专利名称：一种肠球菌属及毒力基因多重pcr检测引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种多重PCR检测引物及方法，具体涉及一种肠球菌属及毒力基因多 重PCR检测引物及方法。
背景技术：
肠球菌院内感染在世界范围内发生。美国每年大约有200万人感染肠球菌，主要 是住院病人感染，每年大约有88000人死于肠球菌感染，因肠球菌感染的花费大约在4. 5亿 美元；2005年英国就有7066人发生肠球菌菌血症，2004年增加了 8 %。与医院内感染不同， 感染动物的肠球菌报道较少，但肠球菌可引起包括家畜、家禽、狗、猫和鸟广范围的感染，造 成较大的经济损失。AS (聚集物质)是质粒编码的能够介导供体菌和受体菌有效结合、有利于质粒转 换的细菌黏附素，可增加细菌在肾小管上皮细胞和心内膜细胞的粘附，能增强肠上皮细胞 的内化，并已被证明在心内膜炎的动物模型中增加心脏瓣膜赘生物的数量。cylA(溶细胞素 A)编码激活因子A，该激活因子是溶血素cyl发挥致病作用所必须的。cyl能溶解真核细胞 和原核细胞，在动物模型中已经证实溶细胞素可以显著促进心内膜炎和眼内炎的恶化，加 强其感染的严重程度，同时也会加重人类肠球菌疾病的严重程度。Esp(肠球菌表面蛋白) 有助于肠球菌的免疫逃逸，从而增强其致病力。在动物模型中，esp有助于粪肠球菌在泌尿 生殖道感染中的集聚和繁殖生长。而肠球菌感染人和各种动物与这三种肠球菌主要的毒力 因子有重要的关系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物及 方法。本发明的技术方案是一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物，它的序列如 下肠球菌属引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；聚集物质引物的序列如下上游引物ASA 1:5' -GCTCGCTATTACGAACTATGA-3 ‘；下游弓丨物ASA2 5 ‘ -TATGAAAGAACATCACCACGA-3 ‘；溶血素引物的序列如下上游引物cylAl:5' -ACACGGGGATTGATAGGC-3‘；下游引物cylA2:5' -GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3‘；肠球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Espl:5' -AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3‘；
下游引物Esp2:5' -AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3 ‘。利用肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品 的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，所述PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份2 X PCR TaqMix10 μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1模板 DNA2 μ 1dd H2O5 μ 1_总体积25 μ 1所述PCR反应程序为95°C预变性 5min ；94°C变性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s，共 30 个循 环；72°C 终止 IOmin。本发明的有益效果是本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌属及其主要毒力基 因的多重PCR方法。本方法特异性高；敏感性实验表明该方法最低能检测到IOOpg DNA0为 肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌致病机制机制、早期预防提供了一种新的快 速检测方法，同时构建的标准质粒也为未来建立实时荧光定量PCR方法提供了基础。本发明的检测结果，将190株疑似菌株，其中，70株分离自患病猪组织病料；60株 分离自健康猪粪便；60株分离自零售鲜猪肉分别进行多重PCR，结果显示cylA (溶血素A 基因)检出率分别为83.9%、65.9%、38.8%，AS(聚集物质基因)检出率分别为26.4%、 14. 2%U6. 7%, esp(肠球菌表面蛋白基因)检出率分别为55. 4%U4. 3%U5. 7%。
