专利名称：半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的海水鱼类遗传性别分子标记鉴定技术，是一种 与半滑舌鳎遗传性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法。
背景技术：
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目(Pleuronectiformes)、鳎亚目 (Soleoidei)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus)、三线舌鳎亚属(Arelia)， 为暖温带浅海底层大型鲆鲽鱼类，在黄渤海分布最多，而在东海、南海分布较少，是目前具 有重要养殖前景的海水鲆鲽鱼类。周丽青等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，水产学报，2005，29 :417_419) 对半滑舌鳎的染色体核型进行了研究，结果表明二倍体染色体数目为42，2n = 42，且在雌 鱼的中期分裂相中存在异型性染色体，而在雄鱼中不存在异型性染色体。基于染色体C-带 和G-带分析的进一步研究表明，半滑舌鳎由20对常染色体和1对性染色体(分别为Z 和W染色体)组成，半滑舌鳎属于ZW/ZZ性别决定系统，雌性异配，雄性同配(Wu et al., Progress inNatural Sciences,2006,16 29-32 ；Zhuang et al. , Journal of Applied Ichthyology, 2006, 22 437-440)。成熟的半滑舌鳎雌性个体比雄性个体大2_4倍，两者的 生长速度也相差2-4倍，雌性个体生长速度更快。因此，积极开展半滑舌鳎性别连锁的分子 标记或基因的研究，找到与性别连锁的分子标记或基因，将对半滑舌鳎性别控制与全雌苗 种培育具有重要的理论意义与应用价值。目前，多国科学家利用基于全基因组扫描理念的一些分子标记技术，如AFLP、 RAPD、RFLP等，筛选到了一些经济鱼类的与性别相关的分子标记，但这些标记在种间不具有 通用性。中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林等(Marine Biotechnology, 2007,9 273-280)通过AFLP标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记，转化成SCAR标记后能 通过简单的PCR方法鉴定半滑舌鳎的遗传性别。但AFLP标记存在一个较大的缺陷，就是无 法区分纯合子与杂合子，是一种显性遗传的分子标记。而微卫星标记是由1-6个碱基组成 的短串联重复序列，具有高度多态性，并且符合孟德尔遗传分离规律，呈现共显性遗传的特 点，能够区分纯合子和杂合子。微卫星重复序列的侧翼序列一般比较保守，一般在近缘物种 中也能进行跨种扩增。因此如果能够筛选到半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，不仅能够建 立准确高效的遗传性别鉴定方法，还将有助于开展半滑舌鳎性别相关基因的进化研究以及 WW超雌鱼的筛选。而有关半滑舌鳎性别连锁或特异微卫星标记的筛选研究，迄今国内外尚 未见任何文献或专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一个半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法， 为半滑舌鳎性别决定基因筛选、性别控制和全雌苗种培育提供一种技术手段。本发明是按以下技术方案实现的本发明包括三个方面一、半滑舌鳎性别连锁微卫星标记的筛选及其引物序列；二、半滑舌鳎雌性特异微卫星等位基因的序列及其引物 序列；三、基于微卫星标记的半滑舌鳎遗传性别鉴定方法。—、半滑舌鳎性别连锁微卫星标记及其引物序列它的技术内容包括1、微卫星 序列的筛选与克隆；2、微卫星引物的设计；3、性别连锁的微卫星标记的验证。1、微卫星序列的筛选与克隆提取半滑舌鳎基因组DNA，首先对基因组DNA进行限制性酶切，再用T4连接酶给 酶切DNA片段加上接头。连接产物用作PCR扩增模板，并用接头特异性引物进行PCR预扩 增。将扩增片段与生物素标记的寡核苷酸探针进行杂交，并用磁珠选择性吸附与生物素标 记探针杂交的DNA分子。然后在室温条件下经过3次非严谨性和3次严谨性洗脱去除未与 探针结合的DNA片段，并用磁铁将磁珠_探针-DNA混合物从缓冲液中分离出来。接着往磁 珠中添加TE溶液并在95°C水浴变性5分钟，用磁铁固定磁珠后快速吸出上清液。以上清 液当模版进行PCR扩增，扩增产物经纯化后与pMDIS-T载体(Takara)在16°C连接两个小 时。将连接产物加入到感受态细胞中进行克隆并涂勻在一个含氨卞青霉素的LB平板上，等 液体吸收完毕后，37°C倒置培养过夜。挑选白色的阳性克隆送到生物测序公司测序。