专利名称：一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种冰缘植物转化的方法，特别是涉及根癌农杆菌介导的高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。
背景技术：
高山离子芥是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。本实验采样地处于43. 05N，86. 49E的乌鲁木齐河源区流石碓，海拔3600 3900m。该地区年平均气温在-5 -7°C之间，6 8月平均气温为3. 6°C，气温日差较大，是一种伴随反复冻融环境的高寒植物。利用生物技术手段，将外源基因导入高山离子芥悬浮胚性愈伤中，有利于研究冰缘植物的的各种生理生化过程。目前，在高山离子芥一些抗冻、抗寒、耐盐等基因及其功能的研究中，都是将外源基因介入烟草、拟南芥中研究其功能。但是，并没有任何报道有将高山离子芥的抗性基因导入其自身中研究其基因功能，其主要的技术问题在于，尚未建立高山离子芥的转化体系。高山离子芥转化方法的建立，有助于研究高山离子芥自身特有的差异表达的基因、蛋白相互作用等，为研究高山冰缘植物提供了新方法，新思路，具有很好的应用前景。近几年来，胚性愈伤作为转化的受体系统倍受关注，先后在柑橘、茶树、棉花、可可、苜蓿等作物上取得成功，但在高山离子芥中未见报到。1988年发现，该受体系统由于胚性细胞团中可增殖的胚性细胞处于表面及近表面，且能在众多的位点上形成体细胞胚， 使转化方便而高效。另外，1993年Sato等人和1997年Trick等人(Sato S et al, Plant Cell Pep. , 1993 ；Tricket al,Plant Tissue Cult Biotech，1997)分别发现在胚性细胞团增殖培养过程中，由于培养液与胚性细胞团充分接触，可进行高效筛选获得均一的转化胚性细胞团，进而获得大量转化的非嵌合的体细胞胚以再生转化植株。由于培养液与胚性细胞团充分接触，相对于在固体培养基上培养的愈伤组织，悬浮胚性愈伤大部分是游离的单细胞状态，更有利于高效的转入外源基因。我们借鉴胚性愈伤转化在其他作物上取得的成功经验，探索了一条利用高山离子芥悬浮胚性愈伤作为转化受体的转化途径。高山离子芥是一种野生的药用高寒植物，具有极高的营养价值。悬浮胚性愈伤可以作为植物生物反应器，安全快捷地高效表达外源基因。利用生物技术手段，向高山离子芥基因组中导入外源基因，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种，有利于研究冰缘植物的各种生理生化过程，为冰缘植物的遗传改良工作提供了一条有效的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，通过建立一个适合多种外源基因转入高山离子芥基因组中悬浮胚性愈伤的转基因体系，该体系经GUS染色鉴定后，发现转化率高达80%左右，并利用高山离子芥悬浮胚性愈伤为转化受体，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种。为实现上述目的本发明所采用的技术方案是一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是(1)悬浮胚性愈伤的培养选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MSd^W 外源激素为 6-BA、NAA 和 KT ；6-BA 的浓度为 0. 1-0. 3mg/L, NAA 的浓度为 0. 1-0. 2mg/L, KT 的浓度为0. 2-0. 3mg/L ；液体培养基的PH为5. 8-6. 0 ；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8-12小时，再连续黑暗12-16小时，温度为18-20°C。每隔6到9天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1 4，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)、 50mg/L 利福平(Rifampicin，RFP)的 Yeast Extract Peptone (YEP)固体培养基上，28°C下培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含 Kan，利福平(Rifampicin，RFP)的YEP液体培养基中，28°C，避光，200rpm振荡培养过夜；取培养过夜的根癌农杆菌菌液转接到含相同抗生素的液体YEP培养基中，继续避光培养3-5 小时，然后，以转速6000rpm离心8min，收集菌液于离心管中，用分子枪吸液体基本培养基 MS吹悬根癌农杆菌菌体，加入乙酰丁香酮，调整OD6tltl值为0. 5-0. 7备用；(3)根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤(1)中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部后，将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤，然后将三角瓶放入转速为40-50rpm的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均勻分布，温度为20°C，时间为20-30min。(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织置于在无菌的滤纸上放干，保证菌液吸干，用无菌镊子接至含有乙酰丁香酮、PH为5. 8 6. 0的固体培养基MS上，20°C暗培养3天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。本发明与现有的技术相比所具有的优点和产生的有益效果1、转化效率高目前为止，本发明的转化率为80%左右，迄今为止尚未有高山子离子芥的转化体系的相关报道，此转化率已是较高的。而且，在提高转化效率方面使用了乙酰丁香酮，发现在乙酰丁香酮浓度为50umol/L时，转化效率能达到80%左右。2、适应范围广本发明的高山离子芥悬浮胚性愈伤转化体系应用于多种基因，如抗冻基因COR基因，FZF转录因子，海藻糖磷酸合成酶5基因(TPS5)基因等都可利用此方法导入高山离子芥悬浮胚性愈伤中进行蛋白质相互作用等进一步的功能研究。3、操作比较简便，实施条件宽松，效果非常明显。