图 1 为 PCR 方法初步建立，其中，M:DL2000DNAMarker，l-5 :N9 株，16S rRNA, CylA, esp，AS，空白对照；图2为16S rRNA及毒力因子四重PCR敏感性试验结果，其中，M DL2000DNAMarker ；1-7 :50ng/ul, 5ng/ul, 500pg/ul, 50pg/ul, 5pg/ul, 0. 5pg/ul,0. 05pg/ ul.8 空白对照；图 3 为 PCR特异性扩增结果，其中，M:DL2000DNA Marker 1-9 :N9 株、N30、N10、N5、 N25、N7、N1、N42和空白对照；图4为肠球菌16S rRNA、cylA、esp和AS重组质粒鉴定结果，其中，Ml λ -EcoT14 I digest Marker, 1-4 肠球菌 16S、cylA、esp 和 AS 基因酶切，M2 DL2000DNAMarkero
具体实施例方式实施例本发明的技术方案是一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物，它的序列如 下
肠球菌属引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；聚集物质引物的序列如下上游引物ASA1:5' -GCTCGCTATTACGAACTATGA-3 ‘；下游引物ASA2 5 ‘ -TATGAAAGAACATCACCACGA-3 ‘；溶血素引物的序列如下上游引物cylAl:5' -ACACGGGGATTGATAGGC-3‘；下游引物cylA2:5' -GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3‘；肠球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Espl:5' -AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3 ‘；下游引物Esp2:5' -AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3 ‘。利用肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品 的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，
所述PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份 2 X PCR TaqMix10 μ 1
引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1
引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1
模板DNA2 μ 1
dd H9O5 μ 1
总体积25 μ 1
所述PCR反应程序为
95°C预变性 5min ；94°C变性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s，共 30 个循 环；72°C 终止 IOmin。本发明的详细步骤如下1 材料1. 1试验菌株肠球菌Nl、N7、N5、N9、m0、N25、N30 和 N42。单重 PCR 鉴定毒力基因 esp、cylA 和 AS，其中 N9-esp、cylA 和 AS (+)、N5_AS 和 cylA(+) ,NlO-AS 和 esp (+)、N30_esp 和 cylA(+)、 Nl-AS (+)、N7-esp (+)、N25_cylA (+)、N42_esp、cylA 和 AS (-)。用以上菌株做毒力基因阳性 和阴性参考菌株。这些菌株均于50%甘油中在-70°C下由本实验室保存，使用时用兔鲜血 平板活化。1. 2主要仪器微量加样器EppendorfPTC-200 型 PCR 仪MJ RESEARCH3K30型冷冻离心机德国sigmaS2-93自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂DYCP-31B型电泳槽北京六一仪器厂
DYY-111-6B 型电泳仪sp-D垂直净化工作台SIM-F124 制冰机Alphalmager 2200 型凝胶成像仪水浴恒温振荡器 有限公司，SHA-C型78-1磁力加热搅拌器 有限公司1. 3主要试剂琼脂糖Proteinase K溶菌酶
公司苯酚/氯仿/异戊醇25 24 1 限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 有限公司X-gal、限制性内切酶BamH I 连)有限公司IPTG、DNA Marker 连)有限公司2 X PCR TaqMix
有限公司pTG19-T 载体 限公司GoldView 公司脑-心浸萃液态培养基(BHI) 有限公司其他试剂基因工程菌E. co 1 i DH5 α1. 4主要溶液和培养基的配制(1)脑-心浸萃液态培养基(BHI)取9g状培养基，加入250ml单蒸水，使用磁力搅拌器加热搅拌至完全溶解，121°C 高压灭菌20min。(2)溶菌酶用灭菌10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)立即溶解溶菌酶，配制成50mg/mL浓度的贮存 液，-20°C保存备用。(3)蛋白酶 K:
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用高压灭菌的50mmol/L Tris (pH8. 0)和1. 5mmol/L乙酸钙溶液配制成浓度为 20mg/mL的溶液。-20°C保存备用。(4)2mol/LNaCl 在800mL单蒸水中溶解117. OgNaCl，然后定容至1L，分装后121°C高压灭菌 20mino(5) 50 X Tris-乙酸(TAE)242g Tris、57. Iml 冰醋酸、IOOml 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，加单蒸水定容至 1000ml，使用前稀释成1XTAE。(6)0. IM CaCl2 取l.lg CaCl2，容于90ml灭菌三蒸水中，定容至100ml，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，
4°C保存备用。(7)氨苄青霉素(Ampici 11 in，Amp)贮存液用灭菌三蒸水将氨苄青霉素配成100mg/ml，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，分装成小 份，-20°C保存备用。(8) IPTG 溶液将固体IPTG用灭菌三蒸水溶解，配成终浓度为100mg/ml，用0. 22 μ m滤器过滤除 菌，分装于-20°C保存备用。(9)X_gal 溶液用二甲基甲酰胺(DMF)溶解固体X-gal，配制其浓度为20mg/ml，保存于棕色瓶内 或用铝箔避光保存，贮存于-20°C备用。(10) LB液体培养基取IOg细菌培养用的胰化蛋白胨(bacto-teyptone) (0xoid Ltd公司产品)、5g细 菌培养用的酵母提取物(bacto-yeat extract) (Oxoid Ltd公司产品)、10g NaCl，加800ml 灭菌三蒸水搅拌使溶质完全溶解，用lOmol/LNaOH调节pH值至7. 0，定容至1000ml，分装至 试管，每管5ml，121°C灭菌20min，4°C保存备用。(Il)LB固体培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1. 5% (w/v)。121°C灭菌20min，冷却 至55°C左右时，无菌倒入灭菌平皿，凝固后4°C保存备用。(12)氨苄青霉素琼脂平板待琼脂培养基温度降至55°C左右时，加入氨苄青霉素，使终浓度为100μ g/ml，混 勻，无菌倒入灭菌平皿，凝固后4°C保存备用。(13) Solution I 溶液:IM Tis-HCL (ρΗ8· 0) 25ml，0. 5M EDTA (pH8. 0) 20ml, 20 % Glucose (1. 1M) 45ml，加去 离子水定容至1L，高压灭菌后4°C保存备用。使用前每50ml的Solution I中加入2ml的 RNase(20mg/mL)。(14) Solution II 溶液10% SDS 50ml, 2N NaOH 50ml，加灭菌三蒸水定容至500ml，充分混勻，室温保存。(15) Solution III溶液:KOAc 147g, CH3COOH 57. 5ml，加入 300ml 去离子水搅拌溶解，定容至 500ml，121 °C
7灭菌20min，4°C保存备用。2 方法2.1模板的制备2.1模板的制备按照MeSSick[128]报道的方法进行常规酚/氯仿抽提，并稍加改进，具体操作如下(1)细菌培养将试验菌株接种于5ml BHI液体培养基中，37°C摇床(300rpm)培 养过液。(2)细菌收集取1. 5ml培养物于1. 5ml EP管中，室温IOOOOrpm离心5min，弃上 清，沉淀重新悬浮于Iml ΤΕ(ρΗ8· 0)中(用ddH20也行)。(3)菌体裂解加入10μ 1 50mg/ml的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaCl 50 μ 1，10% SDSllOy l，20mg/ml 的 Proteinase K 10 μ 1，50°C作用 3h。(此时菌液应为透 明粘稠液体)(4)抽提将菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)，混勻，室温放置lOmin。12000rpm离心lOmin。反复抽提两到三次。(上清 很粘稠，吸取时应小心，最好剪去枪头尖)。(5)沉淀加0. 6倍体积的异丙醇，混勻，室温放置IOmin0 12000rpm离心IOmin0(6)洗涤用75%乙醇洗涤沉淀。(7)抽(凉)干后，溶于50 μ 1灭菌三蒸水，取6 μ 1电泳检测，剩余样品放于_20°C 保存，作PCR模板用。2. 2引物选择与合成属特异性引物参考试验一，根据GenbanK公布的cylA(溶血素A)、AS(聚类物质) 和esp (表面蛋白)基因序列设计三种毒力基因检测引物，由上海博尚生物技术有限公司合 成。见表1。表1属特异性引物和毒力因子基因引物序列