2、微卫星引物的设计根据测序得到的序列，查看其中是否含有1-6个碱基重复 的单元。选取含有重复单元的序列，用引物设计软件针对重复单元的侧翼序列设计引物。3、性别连锁的微卫星标记的验证首先用各16尾半滑舌鳎雄性个体与雌性个体 基因组DNA样品对每对微卫星引物进行PCR扩增，扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶 中电泳，并通过银染方法进行染色，然后比较微卫星等位基因在雌雄个体中的分布是否有 显著差异。最终筛选到一个引物序列为SEQID NO :l(tgaactgcaa gactgctcca)和SEQ ID N0:2(catcagttgg tggcctgtaa)微卫星标记与半滑舌鳎性别紧密连锁。然后进一步用序列 SEQ ID NO 1和SEQID NO 2的引物扩增性成熟的半滑舌鳎22尾雌鱼和22尾雄鱼基因组 DNA，总共扩增出2个等位基因，按照大小顺序分别命名为A、B等位基因。根据与分子量标 准比较，A等位基因大小约为244bp，B等位基因的大小约为234bp。其中22尾雄鱼和22尾 雌鱼全部扩增出A等位基因，所有22尾雌鱼都扩增出B等位基因，而所有22尾雄鱼都未能 扩增出B等位基因。因此B等位基因为半滑舌鳎雌性特异的等位基因。二、半滑舌鳎雌性特异的等位基因序列及其引物序列它的技术内容包括1、雌 性特异等位基因的克隆与测序；2、雌性特异等位基因的引物设计；3、雌性特异标记的验 证。1、雌性特异等位基因的克隆与测序为了获得雌性特异等位基因序列，用SEQ ID NO :l(tgaactgcaagactgctcca)和 SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物PCR扩增1尾性成熟的半滑舌鳎雌鱼DNA， 用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切下PCR产物目标电泳条带，用DNA纯化试剂盒 纯化。纯化产物用T4 DNA连接酶连接到pMD 18-T质粒，然后转化感受态大肠杆菌，并涂勻 在一个含氨卞青霉素的LB平板上，等液体吸收完毕后，37°C倒置培养过夜。挑选8个阳性 克隆送到生物测序公司测序。2、雌性特异等位基因的引物设计根据测序结果，8个阳性克隆测序成功，共得到 8条序列，其中大小为244bp的序列6条，大小为234bp序列2条，分别对应A、B两个等位 基因，B等位基因即为半滑舌鳎雌性特异等位基因。根据A、B等位基因的序列比对结果，
4除了重复区有2个GT的缺失，相对于A等位基因，B等位基因(即雌性特异等位基因)在 5’端有6个碱基的缺失。因此用引物设计软件针对缺失的6个碱基的位置，设计了 SEQ ID NO :3(tctgcatgac attggaaag)的一条特异引物，该引物与 SEQ ID NO 2 (catcagttgg tggcctgtaa)的引物配对用于扩增大小为204bp的半滑舌鳎雌性特异DNA片段，进行半滑舌 鳎遗传性别检测。雌性特异等位基因(大小为234bp的B等位基因)序列为SEQ ID NO :4，其序列 如下tgaactgcaa gactgctcca gggcagtgtc tctgcatgac attggaaagc tgtgtgtggatgcatgtgtg tgtgcgtgta atgttctcca gctatggcct acgctggctg cagcctggagccgctctgtg gtgtggaaaa gagagcagat gcctcttcac tggagtgcat caggccaccaaatcgcaaat atcactgatc atctcccaat tcaattacag gccaccaact gatg。3、雌性特异标记的验证用 SEQ ID NO 2 (catcagttgg tggcctgtaa)和 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的引物对各10尾半滑舌鳎雄性与雌性个体基因组DNA样品进 行PCR扩增，扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色。结果表明，所有雌性个体中 均能扩增出大小为204bp的DNA片段，而雄性个体中无扩增产物，这表明通过雌性特异等位 基因转化的分子标记能够准确鉴别半滑舌鳎的遗传性别。三、基于微卫星标记的半滑舌鳎遗传性别鉴定的应用方法可以根据以下2种引 物组合来进行半滑舌鳎遗传性别鉴定1、根据序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物PCR 扩增半滑舌鳎基因组DNA，扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并通过银染方法 进行染色，然后分析电泳图谱扩增出A、B等位基因的个体一定是遗传上为雌性的个体，只 扩增出A等位基因的个体一定是遗传上为雄性的个体。