专利名称：提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法
技术领域：
本发明涉及一种粘红酵母菌种(Rhodotorula glutinis)以及利用壳聚糖 (chitosan)诱导培养提高该菌种对水果采后病害防治效力的方法。
背景技术：
水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，已成为全球关注的问 题。据报道，发达国家由此造成的损失为10% _25%，而在缺乏冷藏设施的发展中国家则高 达40%-50%，我国水果采后损失为20%-25%左右。2007年3月国家统计局发布的《中华 人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050 万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达到数百亿元人民币的水平。病原微生物侵染造成的腐烂是水果采后损失的主要原因，这些病原微生物主要 有灰葡萄抱(Botrytis cinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉(Penicillium spp·)、毛霉(Mucor spp.)、链格抱(Alternaria spp.)禾口曲霉(Aspergillus spp.)等。 病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于 许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青 霉(P. expansum)产生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢(B. cinerea)产生的葡双醛霉素 (botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低 温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果 的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。 而那些对低温敏感的水果只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏。长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害 可以起到立竿见影的效果，但是，长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性，同 时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院(National Academy of Scinces)的 一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致瘤危险。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增 强，目前多种化学杀菌剂(如CaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果产品 上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各 国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。 当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成 果，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬 贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防 治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效 价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并 对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。其中粘红 酵母已被证明能有效控制水果采后病害。国外方面，Sansone等从苹果表面分离得到的粘红 酵母对由Botrytis cinerea引起的灰霉病有显著的防治效果，在实验室条件下，其腐烂率 与对照相比降低了 54%。Calvente等的研究也发现粘红酵母对水果采后青霉病害有显著 的抑制效果。国内方面，郑晓冬等在体外和体内抑菌试验中研究了粘红酵母对由指状青霉 引起的柑桔青霉腐烂的抑制效果，发现粘红酵母在控制由指状青霉引起的柑桔腐烂中显示 出了很高的抑菌活性，在25°C条件下，对照的发病率为100%，而使用IXlO8个/mL的菌悬 液的发病率仅为45%，而且随着酵母浓度的提高，发病率也有逐渐下降的趋势。张红印等研 究了粘红酵母对草莓采后灰霉病的抑制效果，对草莓进行了前期的预处理后，接种IXlO9 个/mL的菌悬液和1 X IO5个/mL的病原菌孢子菌悬液分别在4°C下贮藏7d和20°C下贮藏 2d后，发现接种粘红酵母的草莓，其腐烂率与对照相比分别降低了 95%和94. %，。然而大量的研究也表明，粘红酵母对果实病害的防治效力与化学杀菌剂相比仍有 较大的差距。因此进一步提高粘红酵母的拮抗效力，是提高其对水果采后病害控制水平，并 将其应用于水果贮藏保鲜的重要策略之一。壳聚糖是β_(1，4)_葡糖胺的多聚体，是几丁质脱乙酰产物。作为一种可生物降 解的天然物质，壳聚糖不仅资源丰富，而且价格低廉、无毒安全。因其具有众多独特的生物 学特性，在食品和水果采后保鲜等领域都有着广泛的研究和应用。在水果采后保鲜领域，壳聚糖被作为理想的水果涂层，用来延缓果实成熟衰老， 维持水果采后品质。研究表明壳聚糖对多种病原菌有直接的拮抗活性，如，桃果实的 Monilinia fructicola、葡萄果实的 B. cinerea、相禾S果实的 P. digitatum 禾口 P. italicum。近年来，如何将壳聚糖与其它安全的非杀菌剂方法有效整合，以获得对水果采 后真菌病害更高水平的控制，已成为国际上非常受关注的一个研究热点。El-Ghaouth 等(2000)报道，采后拮抗酵母Candida saitoana与壳聚糖衍生物联合处理能对苹果青 霉病和灰霉病及柑橘绿霉病产生协同增效的控制效果。Yu等(2007)也报道拮抗酵母 C. Iaurentii与壳聚糖联合处理能对苹果青霉病产生协同增效的控制效应。但国内外对壳 聚糖培养能否影响采后拮抗酵母生物防治效力尚无相关报道。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，在培养基中添加不同浓度的壳聚糖，对 粘红酵母进行诱导培养，提供了一种提高粘红酵母生物防治效力的方法。经壳聚糖诱导培 养的粘红酵母，可以明显地抑制水果病原菌，防止水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成 本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的 损失。本发明同时提供了一种利用壳聚糖诱导培养粘红酵母，进行水果采后病害防治及 贮藏保鲜的方法。步骤如下将粘红酵母活化，接种到添加有以质量计为0. 01% -1%壳聚 糖的NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然)培养基中进行诱 导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成IX IO6个/mL-1 X IO9个/mL的菌悬液； 将水果放入菌悬液中，浸泡30s后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放 在室温或冷藏条件下存放。
