7&转入橡胶组织中，并得到大量转基因胚状 体。
20世纪70年代末我国科技工作者首次利用离体花药相继成功培 育出花粉单倍体及花药二倍体植株，现在己可从花药、内珠被、子叶 培养经过体细胞胚发生得到再生植株，但难以建立胚性细胞悬浮系和 转化体系。
长期以来，以脱分化愈伤组织为受体进行基因枪或农杆菌转化是
世界橡胶树遗传转化体系的基本方法，但这类方法转化效率极低，成 为制约橡胶树基因工程研究的瓶颈，其存在的严重影响转化效率的因 素主要有脱分化愈伤组织诱导分化成熟胚的频率较低；脱分化愈伤 组织不宜于继代增殖，继代后胚分化率明显下降；脱分化愈伤组织不 适应转化操作，操作过程中愈伤组织容易破碎，农杆菌的毒害作用都 容易导致组织褐化坏死；脱分化愈伤组织对抑菌剂和筛选剂很敏感， 抑菌和筛选过程容易影响愈伤组织的生长和分化。
此外，多年的橡胶组织培养实践表明，茎干、叶等其它部位培养 获得的愈伤组织难以诱导出正常的胚状体， 一般不用作遗传转化。
发明内容
本发明的目的是提供一种橡胶树高效遗传转化方法，它是利用橡 胶树组织培养，橡胶树花药和内珠被胚性愈伤组织诱导培养及继代增 殖培养技术，并成功结合基因枪和农杆菌介导法，大大提高橡胶树遗 传转化效率的方法。
本发明所设计的橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法包括胚 性愈伤组织的诱导培养过程、转化受体材料的继代增殖培养过程、遗 传转化过程、抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程、继代后的抗性 胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程。
1、胚性愈伤组织的诱导培养过程在橡胶树花药组织培养或内 珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被的脱分化愈伤组织接入胚 性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，可从部分褐化的脱分化愈伤上 初生鲜黄、松散、透明的胚性愈伤组织，这些胚性愈伤组织进一步诱
导能大量形成成熟胚。所述胚性愈伤组织诱导培养基是以MS培养基 为基础的培养基，并添加水解酪氨酸、麦芽糖、BA、 Kt、 NAA、 GA、 ABA。
2、 转化受体材料的继代增殖培养过程挑选初生、鲜黄的胚性 愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行继代增殖培养；所 述胚性愈伤组织继代增殖培养基是以MS培养基为基础的培养基，并添 加2，4-D、 BA、 KT、 NAA、 GA、 TDZ。
3、 遗传转化过程利用基因枪或农杆菌介导法，以继代增殖的 胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。
4、 抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程经过转化和筛选过 程，会从褐化的胚性愈伤组织内再生鲜黄的抗性胚性愈伤组织，将抗 性胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基上进行多次继代 大量增殖，以增加抗性胚性愈伤组织的数量，从而大大增加抗性胚状 体的数量。
5、 继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗培养过程将经
多次继代的抗性胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基上诱导出胚，并
使其进一步发育成成熟胚和成苗;胚状体诱导培养基是以MS培养基为 基础培养基，其中大量元素减量，微量元素加量，并添加水解酪氨酸、 麦芽糖、BA、 KT、 NAA、 GA、 ABA。 本发明的优点
1、以胚性愈伤组织为转化受体克服了脱分化愈伤组织在转化中的 严重不足，能大大提高形成成熟胚的效率，解决了转化过程中胚诱导
率低的问题。
2、 利用继代增殖的胚性愈伤组织进行转化，能縮短成胚时间，进 一步提高成胚效率。
3、 抗性胚性愈伤组织增殖能力强，在不影响胚性愈伤组织诱导成 胚能力的基础上，选择适宜的继代次数进行继代培养，能大大增加抗 性胚性愈伤组织的数量，从而能大大增加诱导出抗性胚状体的数量。
4、 经常剥取花药或内珠被诱导脱分化愈伤组织费工、费钱，还受 花期、果期及气候等自然条件的极大限制，利用继代增殖的胚性愈伤 组织进行转化可以弥补以上不足，提高实验和生产效率。
5、 取转化后的抗性胚状体用于分子检测，实验表明有大量抗性 胚状体为转基因胚状体，说明了橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方 法不但有高效的成胚率，还有高的转化效率。
本发明工艺流程简单，成本低，转化后成胚率和转化率均高，具 有很大的科学研究及应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明所设计的橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法包括胚 性愈伤组织的诱导培养过程、转化受体材料的继代增殖培养过程、遗 传转化过程、抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程、继代后的抗性 胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程。