2、根据序列为SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的引物PCR扩增半滑舌鳎基因组DNA，扩增产物在1. 5%的琼脂糖凝胶中电泳，EB 染色，然后分析电泳图谱扩增出大小为204bp的DNA片段的一定是遗传上为雌性的个体， 而无扩增产物的个体一定是遗传上为雄性的个体。本发明与已有技术对比其特点是首次筛选到了半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，发现了雌性特异的等位基因，并 获得了该特异等位基因的基因序列，设计了针对该等位基因的特异引物，建立了基于微卫 星标记技术的遗传性别鉴定方法。本发明具有高效、准确和稳定的特点，在半滑舌鳎性别控 制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在克隆半滑舌鳎性别决定基因研究中也具有 重要应用前景。
图1、用性别连锁的微卫星标记引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2扩增半滑舌鳎 雌性和雄性个体的电泳图谱1-22 半滑舌鳎雌性个体，23-44 半滑舌鳎雄性个体；A 半滑舌鳎雌雄个体都能 扩增出的等位基因；B 半滑舌鳎雌性特异的等位基因；M 分子量标准。图2、用雌性特异等位基因的引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3扩增半滑舌鳎雌 性和雄性个体的电泳图谱。1-10 半滑舌鳎雌性个体，11-20 半滑舌鳎雄性个体；M 分子量标准
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本发明技术内容进行详细叙述本发明包括三个方面一、半滑舌鳎性别连锁微卫星标记的筛选及其引物序列； 二、半滑舌鳎雌性特异微卫星等位基因的序列及其引物序列；三、基于微卫星标记的半滑舌 鳎遗传性别鉴定的应用方法。一、半滑舌鳎性别连锁微卫星标记及其引物序列包括1、微卫星序列的筛选与 克隆；2、微卫星引物的设计；3、性别连锁的微卫星标记的验证。1、微卫星序列的筛选与克隆选取1尾半滑舌鳎的鳍条约5mm2放入1. 5mL离心管中，待乙醇挥发后用干净的手 术剪刀将其剪碎。加入700 μ L抽提缓冲液(缓冲液组分10mmol/LTriS-HCl，pH = 8. 0， 5mmol/L EDTA,0. 5% SDS)及5yL lmg/mL蛋白酶K，55°C充分消化4_6h。将冷却到室温的 消化好的样品加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(酚氯仿异戊醇为25 24 1)抽提 两次，每次轻轻振荡lOmin，于IOOOOrpm的4°C冷冻离心机中离心lOmin。采用剪口的吸头 轻轻吸取上清液，转入新的离心管中。加入6 μ L浓度为25mg/mL RNaseA于37°C水浴中消 化2-3h。然后重复一次酚-氯仿抽提。再在上清液中加入等体积的氯仿(氯仿异戊醇 为24 1)抽提1次。轻轻振荡lOmin，于IOOOOrpm的4°C冷冻离心机中离心lOmin。采用 剪口的吸头轻轻吸取上清液。然后在上清液中加入2倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀 DNA。将DNA沉淀用吸头挑出，用70%的乙醇洗涤两次，室温下干燥，然后用IOOyL TE缓 冲液(10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, pH = 8.0)溶解 DNA 沉淀。对提取的约 IOOng 半 滑舌鳎基因组总DNA放入含有5U的内切酶MseI (New England Biolabs)的离心管中进行 酶切反应。酶切反应混合物总体积为25 μ L，在水温为37°C的恒温热稳循环仪中温浴2h。 取 10 μ L 的酶切反应产物与 MseI AFLP 接头(5，-TACTCAGGACTCAT-3，/5，-GACGATGAGTCCT GAG-3’ )在总体积为30 μ L反应混合液中进行6h的连接反应(15°C的水浴温度)，其中加 入IOU的T4 DNA连接酶(TaKaRa)。利用连接产物作为模版进行PCR反应，25 μ L的PCR 反应混合物中含有稀释10倍后的5 μ L酶切-连接产物、终浓度为0. 4 μ M的MseI-N引物 (5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，) UXPCR 缓冲液(Biostar,含 Mg2+)、0· 2 μ M 的 dNTP 以及 IU 的Taq聚合酶(Takara)。PCR反应在MJ Research PTC-200 PCR仪上进行。反应条件为首 先94°C预变性5min，然后在94°C变性30s，53°C退火lmin，72°C延伸Imin进行17个循环， 最后72°C终延伸IOmin。25 μ L经PCR产物纯化试剂盒纯化后的预扩增产物与5 μ L浓度为 20mM的生物素探针(GT) 13杂交。