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本发明利用壳聚糖诱导培养粘红酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜的方法。 适合于梨果、桃果、草莓、苹果的采后病害防治及贮藏保鲜通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本 发明并不受这些实施实例的限制。
图1为不同浓度壳聚糖诱导后的粘红酵母对草莓灰霉病的抑制效果，注CK:对 照；0 =NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 壳聚糖的培养基。发病率及病斑直径是20°C放置3d 后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P = 0. 05)。图2不同浓度壳聚糖诱导后的粘红酵母对草莓根霉病的抑制效果，注CK 对照； 0 =NYDB ；0. 01-1 添加0.01%-1%壳聚糖的培养基.20°C放置3d后测定的结果。不同字母 代表差异显著性(P = 0. 05)。图3不同浓度壳聚糖诱导后的粘红酵母对桃青霉病的抑制效果，注CK 对照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 壳聚糖的培养基.25°C放置测定的结果。不同字母代表差 异显著性(P = 0. 05)。图4不同浓度壳聚糖诱导后的粘红酵母对桃灰霉病的抑制效果，注CK 对照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 壳聚糖的培养基.25°C放置测定的结果。不同字母代表差 异显著性(P = 0. 05)。病斑直径在第6d测定。图5不同浓度壳聚糖诱导后的粘红酵母对桃根霉病的抑制效果，注CK 对照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0.01%-1%壳聚糖的培养基.25°C放置3d后测定的结果。不同字母代 表差异显著性(P = 0. 05)。
具体实施例方式在本发明的具体实施方式
中如无特殊说明，所有添加量的百分比，均以质量计，下 面对此不再赘述。粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，于NYDA (NYDB培养基的基础上添加以质量计 为2%的琼脂)培养基4°C低温保存。培养程序为(1)固体活化将粘红酵母接种于NYDA 培养基中，在28°C培养48h ； (2)液体培养在250ml的三角瓶中装入50ml的NYDB种子培养 基，用接种环接入一环活化好的粘红酵母，在200rpm，28°C条件下培养20h ； (3)诱导培养 将上述培养混合物7000 Xg条件下离心lOmin，无菌蒸馏水洗涤两次，以去除培养介质，并 用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5 X IO8个/mL。在250ml的 三角瓶中分别装入50ml NYDB培养基或壳聚糖补充培养基(在NYDB中添加0. Ol%、0. 1%, 0.25%、0.5%及壳聚糖)，并加入上述浓度的酵母细培养液Iml，然后在200rpm，28 °C条 件下培养24h ;(4)离心分离再悬浮上述不同处理酵母培养混合物在7000Xg条件下，离 心10-15min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用 血球计数板调节酵母细胞浓度为1 X IO9个/mL，再用灭过菌的生理盐水稀释到所需浓度。实施例1 壳聚糖诱导培养粘红酵母对水果病害的抑制效果一、试验方案水果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口。其中草莓的表面伤口为3mm(直径)X3mm(深)，桃果的表面伤口为5mm(直 径)X 3mm(深)。每个伤口处等量加入30 μ 1(1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液；(2)经壳 聚糖补充培养基(NYDB+chitosan)培养的酵母悬浮液；(3)无菌水(作为对照)。2h后，在每 个伤口处加入等量30 μ 1的病原菌孢子(B. Cinerea浓度为IX IO5SporeS πιΓ1 ；P. expansum 浓度为5X104spores/mL，R. stolonifer浓度为1 X 104spores/mL)。自然晾干后，将果实放 入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(水分活度95% )，草莓置于20°C，桃果置于 25 °C。每处理重复3次，每个重复18个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养，用 游标卡尺测定水果病斑，记录病斑直径并计算发病率，以此评价R. glutinis的抑菌效果。 发病率的计算公式如下发病率(％ ) =Σ发病的果实/接种病原菌的果实总数X100%二、试验结果按照上述步骤试验，后统计水果的腐烂率结果如下1. 1对草莓灰霉病及根霉病的抑制效果粘红酵母经壳聚糖诱导培养后，其对灰葡萄孢在草莓伤口处的侵染抑制作用显著 增强(说明书附1、图2)，尤其当诱导量为0. 5 %时，酵母菌悬液处理草莓后其灰霉病的 发病率仅为对照的37%，为未经壳聚糖处理的43%。且当壳聚糖添加量在0.01-0. 5%的范 围内，对灰霉病的抑制作用呈直线递增趋势。粘红酵母对葡枝根霉在草莓伤口处的侵染抑 制作用也出现了类似的结果。1.2对桃果青霉病、灰霉病及根霉病的抑制效果如说明书附3所示，添加0. 5%壳聚糖诱导培养后的粘红酵母，对桃果伤口青 霉病侵染的抑制效力显著增强，主要表现在整个试验阶段桃果青霉病发生率均显著低于经 NYDB培养基培养的粘红酵母处理的桃果。在对桃果伤口灰霉病及根霉病的抑制作用上也出 现了类似的结果(说明书附4，说明书附5)。