专利名称：大豆开花调节基因GmCIB4、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆开花调节基因GmCIB4、其编码蛋白及 其在植物光周期和开花时间调节中的应用。
背景技术：
大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂 等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区 域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约。如果能降低大豆对光周期 的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优 质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。虽然 通过传统的栽培和遗传育种的方法在一定程度上改变大豆的生长习性，也获得一些光周期 适应性较广的品种，但都没有从根本上改变大豆开花习性(赵存等，用光周期诱导法筛选 光钝感的大豆品种(系).大豆科学.1996，15(1) :42-47 ；陈洁敏和杨方人，播期对大豆开 花及产量的影响，大豆科学，1998，17 (3) 225-230 ；杨志攀和周新安，大豆光周期遗传育种 研究进展，中国油料作物学报，1999，21 (1) 61-73 ；栾晓燕，满为群，杜维广，陈怡，刘鑫磊， 大豆光钝感种质创新与光周期育种途径的研究，大豆科学，2004，23 (3) 196-199).其主要 原因是目前对大豆开花分子机理的了解甚少，从而导致很难从根本上解决大豆的开花习性 问题。对拟南芥开花分子机理的研究表明，植物的开花受四条途径的控制，即光周期途 径、自主途径、春化途径和赤霉素途径(Mouradov等，2002)，这些途径的信号最后都汇总到 两个主要的整合子FT和S0C1，从而促进开花(Suarez-Lopez P, Wheatley K, Robson F, Onouchi H,Valverde F,Coupland G,CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis. Nature, 2001,410 1116-20. ；Hepworth SR, Valverde F, Ravenscroft D, Mouradov A, Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOCl by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. EMBO J. 2002.21(16) 4327-37) 0隐花色素(cryptochrome)是从细菌到植物和动物三个物种 中都存在的蓝光受体，调控植物的生长发育和动植物的生物钟(Cashmore AR.，Cell 114 537-543(2003).。Lin C.，Shalitin D.，Annu Rev Plant Biol 54 469-496 (2003)) 植物 中至少含有两种隐花色素CRY1 和 CRY2(Guo H, Yang H, Mockler TC，Lin C.，Science279 1360-1363 (1998))。在拟南芥中CRYl主要调控蓝光控制的脱黄化作用，而CRY2主要调节开 花的光周期活动(KoornneefM，Heynh.，Z Pflanzenphysiol Bd 100 :147_160 (1980))。除拟 南芥外，还对藻类、苔藓、蕨类植物、番茄、油菜、豌豆和水稻中的隐花色素进行了相关研究。 这些研究表明，在被子植物中，隐花色素调控生长发育的方式与拟南芥中的相同(ImmelnD， Schlesinger R, J Biol Chem282 21720-21728. (2007) ；Imaizumi T, Kanegae T, WadaM., Plant Celll2 81-96. (2000). ；Imaizumi T, Kadota A, Plant Cell 14:373—386. (2002)； Ninu L，等，Plant J 18:551-556. (1999) ；Giliberto L，等，Plant Physiol 137:199—208.