项目引物序列(5'-3’)产物长度(bp)Enterococcus spp.ElGTGTCGCTGATGGATGG1096E2GCAAGCCGAACTGAGAGAAS(聚集物质>ASAlGCTCGCTATTACGAACTATGA375ASA2TATGAAAGAACATCACCACGAcylA(溶血素)cylAlACACGGGGATTGATAGGC688cylA2GCAGCTAAAGCTGCGCTTEsp(肠球菌表面蛋白)EsplAGTTTTCATCTTTGATTCTTGG510Esp2AAATGATTCTTTAGCATCTGG2. 3PCR扩增与回收纯化2. 3. IPCR 反应体系2 X PCR TaqMix10 μ 1
8
模板DNA2 u l
dd几05 lX l
总体积25 u l
其中2×PCR／aqMix组成为0．2U Taq DNA Polymerase／u l；400 u M dNTP each；20mM／riS—HCl，PH 8．7；100mM KCl；3mM MgCl，。
2．3．2PCR反应
PCR扩增在PCR仪(P／C一200型)上进行，反应程序如下
95℃预变性5min
72℃终止10min
用三蒸水作为空白对照。
2．3．4PCR特异性试验用菌株N5、N10、N30、N1、N7、N25和N42的DNA做模板按上述PCR方法做特异性试验，以三蒸水做空白对照。[Ol54] 2．3．5PCR灵敏性试验肠球菌N9株的DNA模板经ND一1000微量紫外可见分光光度计(／hermo)测定含量后，用三蒸水进行倍比稀释，设定含量分别为lmg、100ng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg，按确定的扩增体系和扩增条件进行扩增，以出现特异扩增带的模板用量的最高稀释倍数计算可检出的肠球菌最低DNA含量。
2．3．6PCR扩增结果判定取lo u l PCR产物，经含GoldView的1．5％琼脂糖凝胶电泳，以MarkerDL2000为分子量对照。并用Alphalmager”2200型凝胶图像分析系统拍摄。
(1)在长波紫外灯下，用干淨刀片切下所需回收的含有目的DNA的凝胶，尽量切除不含目的DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。[Ol59] (2)将切下的含有目的DNA的凝胶放入1．5mL离心管，称量出凝胶重量。
(3)加三倍体积溶胶／结合液DB(如凝胶0．1g其体积可视为100 u l，则加入300 u l溶胶液)。
(4)56℃水浴放置10min(或直至胶完全溶解)。每2—3min涡旋震荡一次加速溶
PCR扩增在PCR仪(PTC-200型)上进行，反应程序如下 95°C预变性5min
94°C变性 56 °C退火
30 s 1 min
共30个循环72°C延伸Imin IOs72°C 终止IOmin用三蒸水作为空白对照。2. 3. 3PCR方法的建立以单重PCR阳性分离株N9株做标准株，加入四种引物做四重 PCR,单重PCR结果做对照，三蒸水做空白对照，初步建立多重PCR方法。2. 3. 4PCR特异性试验用菌株N5、ΝΙΟ, N30、Ni、N7、N25和N42的DNA做模板按上 述PCR方法做特异性试验，以三蒸水做空白对照。2. 3. 5PCR灵敏性试验肠球菌N9株的DNA模板经ND-1000微量紫外可见分光光度 计(Thermo)测定含量后，用三蒸水进行倍比稀释，设定含量分别为lmg、lOOng、10ng、lng、 100pg、10pg、lpg，按确定的扩增体系和扩增条件进行扩增，以出现特异扩增带的模板用量 的最高稀释倍数计算可检出的肠球菌最低DNA含量。2. 3. 6PCR扩增结果判定取10 μ 1 PCR产物，经含GoldView的1. 5%琼脂糖凝胶电 泳，以MarkerDL2000为分子量对照。并用Alphalmager 2200型凝胶图像分析系统拍摄。2. 3. 7PCR产物纯化、回收按照百泰克快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)要求回收，具体操作 步骤(1)在长波紫外灯下，用干净刀片切下所需回收的含有目的DNA的凝胶，尽量切除 不含目的DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。(2)将切下的含有目的DNA的凝胶放入1. 5mL离心管，称量出凝胶重量。(3)加三倍体积溶胶/结合液DB(如凝胶0. Ig其体积可视为100 μ 1，则加入 300 μ 1溶胶液)。(4) 56°C水浴放置IOmin (或直至胶完全溶解)。每2 3min涡旋震荡一次加速溶