整个实验过程的周期短，可观察外源基因转入的瞬时表达情况，且实验中所使用的仪器都是实验室的常规仪器，操作起来十分便捷。4、本发明易于掌握，重复性高。在整个实验过程中，经过多个重复实验，均能稳定得到转化效率较高(80%左右) 的实验结果，具有稳定性。5、本发明使用的高山离子芥的悬浮胚性愈伤，容易获得，且周期短。胚性愈伤组织在悬浮状态下培养，呈游离的单细胞状态，比在固体培养基上生长的愈伤组织繁殖速度快， 生长周期短，是非常理想的研究转化方法的材料。6、本发明对高山离子芥悬浮胚性愈伤转化外源基因，使外源基因能够高频地转入悬浮胚性愈伤中，为高山离子芥的遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。
图1是本发明中高山离子芥的悬浮胚性愈伤在⑶S染色后的悬浮胚性愈伤组织图。图2是本发明中未受根癌农杆菌侵染的空白对照悬浮胚性愈伤在解剖镜图。图3是本发明中悬浮胚性愈伤经脱色液12小时脱色后的解剖镜图。图4是本发明中图1的第6号样品，即受根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤脱色后的解剖镜图。
具体实施例方式下面，结合附图和实施例，对本发明再作进一步的详述一种高山离子芥悬浮细胞转化的方法，其步骤分五个部分进行(1)悬浮胚性愈伤的培养高山离子芥采样。拟定候选标准是无分泌蜡质的腺体、无表皮绒毛、无角质层加厚；利用采集杖挖掘天山冰川附近的高山离子芥植物，用聚乙烯袋收集带土植株，运输时去掉聚乙烯袋移栽到塑料泡沫运输箱内。选取健壮的高山离子芥叶片，切取叶子的中部，大约有2/3部分的叶子，用灭菌的镊子接种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织的产生。愈伤诱导固体基本培养基为MSj^W 外源激素为6-BA和KT ；6-BA的浓度为0. 1-0. 3mg/L, KT的浓度为0. 1-0. 2mg/L,固体培养基的PH为5. 85。对透明透气培养罐装有的待分化的植物叶片连续光照12小时，再连续黑暗12小时，温度为20°C。25天后，第一次转接时选取取植物叶片表面的绿色单个胚体转接到新的愈伤诱导培养基上，每隔20 25天继代培养一次，直到诱导出嫩黄色的高山离子芥愈伤组织。然后，选取嫩黄色的愈伤组织转接到高山离子芥愈伤固体培养基，此固体培养基与愈伤诱导固体培养基的区别在添加外源激素的不同，即2，4-D、6-BA和NAA，浓度分别为 0. 4-0. 5mg/L、0. 1-0. 2mg/L和0. 5-0. 6mg/L。处于保存目的，每隔20 25天继代一次。选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，并用无菌镊子将大的愈伤组织捏碎； 悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MS，添加外源激素为6-BA、NAA和KT ；6-BA的浓度为0. 1-0. 3mg/L, NAA的浓度为0. 1-0. 2mg/L, KT的浓度为0. 2-0. 3mg/L。液体培养基的PH为 5. 8 ；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8-12小时，再连续黑暗12-16小时，温度为 20°C。每隔7天继代一次。继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1 4，继代两次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞。(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的连有外源基因的根癌农杆菌GV3101。将根癌农杆菌涂布于含 50mg/L卡那霉素(Kan)、50mg/L利福平(Rifampic in, RFP)的 YeastExtract Peptone (YEP) 固体培养基上，28°C条件下，将涂布有根癌农杆菌的固体培养基放置于培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含50mg/L Kan、50mg/ L利福平(Rifampicin，RFP)的5ml YEP液体培养基中，28°C，避光，200rpm振荡培养过夜。 取培养过夜的根癌农杆菌菌液Iml转接到50ml含相同抗生素的液体YEP培养基中(按菌液和培养基体积比为1 50的比例转接)，继续28°C、避光培养3-5小时。然后，以转速 6000rpm离心8min，收集菌液于50ml离心管中，用分子枪吸液体基本培养基MS吹悬根癌农杆菌菌体，加入lOOumol/L乙酰丁香酮，调整OD6tltl值为0. 65备用。(3)根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤(1)中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，然后将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤。最后，将三角瓶放入转速为40-50rpm的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均勻分布，温度为20°C，时间为20min。(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再用无菌药勺将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织舀出，置于无菌的滤纸上，将菌液吸干，用无菌镊子接至含有50umol/l乙酰丁香酮、PH为5.8的固体培养基MS上，20°C暗培养3天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。