试验结果表明通过添加壳聚糖诱导培养能显著提高粘红酵母对草莓及桃果由灰 葡萄孢、葡枝根霉及扩展青霉引起的病害的控制效力，最佳诱导量为0. 5%。实施例2 壳聚糖诱导培养粘红酵母对水果自然腐烂及贮藏品质的影响一、试验方案试验水果采摘后直接用以下处理浸泡果实30s (I)NYDB培养基培养的粘红酵母 悬浮液；(2)壳聚糖补充培养基(NYDB+chitosan)培养的的酵母悬浮液；(3)无菌水(作为 对照)。然后将果实放在塑料筐内，风干后用保鲜膜密封。草莓贮藏于4°C冰柜，20d后转 入20°C恒温箱贮藏，7d后观察果实腐烂情况，计算腐烂率；桃果贮藏于4°C冰柜，30d后转入 250C，7d后观察果实腐烂情况，计算腐烂率，并进行贮藏品质分析。每处理重复3次，每次重 复10个果实，整个试验重复2次。贮藏品质分析方法如下(1)硬度采用TA_XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测 试后的运行速度分别为4. Omm s^U.Omm ^T1J. Omm S、草莓测试深度为6mm，桃果及梨果测 试深度为10mm，探头插入水果时所受的最大阻力(单位为牛顿)就被定义为水果的硬度。 每个水果绕赤道处每120°测定3次。
(2)总可溶性固形物采用WYT(0_80% )手持糖量计进行测定，测定结果表示为 g/100g 样品。(3)维生素C含量的测定紫外快速测定法。从6个水果上取20g果肉样品加20ml 盐酸勻浆，50ml容量瓶定容至刻度。10000Xg，4°C条件下离心lOmim，上清用于测定。
取0. 4ml提取液，放入盛有0. 8ml 10% HCl的IOml刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度后摇 勻。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。另吸取0. 4ml提取液，分别加入4ml蒸馏水 和1. 6ml Imoir1NaOH溶液至IOml至刻度试管，摇勻，静置15min后。加入1. 6ml 10% HCl， 混勻，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。由待测液及碱处理 待测液的A243值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。每处理3次重复。(4)褐变度6个水果称取20g果肉组织，加入40ml蒸馏水勻浆，10000Xg，4°C条 件下离心lOmim，取上清IOml加入95%乙醇15ml 10000 X g，4°C条件下离心lOmim，取上清 液于420nm测定吸光度值，以此表示褐变程度。每处理3次重复。二、试验结果按照上述步骤试验，统计草莓及桃果的自然腐烂率及贮藏品质的影响结果如下表1壳聚糖诱导后的粘红酵母对草莓自然腐烂率及储藏品质的影响 备注0 =NYDB培养基培养的粘红酵母；0. 5 添加0. 5 %的壳聚糖诱导培养的粘红 酵母。上述表中的发病率和品质测定时在4°C放置20d后转入20°C放置7d后测定的结果。 不同字母代表差异显著性(P = 0. 05)。如表1所示，粘红酵母经0. 5%壳聚糖诱导培养后，对草莓自然腐烂的抑制作用显 著，草莓的腐烂率仅为对照的47%，且显著地低于未经诱导培养的粘红酵母处理的草莓的 腐烂率。与未诱导培养的粘红酵母相比，经0.5%壳聚糖诱导培养的粘红酵母对草莓的硬 度、可溶性固形物、Vc含量、褐变度均不产生有害影响。表2壳聚糖诱导后的粘红酵母对桃果整果储藏品质的影响 注0 =NYDB培养基培养的粘红酵母；0. 5 添加0. 5%的壳聚糖诱导培养的粘红酵 母。上述表中的发病率和品质测定时在4°C放置30d后转入20°C放置7d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P = 0. 05)。0.5%壳聚糖诱导培养粘红酵母，对桃果自然腐烂的抑制作用显著，其处理的桃果 自然腐烂率约为未经壳聚糖诱导培养的R. glutinis处理的桃果腐烂率的55%。同时，经 0.5%壳聚糖诱导培养粘红酵母处理的桃果，其可溶性固形物含量及褐变度与对照桃果相 比，无显著差异，其硬度及Vc含量显著增加，对各项品质指标均不产生有害影响(表2)。以上试验结果表明壳聚糖诱导培养后粘红酵母对草莓及桃果自然腐烂病害的发 生有显著的抑制作用，并且对水果贮藏品质没有产生不利影响。
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权利要求
提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于步骤如下将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)活化，接种到添加有以质量计0.01％ 1％壳聚糖的NYDB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×106个/mL 1×109个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30s后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
2.权利要求1所述提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其 中所述的NYDB培养基组成为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水IOOOml，pH自然。
3.权利要求1所述提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其 中所述的水果为梨果、桃果、草莓或苹果。
全文摘要
本发明公开了提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法。将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)活化，接种到添加有0.01％-1％壳聚糖的NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然)培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×106个/mL-1×109个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30s后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。本发明使用壳聚糖诱导培养后的粘红酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号A23B7/155GK101911968SQ201010240638
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者任晓锋, 张红印, 葛玲玲, 陈克平 申请人:江苏大学