杂交缓冲液为6 X SSC+0. 1% SDS,反应总体积为100 μ L。 杂交条件为95°C下变性5min，然后在55°C下杂交60min，杂交反应在PCR仪中进行。冷却 至室温的杂交产物加入 300 μ 1 的 TENlOOdOmM Tris-HCl，ImMEDTA, IOOmM NaCl，pH 7. 5) 溶液。l_2mg的包被有链亲和霉素的磁珠用300 μ L TENlOO在室温下洗涤3次，然后与PCR 产物_生物素探针复合体在室温下混合杂交30min，其间需要不时的轻轻搅动和吹打，以避 免磁珠沉淀。用磁铁固定磁珠，移去杂交混合液。首先进行3次非严谨性洗脱使用400 μ L 缓冲液 TEmOOO (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，IM NaCl, pH 7. 5)于室温下洗涤 PCR 产物-生 物素探针_磁珠复合物3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻用移液器吹打。然后紧接着进 行3次严谨性洗脱使用400 μ L 0. 2 X SSC+0. 1 % SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻用移液器吹打。每次洗涤后都需使用磁铁固定磁珠，用移液器吸走上清液扔 掉。在离心管中加入50yL TE(pH = 8.0)，用移液器吸打均勻，然后于95°C下水浴5分钟。 期间不时用移液器搅动或者轻轻吹打均勻。用磁铁固定磁珠后，迅速吸出上清液，经DNA纯 化试剂盒纯化后用于PCR扩增。纯化后的5 μ L目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件 与上面的PCR预扩增条件一致。PCR产物经纯化后与pMD18-T载体(Takara)在16°C连接两 个小时。于-70°C的冰箱中取出一管TGl感受态细胞，立即放置于冰浴中。感受态细胞中加 入质粒连接混合液2 μ L，冰浴30min后放置于42°C水浴中90s，然后冰浴2min。最后加入 液体培养基至lmL，于37°C的摇床中以小于225转/分钟的速度复苏60min。以IOOOOrpm 的速度离心Imin沉淀细胞，只留下200 μ L培养基以重悬细胞。加入IPTG和X-Gal，混合均 勻。每100 μ L悬浮细胞液涂勻一个含氨卞青霉素的LB平板，等液体吸收完毕后，37°C倒置 培养过夜。挑选白色的克隆置于含有氨卞青霉素的0. 5mL LB液体培养基的离心管中，37°C 振荡(300rpm)培养3_4h。克隆通过PCR的方法筛选。PCR反应的总体积为12. 5 μ L，内含 1 μ L培养物作为模板DNA, 0. 2 μ M的引物(MseI-N引物或M13F/R测序通用引物)，0. 5U的 Taq酶，0. 1 μ M的dNTP，IXPCR缓冲液。除循环次数为35次外，其它PCR反应条件与上面 一致。筛选出来的阳性克隆菌液交由北京华大基因公司用3730测序仪测序。2、微卫星引物的设计用‘Tandem Repeats Finder’软件查找重复序列，并辅以人 工检查和核对。根据微卫星DNA侧翼序列，利用在线引物设计软件‘Primer 3’设计引物。3、性别连锁的微卫星标记的验证首先用各16尾半滑舌鳎雄性个体与雌性个体 基因组DNA样品对每对微卫星引物进行PCR扩增，微卫星扩增的PCR反应条件如下94°C 预变性5min，94°C变性30s，在55-60°C退火40s，72°C延伸40s，进行38个循环后终延伸 lOmin。扩增反应体系为 12. 5 μ L，包括大约 20ng 总 DNA，引物 0. 2 μ mol/L，0. lmmol/L dNTP, 0. 5U Taq聚合酶，IXPCR缓冲液。PCR扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，银 染显带。银染步骤如下①固定粘有凝胶的玻璃板浸泡在乙酸水溶液中约IOmin ；② 漂洗把玻璃板转入双蒸水中漂洗掉乙酸；③染色在染色液(0. 硝酸银，0. 06%福尔马 林)中浸泡30min ；④再次漂洗在双蒸水中漂洗约5s ；⑤显色立即将漂洗过的凝胶玻璃 板转入显色液(0. 5-1.0%氢氧化钠，0. 06%福尔马林)，并在摇床上晃动直到显带为止；⑥ 终止显色把玻璃板转入乙酸固定液中，终止显色反应。然后晾干保存并用数码照相机 照相。比较微卫星等位基因在雌雄个体中的分布是否有显著差异。最终筛选到引物序列 为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的微卫星标记与半滑舌鳎性别紧密连锁。然后进一步PCR 扩增性成熟的半滑舌鳎22尾雌鱼和22尾雄鱼基因组DNA，PCR反应条件如下94°C预变性 5min，94°C变性30s，在61. 5°C退火40s，72°C延伸40s，进行38个循环后终延伸IOmin0扩 增反应体系为 12. 