(5)转基因愈伤组织的检测采用⑶S染色技术来鉴别转基因愈伤组织对外源基因的表达情况。从步骤(4)中悬浮胚性愈伤组织，用无菌水冲洗5次，然后用滤纸吸干，从滤纸上取500mg悬浮胚性愈伤组织，浸入之前配好的⑶S染液中，在37°C培养箱中避光染色12-16 小时。图1有16个GUS染色结果，1号为空白对照，即没有用根癌农杆菌侵染的悬浮胚性愈伤组织，⑶S染色后并未呈现蓝色，仍是米黄色颗粒状；6号样品中只有少部分悬浮胚性愈伤组织呈淡蓝色，大部分呈米黄色。6号样品之所以部分呈淡蓝色，大部分呈米黄色，其原因在于此样品在步骤(4)时共培养固体培养基中乙酰丁香酮浓度为Oumol/Ι。其余的样品均呈深蓝色颗粒状，说明乙酰丁香酮能提高根癌农杆菌介导的悬浮胚性愈伤的转化效率。) 然后，用分子枪吸出GUS染色液，用冰醋酸乙醇体积比为1 3的脱色液对悬浮胚性愈伤组织进行脱色，12小时后，取愈伤制片，在解剖镜下观察其表达(见图2、3、4)。图2为未受根癌农杆菌侵染的空白对照悬浮胚性愈伤的解剖镜图；图3为步骤 (4)中含有50umol/L乙酰丁香酮的培养基上共培养的悬浮胚性愈伤组织经染色及脱色后的解剖镜图；图4为步骤(4)中含有Oumol/L乙酰丁香酮的培养基上共培养的悬浮胚性愈伤组织经染色及脱色后的解剖镜图。从图2中可以看出此悬浮胚性愈伤并未受根癌农杆菌侵染，所以悬浮胚性愈伤组织未有任何被染成蓝色的细胞。图3呈大面积的蓝色，其原因在于共培养培养基中加入 50umol/L的乙酰丁香酮。图4呈小面积的淡蓝色，其原因在于共培养培养基中加入Oumol/L 的乙酰丁香酮，说明共培养培养基中加入乙酰丁香酮影响根癌农杆菌介导的悬浮胚性愈伤的转化效率。从整个实验比照中得出乙酰丁香酮浓度为50umol/L时，转化效率为80%。根癌农杆菌Ti质粒转化机制的研究表明，实现外源基因的导入并发生整合与表达，取决于载体_受体系统两个方面的反应，即Ti质粒vir基因的活化及高山离子芥悬浮胚性愈伤组织能否进入游离态的单细胞。乙酰丁香酮是vir基因天然的诱导剂。vir区基因受乙酰丁香酮等创伤诱导分子激活，vir区基因的活化和高效表达是根癌农杆菌Ti质粒向宿主细胞转移所必需的，并能提高根癌农杆菌的转化效率，从而提高根癌农杆菌介导的悬浮胚性愈伤的转化效率。
权利要求
1. 一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是(1)悬浮胚性愈伤的培养选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MS，添加外源激素为 6-BA、NAA 和 KT ；6-BA 的浓度为 0. 1-0. 3mg/L, NAA 的浓度为 0. 1-0. 2mg/L, KT 的浓度为0. 2-0. 3mg/L ；液体培养基的PH为5. 8-6. 0 ；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照 8-12小时，再连续黑暗12-16小时，温度为18-20°C，每隔6到9天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1 4，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)、50mg/L 利福平(Rifampicin，RFP)的 Yeast Extract Peptone (YEP)固体培养基上，28°C下培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含KanjlJ 福平的YEP液体培养基中，280C，避光，200rpm振荡培养过夜；取培养过夜的根癌农杆菌菌液转接到含相同抗生素的液体YEP培养基中，继续避光培养3-5小时，然后，以转速6000rpm 离心8min，收集菌液于离心管中，用分子枪吸液体基本培养基MS吹悬根癌农杆菌菌体，加入乙酰丁香酮，调整OD6tltl值为0. 5-0. 7备用；(3)根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤(1)中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部后，将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤，然后将三角瓶放入转速为40-50rpm的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均勻分布，温度为20°C，时间为20-30min ；(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织置于在无菌的滤纸上放干，保证菌液吸干，用无菌镊子接至含有乙酰丁香酮、PH为5. 8 6. 0 的固体培养基MS上，20°C暗培养3天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。
全文摘要
本发明涉及一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。本方法通过(1)悬浮胚性愈伤的培养；(2)菌株的活化及菌种的准备；(3)根癌农杆菌侵染；(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养，并采用GUS染色技术来鉴别转基因愈伤组织对外源基因的表达，在含有50μmol/L乙酰丁香酮的培养基上共培养的悬浮胚性愈伤组织经染色及脱色后在解剖镜下观察有大面积的细胞，呈蓝色，转化效率为80％左右。本发明操作比较简便，易于掌握，实施条件宽松，重复性高。
文档编号C12N5/10GK102344934SQ20101024135
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者安黎哲, 尚琛晶, 张华 , 樊小川 申请人:兰州大学