1、胚性愈伤组织的诱导培养过程在橡胶树花药组织培养或内
珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被经30 60天诱导的脱分
化愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，约3个月从 部分褐化的脱分化愈伤组织上会初生鲜黄、松散、透明的胚性愈伤组 织，这些胚性愈伤组织进一步诱导能大量形成成熟胚。所述胚性愈伤 组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加水解酪氨酸 (50 400 ) mg/L、麦芽糖3 9 % (g/v)、 BA (0. 2 4) mg/L、 Kt (0 4) mg/L、 NAA (0. 1 1) mg/L、 GA (0. 1 2) mg/L、 ABA (0. l 2) mg/L。
2、 转化受体材料的继代增殖培养过程挑选初生、鲜黄的胚性 愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行继代增殖培养，培 养室温度保持在24 28。C，暗培养，20 30天继代1次；所述胚性 愈伤组织继代增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2， 4-D
(0. l 4)mg/L、BA(0 4)mg/L、KT(0. l 3)mg/L、 NAA (0 3)mg/L、 GA (0 2) mg/L、 TDZ (0 2)mg/L。
3、 遗传转化过程利用基因枪或农杆菌介导法，以继代增殖的 胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。与橡胶脱分化愈伤组织的对比实 验表明，橡胶树胚性愈伤组织是更适宜转化的好材料，在转化、抑菌、 筛选、成胚各环节都表现出相当明显的优越性，具体表现为胚性愈伤 组织松散，轰击或浸染较均匀，抑菌及筛选较容易；胚性愈伤组织继代 增殖和诱导成胚能力强，长期继代对诱导成胚能力影响不大，诱导抗性 胚状体的安排较随意，操作过程不大受时间限制，此外，转化过程增加 了继代次数反而增加了成胚数；胚性愈伤组织再生能力和抗褐化能力 强，受抑菌、筛选等转化过程的副作用小等。在DO 0. 2 0. 4、 28°C、 侵染2 3 min、共培养2 d、抑菌良好的情况下进行农杆菌转化，脱分 化愈伤组织的诱导成胚率只有0. 27%,然而，用继代增殖的胚性愈伤组织 进行转化，诱导成胚率可达30%。
4、 抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程经过转化及筛选过 程，会从褐化的胚性愈伤组织内再生鲜黄的抗性胚性愈伤组织，将抗 性胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基上进行多次继代， 以增加抗性胚性愈伤组织的数量，从而大大增加诱导出抗性胚状体的 数量。
5、 继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程将 经多次继代的抗性胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基上诱导出胚， 并使其进一步发育成成熟胚和成苗；所述胚状体诱导培养基是以MS 培养基为基础培养基，其中大量元素减至1/5 1/2,微量元素增加l 2倍，并添加水解酪氨酸50 400 mg/L、麦芽糖2 9°/。 (g/v)、 BA(O. 2 3) mg/L、 KT(0 3) mg/L、 NAA(O. 1 1) mg/L、 GA(O. 1 2) mg/L、 ABA(O. 1 2) mg/L。
实施例
1、胚性愈伤组织的诱导培养过程在橡胶树花药组织培养的基 础上，选择花药经50天脱分化的愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培 养基中，经约3个月的暗培养，将从部分褐化的脱分化愈伤上初生鲜 黄、松散、透明的胚性愈伤组织。所述胚性愈伤组织诱导培养基是以 MS培养基为基础培养基，并添加水解酪氨酸200mg/L、麦芽糖4 % (g/v)、 lmg/L BA、 lmg/L Kt、 0. 3mg/L NAA、 0. 5mg/L GA3、 0. lmg'/L
ABA。
2、 转化受体材料的继代增殖培养过程挑选初生、鲜黄胚性愈
伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行继代增殖培养，培养
室温度保持在26。C，暗培养，30天继代1次。所述胚性愈伤组织继 代增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1. 5 mg/L 2、 4-D、 1 mg/L KT、 0. 5 mg/L NAA、 0. 2 mg/L TDZ。
3、 遗传转化的过程利用农杆菌介导法，以继代增殖的胚性愈 伤组织为受体进行遗传转化，并得到再生的抗性胚性愈伤组织。