9解。(5)每IOOmg最初的凝胶重量加入150 μ 1的异丙醇，震荡混勻。(此步可以提高 回收率)(6)将上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，12000rpm离心 45s，弃去收集管中废液。(7)加入700 μ 1漂洗液WB (先加入无水乙醇)，12000rpm离心lmin，倒掉废液。(8)将吸附柱AC放回收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液WB，以免体系 中残留的乙醇抑制下游反应。(9)取出吸附柱AC，放入一个干净的EP管，在吸附膜中间部位加入50 μ 1洗脱缓 冲液EB (先在65 70°C水浴中加热洗脱缓冲液效果更好)，室温放置2min，12000rpm离心 lmin。若需要较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心lmin。2. 416SrRNA基因的克隆、鉴定2. 4. IPCR产物与T载体的连接参照上海捷瑞生物工程有限公司T载体使用说明书进行，将3种回收纯化的PCR 产物分别与PTG19-T载体相连，连接反应体系如下PTG19-T vector2. 0 μ 1纯化PCR 产物4. Ομ 10XT4bufferΙ.ΟμΙT4DNA LigaseΙ.ΟμΙdd H2O2· 0 μ 1_总体积10. Ομ 瞬时高速离心混勻，4°C连接过夜；可直接将连接产物用于转化。2. 4. 2感受态细胞的制备(1)将冻存的大肠杆菌DH5ci在LB平板培养基上划线培养14h，挑取单个菌落接 种于LB液体培养基，370C 200rpm震摇培养13h。(2)取上述培养物200 μ 1接种于5ml LB液体培养基中，37 °C 200rpm震摇2h。(3)取1. 5ml分装至无菌大EP管中，冰浴15min，4°C 5000rpm离心5min，弃上清收
集菌体。(4)用预冷的CaCl2 (0. 1M，高压灭菌)500 μ 1悬浮菌体，轻轻吹打混勻，冰浴 30mino(5) 4°C 5000rpm离心5min，弃上清收集菌体，再次用预冷的CaCl2IOOy 1重悬菌 体，轻轻吹打混勻，即为感受态细胞。(6) 4°C放置2h，感受态细胞直接用于转化。2. 4. 3重组质粒的转化参考萨姆布鲁克的方法(萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验 指南[M]，第三版，科学出版社，2002.)并稍加改进，具体步骤如下取DH5a感受态细胞100 μ 1，加入连接产物5 μ 1，冰浴30min，42°C热激90s，迅 速冰浴2min，无菌加入Iml不含抗生素的LB液体培养基，37 °C 250rpm振荡培养lh，使菌液复苏并表达抗性，5000rpm离心5min，弃去上清液，剩余200 μ 1重悬沉淀，再加入40 μ 1 X-gal (20mg/ml)和8 μ 1 IPTG (200mg/ml的异丙基硫代-β -半乳糖苷)，混勻，均勻涂布于 含50μ g/mlAmp的LB固体培养基上，超净工作台上吹干，37°C培养16h。取出放置4°C 3h， 蓝白斑颜色对比更加明显。2. 4. 5小量重组质粒的提取(1)从上述转化培养的固体培养基中挑取2个白色单个菌落，分别接种于含 100 μ g/mlAmp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜，取4. 5ml菌液12000rpm离心lmin， 弃上清，收集菌体。(2)加入S I溶液150 μ 1，剧烈振荡或吹打混合均勻。(3)加入S II溶液300 μ 1，上下快速颠倒5次，_20°C放置5min。(4)加入225 μ 1预冷的S III溶液，轻轻颠倒混勻，_20°C放置5min。(5) 4°C 12000rpm 离心 5min(6)吸 650 μ 1 上清至另一 EP 管，4°C 12000rpm 离心 3min。(7)吸600 μ 1上清至新EP管，加入300 μ 1 Tris饱和酚和300 μ 1氯仿，上下颠 倒，4°C 12000rpm 离心 5min。(8)小心吸取上清液500 μ 1至另一新EP管中，加入500 μ 1氯仿，4°C 12000rpm离 心 5min。(9)取上清400 μ 1至另一 EP管中，加无水乙醇800 μ 1，上下颠倒混勻，静置 2min, _20°C放置 20min。4°C 12000rpm 离心 lOmin，弃上清。(8)加Iml 70%乙醇，上下颠倒，12000rpm离心2min后，弃上清。(9)吸水纸吸干管壁残留乙醇，30 μ 1 TER溶解沉淀(勿吹打)，37°C放置30min， 取2μ 1电泳检测。-20°C保存。2. 4. 6重组质粒的鉴定PCR鉴定对菌液和质粒分别PCR扩增鉴定，反应体系及反应的程序同上。反应结 束后，取8 μ 1产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定取提取的重组质粒，用BamHI酶切鉴定，酶切反应体系如下重组质粒10 μ 1dd H2O7 μ 1IOXBuffer2μ 1BamH I1 μ 1_总体系20 μ 1混勻后37°C酶切反应3h，取8μ 1酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。