5μ L，包括大约 20ng 总 DNA，引物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP,0. 5U Taq 聚合酶，IXPCR缓冲液。PCR扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，银染显带。 实验结果表明，总共扩增出2个等位基因，按照大小顺序分别命名为A、B等位基因。比对分 子量标准，A等位基因大小为244bp，B等位基因大小为234bp。所有22尾雄鱼中只能扩增 出A等位基因，而所有的22尾雌鱼都能扩增出A、B两个等位基因(图1)。二、半滑舌鳎雌性特异的等位基因序列及其引物序列它的技术内容包括1、雌 性特异等位基因的克隆与测序；2、雌性特异等位基因的引物设计；3、雌性特异标记的验 证。
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1、雌性特异等位基因的克隆与测序用序列 SEQ ID NO 1 (tgaactgcaa gactgctcca)禾口 SEQ ID NO: 2(catcagttggtggcctgtaa)的引物PCR扩增1尾性成熟的半滑舌鳎雌鱼DNA，用1. 5%的琼 脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切下PCR产物目标电泳条带，用DNA纯化试剂盒纯化。纯化产 物用T4DNA连接酶连接到pMD 18-T质粒，然后转化感受态大肠杆菌，并涂勻在一个含氨卞 青霉素的LB平板上，等液体吸收完毕后，37°C倒置培养过夜。挑选8个阳性克隆送到生物 测序公司测序。2、雌性特异等位基因的引物设计根据测序结果，8个阳性克隆测序成功，共得到 8条序列，其中大小为244bp的序列6条，大小为234bp序列2条，分别对应A、B两个等位基 因，B等位基因即为半滑舌鳎雌性特异的等位基因。利用软件MEGA4. 0比对A、B等位基因 的序列，结果发现，除了重复区有2个GT的缺失，相对于A等位基因，B等位基因(即雌性 特异等位基因)在5’端有6个碱基的缺失。因此针对缺失的6个碱基的位置，利用在线引 物设计软件‘Primer 3，设计了 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的一条特异引物，该 引物能与SEQ ID NO :2的引物配对用于扩增大小为204bp的半滑舌鳎雌性特异DNA片段， 从而建立简单的PCR方法进行半滑舌鳎遗传性别检测。雌性特异等位基因序列为SEQ ID N0:4(见序列表)。3、雌性特异标记的验证用SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的引物对各10尾半滑 舌鳎雄性与雌性个体基因组DNA样品进行PCR扩增，PCR反应程序如下94°C预变性5min， 94°C变性30s，在60°C退火40s，72°C延伸40s，进行38个循环后终延伸lOmin。扩增反应 体系为 12. 5yL，包括大约 20ng 总 DNA，引物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP，0. 5U Taq 聚合 酶，IXPCR缓冲液。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色。结果表明，所有雌性 个体中均能扩增出大小为204bp的DNA片段，而雄性个体中无扩增产物(图2)，这表明雌性 特异标记能够准确鉴别半滑舌鳎的遗传性别。三、基于微卫星标记的半滑舌鳎遗传性别鉴定的应用方法可以根据以下2种引 物组合开展半滑舌鳎遗传性别鉴定1、根据序列SEQ ID NO:l(tgaactgcaa gactgctcca) 和SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物(引物组合1)，PCR扩增半滑舌鳎基因 组DNA, PCR反应程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，在61. 5°C退火40s，72°C延伸 40s，进行38个循环后终延伸lOmin。扩增反应体系为12. 5 μ L，包括大约20ng总DNA，引 物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP,0. 5U Taq 聚合酶，1 XPCR 缓冲液。PCR 扩增产物在 6%变 性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，银染显带。然后分析电泳图谱扩增出A、B两个等位基因 的个体一定是雌性个体，只扩增出A等位基因的个体一定为雄性个体。