3(2005). ；Chatterjee M, Sharma P, Plant Physioll4161-74. (2006). ；Platten JD, 等，Plant Physiol 139 1472-1482. (2005) ；Matsumoto N, Hirano T, Iwasaki T, Plant Physiol 133 1494-1503. (2003). ；Zhang YC，等，Plant J 46:971-983. (2006))。与其他的 光受体相似，隐花色素与其靶蛋白相互作用来调控基因的表达和生理反应(H. -Q. Yang等， Cell 103,815(2000) ；X. Yu等，Proc Natl Acad Sci U S A 104,7289(2007) ；M. F. Ceriani 等，Science 285,553(1999) ；Μ. Ni, J. Μ. Tepperman, P. H. Quail, Cell 95,657(1998))。在 植物体中，CRYs 禾口 CIBl (cryptochrome—interacting basic-helix-loop-helix)蓝光f衣赖 的相互作用是一个早期的光受体信号机制。CIBl蛋白在酵母和拟南芥中以蓝光特异的方式 与CRY2相互作用，并与其它CIBl相关的蛋白共同启动CRY2依赖的花形成。过表达CIBl的 拟南芥转基因植株的FTmRNA显著提高，表现为早花(H Liu等，Science 269,968(2008))。 发现大豆的两个隐花色素GmCRYla和GmCRY2a的表达和功能与拟南芥的隐花色素相似，两 者都影响蓝光抑制细胞的伸长，但是只有GmCRYla的降解依赖于蓝光和26S蛋白体。与拟 南芥隐花色素相反，GmCRYla而非GmCRY2a表现出很强的促进开花的活性，并且GmCRYla 的蛋白表达水平随生物钟的节律而波动。在大豆中GmCRYla是花周期调控的主要调节子 (Q. Z. Zhang.，等，Proc Natl Acad Sci 2046(2008))。因此推测同属双子叶植物的大豆中 的CIBs基因可能与GmCRYla相互作用来调节大豆的开花。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆开花调节基因GmCIB4、其编码蛋白及其在植物光周 期和开花时间调节中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种大豆开花调节基因GmCIB4编码的蛋白，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本发明还提供编码上述蛋白的大豆开花调节基因GmCIB4。前述的大豆开花调节基因GmCIB4，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。本发明还提供含有大豆开花调节基因GmCIB4的载体。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。本发明还提供含有大豆开花调节基因GmCIB4的转化植物细胞。本发明进一步提供大豆开花调节基因GmCIB4所述的基因在调节植物，尤其是大 豆和拟南芥光周期和开花时间中的应用。另夕卜，本发明提供一种用于扩增大豆开花调节基因GmCIB4的引物， 其包括正向弓丨物Fl :5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3‘。GmCIB4是从大豆中分离并获得功能鉴定的bHLH家族基因，其中的Gm为Glycine max(Linn)Merril 的首字母，CIB 为 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 的缩写。根据拟南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net网站中进行同源性比对，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB4的CDS序列在大豆基因组上的位置为Glymal6gl0620. 1，设计PCR扩增弓丨物，正向弓丨物5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆总 cDNA 为模板，进行 PCR 获得 GmCIB4 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。GmCIB4基因与拟南芥CIBl基因高度同源，其编码的蛋白质与拟南芥CIBl蛋白的 一致性达36.1%。(如图1所示)。将GmCIB4基因在拟南芥野生型中过表达，转化植株对光周期的敏感性降低，在长 日和短日下均早花。这表明，GmCIB4基因具有与拟南芥CIBl类似的功能，对开花的时间起 着重要的调节作用。GmCIB4基因有着重要的应用价值，过表达GmCIB4可以降低植物开花对光周期的 敏感性，可明显促进植物开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花 期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。
图1为本发明大豆CIB4蛋白与拟南芥CIB1蛋白的氨基酸序列对比，其中Gm CIB4 表示大豆CIB4蛋白，AtCIBl表示拟南芥CIBl蛋白；图2为拟南芥Col-O野生型与其转GmCIB4基因Tl植株的开花对比，其中，左侧表 示Col-O野生型植株，右侧表示转化植株；图3为拟南芥Col-O野生型与其转GmCIB4基因T2植株的在长日照(LD)条件下 开花对比，其中，左侧表示Col-O野生型植株，右侧表示转化植株；图4为拟南芥Col-O野生型与其转GmCIB4基因T2植株的在短日照(SD)条件下 开花对比，其中，左侧表示Co 1-0野生型植株，右侧表示转化植株。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 GmCIB4基因的分离克隆根据拟南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net网站中进行同源性比对，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB4的CDS序列在大豆基因组上的位置为Glymal6gl0620. 1，设计PCR扩 增弓丨物，正向弓丨物5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5' -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆总 cDNA 为模板，进行 PCR 获得 GmCIB4 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR 反应总体系为 25 μ L，包括大豆 cDNA (50ng) 1 μ L ；dNTP (2. 