2. 5核苷酸序列测定及分析将鉴定正确的4株重组菌，由北京博尚生物技术有限公司测序，测定的DNA序列以 双链碱基互补的结果为准。将测的4个基因序列与GenBank数据库中序列blast。3结果与分析3. IPCR的初步建立单重PCR阳性株N9做标准株，加入四种引物做四重PCR，单重PCR结果做对照，三蒸水做空白对照进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，扩增结果见图1。由图可知，四重PCR扩增出期望的目的片段，取得良好的扩增结果，与单重PCR结 果一致，且省时省力省生化试剂。3. 2敏感性试验肠球菌N9株的DNA模板经ND-1000微量紫外可见分光光度计(Thermo)测定含量 后，用三蒸水进行倍比稀释，设定含量分别为lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、0. lpg，按 确定的扩增体系和扩增条件进行扩增，以出现特异扩增带的模板用量的最高稀释倍数计算 可检出的肠球菌最低DNA含量，见图2。由图可知，第4空有四条目的性条带，最终可检测到的DNA量是lOOpg，敏感性好， 达到预期目的。3. 3特异性试验用菌株N5、ΝΙΟ, N30、Ni、N7、N25和N42的DNA做模板进行PCR方法，以三蒸水做 空白对照，扩增结果见图3。 由图可知，单重PCR阴性的菌株在四重PCR里对应基因也是阴性，有良好的特异 性。3. 416S、cylA、esp和AS基因的载体克隆与鉴定结果对克隆获得的阳性转化子，经提取质粒和酶切重组质粒鉴定，见图4，由图可知，酶 切结果正确，并且Blast结果正确。
权利要求
一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物，其特征在于它的序列如下肠球菌属引物的序列如下上游引物E15′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；下游引物E25′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；聚集物质引物的序列如下上游引物ASA15′-GCTCGCTATTACGAACTATGA-3′；下游引物ASA25′-TATGAAAGAACATCACCACGA-3′；溶血素引物的序列如下上游引物cylA15′-ACACGGGGATTGATAGGC-3′；下游引物cylA25′-GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3′；肠球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Esp15′-AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3′；下游引物Esp25′-AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3′。
2.利用权利要求书1所述的肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物检测肠球菌属的 方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，其特征在 于所述PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份 2 X PCR TaqMix10 μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1模板DNA2 μ 1dd H2O5 μ 1总体积25 μ 1所述PCR反应程序为95°C 预变性 5min ；94°C 变性 30s，56 °C 退火 lmin，72°C 延伸 Imin 10s，共 30 个循环； 72°C终止 IOmin。
全文摘要
本发明的技术方案公开了一种肠球菌属及毒力基因多重PCR检测引物，它包括肠球菌属引物的序列、聚集物质引物的序列和溶血素引物的序。本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌属及其主要毒力基因的多重PCR方法。本方法特异性高；敏感性实验表明该方法最低能检测到100pg DNA。为肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌致病机制机制、早期预防提供了一种新的快速检测方法，同时构建的标准质粒也为未来建立实时荧光定量PCR方法提供了基础。
文档编号C12Q1/10GK101880727SQ20101023999
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者孟振北, 段志刚, 王亚宾, 耿鑫, 胡慧, 胡清林, 陈丽颖 申请人:河南农业大学