2、根据序列SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)禾口 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的弓丨物(弓丨物组 合2)，PCR扩增半滑舌鳎基因组DNA，PCR反应程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，在 60°C退火40s，72°C延伸40s，进行38个循环后终延伸lOmin。扩增反应体系为12. 5 μ L，包 括大约 20ng 总 DNA，引物 0. 2 μ mol/L，0. lmmol/L dNTP，0. 5U Taq 聚合酶，IXPCR 缓冲液。 PCR扩增产物在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色。然后分析电泳图谱扩增出大小 为204bp的DNA片段的个体一定是雌性个体，而扩增不出DNA产物的个体一定为雄性个体。
权利要求
一种半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，其特征在于它的技术内容包括3条特异引物SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3以及雌性特异等位基因的核苷酸序列SEQ ID NO4，其序列为SEQ ID NO1tgaactgcaa gactgctcca；SEQ ID NO2catcagttgg tggcctgtaa；SEQ ID NO3tctgcatgac attggaaag；SEQ ID NO4tgaactgcaa gactgctcca gggcagtgtc tctgcatgacattggaaagc tgtgtgtgga tgcatgtgtg tgtgcgtgta atgttctcca gctatggcctacgctggctg cagcctggag ccgctctgtg gtgtggaaaa gagagcagat gcctcttcactggagtgcat caggccacca aatcgcaaat atcactgatc atctcccaat tcaattacaggccaccaact gatg。
2.一种半滑舌鳎遗传性别鉴定的方法，其特征在于它的方法是抽提待测遗传性别的 半滑舌鳎基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及雌性特异等位基因的 序歹Ij SEQ ID NO :4，设计 3 条特异引物=SEQ IDNO =USEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3。用 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2对半滑舌鳎基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在6%变性聚 丙烯酰胺凝胶上进行电泳，银染显带；然后分析电泳图谱扩增出A、B两个等位基因的个体 一定是雌性个体，只扩增出A等位基因的个体一定为雄性个体；用SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3对半滑舌鳎基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电 泳，EB染色；然后分析电泳图谱扩增出大小为204bp的DNA片段的个体一定是雌性个体， 而扩增不出DNA产物的个体一定为雄性个体。
全文摘要
一种半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法，包括半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记的筛选、验证、雌性特异等位基因的克隆、序列分析、特异引物设计以及半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；根据获得的半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记引物及雌性特异等位基因序列，创建了半滑舌鳎遗传性别的PCR鉴定方法。本发明首次筛选到半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及雌性特异等位基因，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术。本发明具有高效、准确和稳定的特点，在半滑舌鳎性别控制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在克隆半滑舌鳎性别决定基因研究中也具有重要应用前景。
文档编号C12N15/11GK101914529SQ201010239729
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者廖小林, 徐亘博, 徐营, 陈松林 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所