5mM) :2· 5 μ L ； 引物 Fl(IOyM) =IyL ；引物 Rl(IOyM) =IyL5LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3μ L ；IOX 缓冲 液:2· 5 μ L ；ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反应程序为94 "C 预变性 5min，95 "C 30s, 52. 5°C 30s, 72°C 2min，30 个循环；最后 72°C IOmin0实施例2 GmCIB4基因的分析鉴定GmCIB4的⑶S序列全长1647bp，编码一个548AA的蛋白，与拟南芥CIBl蛋白的同 源性为36. 1%。蛋白结构分析表明，其C端含有一个basic helix-loop-helix结构，该结
5构域为bHLH族转录调节因子的保守结构域，通过与DNA中的E-box结合，来调控基因的转 录；蛋白N端还含有一个NLS，该结构域与入核相关。根据在NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)上的序列查询结果，到目前为止，大豆中尚 无与CIBl相类似的序列信息；而且迄今也没有公开发表的涉及其功能研究的论文。因此认 为GmCIB4是大豆的一个新基因。实施例3转GmCIB4基因拟南芥的获得根据GmCIB4的序列信息，在其CDS两端设计PCR扩增引 物，正向弓丨物 5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘和反向引物 Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆总 cDNA 为模板，进行 PCR 获得 GmCIB4 全序 列。PCR 反应总体系为 25μ L，包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ;dNTP(2. 5mM) 2. 5μ L ； 引物 Fl(IOyM) =IyL ；引物 Rl(IOyM) 1 μ L ；LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3μ L ；IOX 缓冲 液:2· 5 μ L ；ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反应程序为95 "C 预变性 5min，94 "C 30s, 52. 5°C 30s, 72°C 2min，30个循环；最后72°C IOmin0重复上述PCR程序三次，将三次PCR产 物合并后进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收获得纯化的PCR产物。将PCR产物克隆到含有Gateway接头的pGWC载体(陈其军、王学臣等，使用与 Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆，2004. 31 (10)，951-954)上，经测序鉴定得到与 目的GmCIB4完全相同的序列。通过LR反应将GmCIB4构建至过表达载体pLeela上(购自 Invitrogen)，获得载体35S: :GmCIB4。将过表达载体35S: :GmCIB4导入农杆菌菌株GV3101 90RK(购自Invitrogen)中，通过农杆菌介导的蘸花法(Steven J. Clough and Andrew F.Bent.Floral dip :A Simpled Method for Agrobacterium—mediated Transformation of Arabidopsis thaiiana. Plant Journal. 1998. 16 (6)，735-743.)转化盛花期的拟南芥， 将转化植株收获的种子进行播种，播种7-10d后待子叶完全张开时喷洒稀释1000倍的除草 剂Basta (购自Chem Service Lot :395_85A)进行筛选，获得抗Basta的过表达GmCIB4的 拟南芥转基因植株15株。实施例4 GmCIB4基因功能分析按照实施例3的方法获得的15株GmCIB4拟南芥转基因植株，其Tl植株表现为早 花(图2)。选择5株转基因植株分别种植在长日照和短日照条件下观察其开花时间，T2植 株在长日和短日下均为早花(图3和图4)。表明转化植株对光周期的敏感性降低，说明了 GmCIB4基因具有与拟南芥CIBl类似的功能，对开花的时间起着重要的调节作用。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种用于扩增大豆开花调节基因GmCIB4的引物，其包括正向引物F15′ ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG 3′和反向引物R15′ TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG 3′。
2.大豆开花调节基因GmCIB4编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 2 所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求2所述蛋白的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.含有权利要求5所述载体的宿主细胞。
7.含有权利要求3或4所述基因的转化植物细胞。
8.权利要求3或4所述的基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述的植物为大豆。
10.如权利要求8所述的应用，其中所述的植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种大豆开花调节基因GmCIB4及其编码蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。过表达大豆开花调节基因GmCIB4可明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。
文档编号C12N15/63GK101921754SQ20101024104
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者孟颖颖, 李宏宇, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所