4、 抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程将抗性胚性愈伤组 织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基上进行多次继代培养，以大大增 加抗性胚性愈伤组织的数量。
5、 继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程选
择适宜继代次数的抗性胚性愈伤组织，接入胚状体诱导培养基中进行
培养，2个月后会陆续诱导出胚，并能进一步发育成成熟胚和成苗。 所述胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减 半，微量元素增加1倍，并添加水解酪氨酸300mg/l、麦芽糖3%(g/v)， 蔗糖4%(g/v) 、 1 mg/L BA、 1 mg/L KT、 0. 2 mg/L NAA、 0. 8 mg/L GA3、 0. 2 mg/L ABA。
权利要求
1、一种橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法，其特征在于包括胚性愈伤组织的诱导培养过程、转化受体材料的继代增殖培养过程、遗传转化过程、抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程、继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程；1)所述胚性愈伤组织的诱导培养过程是指在橡胶树花药组织培养或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被经30～60天诱导的脱分化愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，约3个月从部分褐化的脱分化愈伤组织上会初生鲜黄、松散、透明的胚性愈伤组织，这些胚性愈伤组织进一步诱导能大量形成成熟胚；所述胚性愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加水解酪氨酸(50～400)mg/L、麦芽糖3～9％(g/v)、BA(0.2～4)mg/L、Kt(0～4)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L；2)所述转化受体材料的继代增殖培养过程是指挑选初生、鲜黄的胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行继代增殖培养，培养室温度保持在24～28℃，暗培养，20～30天继代1次；所述胚性愈伤组织继代增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D(0.1～4)mg/L、BA(0～4)mg/L、KT(0.1～3)mg/L、NAA(0～3)mg/L、GA(0～2)mg/L、TDZ(0～2)mg/L；3)所述遗传转化过程是指利用基因枪或农杆菌介导法，以继代增殖的胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；4)所述抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程是指经过转化及筛选过程，会从褐化的胚性愈伤组织内再生鲜黄的抗性胚性愈伤组织，将抗性胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基上进行多次继代，以增加抗性胚性愈伤组织的数量，从而大大增加诱导出抗性胚状体的数量；5)所述继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程是指将经多次继代的抗性胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基上诱导出胚，并使其进一步发育成成熟胚和成苗；所述胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减至1/5～1/2，微量元素增加1～2倍，并添加水解酪氨酸50～400mg/L、麦芽糖2～9％(g/v)、BA(0.2～3)mg/L、KT(0～3)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法，其特征是以橡胶树花药或内珠被为外植体进行组织培养，并诱导培养产生橡胶树胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织进行继代增殖培养，并以增殖后的胚性愈伤组织为受体材料进行遗传转化；将转化后得到的抗性胚性愈伤组织进行继代和增殖培养；将继代增殖后的抗性胚性愈伤组织，经胚状体诱导过程诱导培养产生胚，并进一步成苗。本发明工艺流程简单，转化效率极高，成本低，克服了现有橡胶树遗传转化体系成胚率极低等严重缺陷，弥补了橡胶树转化受体材料的获得易受季节等自然条件限制的缺点，大大缩短了转化周期，是一种高效的橡胶树遗传转化方法，具有很大的科研及应用价值。
文档编号C12N15/82GK101186927SQ200710186439
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者明 彭, 旭 王, 辉 赵 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所