专利名称：作为一种遗传标记用于增加猪的一胎多仔数量之催乳素受体基因的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及猪的繁殖能力的遗传变异的测定，特别是用一种遗传标记，即催乳素受体基因，来表示一胎多仔的可遗传的特征。
本发明的背景繁殖能力用每个具有繁殖能力的雌性猪所生产一胎多仔数量来确定，是猪肉生产效率的主要限定因素。在美国出生并存活的猪的数量平均约为每胎9.5只。一胎仔数的可遗传性是低的(10％～15％)，根据以往的一胎数量来选择能繁殖的雌性的标准的遗传方法已无效，因此需要一种能在分子或DNA水平上选择繁殖能力的方法。
中国猪品种以其年龄不大时就进入繁殖期，并且一胎多仔而著称。美国猪品种则以其增长速度较快，是瘦肉型的而著称。因此，理想的作法是将两个品种类型最好的特征结合起来，以改进美国猪肉的生产效率。通过发现与猪一胎多仔有关的基因或遗传标记将大大加速这些效果。
限制性片段长度多态性(RFLP)的分析法已被若干研究组用来研究猪的DNA。见Jung等人所作《应用遗传法则》77:271-274(1989)，本说明书引入该文作为参考，该文公开了用RFLP技术来显示两个猪品种之间的遗传变异性。在这些品种中，猪白细胞抗原(SLA)Ⅰ类基因证明为多形质。本文引入Hoganson等人的文章作为参考，见《美国社会中西部地区动物科学年会文摘》，1990年3月26-28。猪的主要组织相容性复合物(MHC)基因的多形质的报导相对于中国的猪，用RFLP分析也被证明。Jung等人《动物遗传学》(1989)2679-91，本说明书引入该文作为参考，用RFLP对某些雄性猪的白细胞抗原Ⅰ类基因的分析的报导。作者提出在猪白细胞抗原/主要组织相容性复合物(SLA/MHC)的Ⅰ类基因与繁殖及完成这种特征之间能有一种联系。用SLA Ⅰ类限制片段，作为遗传标记的进一步的情况会在未来改善猪的生长性能方面有发展。
进而，美国专利5,550,024中Rothschild等人公开了在猪雌激素受体基因中的多形质与一胎较多仔数量有联系，本说明书引入这个公开作为参考。
另一个与猪成功繁殖有关的激素是催乳素。催乳素(PRL)是一种前垂体肽激素，包括了多种不同的内分泌活性，而且对繁殖成功是必要的。它的最好的特性之一是调节成年哺乳动物的乳的产生。PRL需要生乳的刺激或乳蛋白的合成。这种反应是通过它的受体(PRLR)作中介。PRLR属于细胞因子生长激素受体/催乳素受体(GHR)/PRLR超科。当催乳素(PRL)被激活，催乳素受体(PRLR)开始一个信号转导途径，基因的最终活化转录β-酪蛋白和α-乳清蛋白。当PRL被激活时，PRLR开始于一个信号转导途径，包括酪氨酸激酶Jak2。在蛋白质羧基末端的突变能改变一种特殊的磷酸酪氨酸残基，防止受体激活Jak2并最终用β-酪蛋白基因的活化转录进行干预(Lebrun)。长和短形式的受体蛋白质及不同的转录方式已在大鼠、小鼠、兔及人类中表现出其特征。(Boutin,Edery,Lesueur)。然而，已显示短形式的受体是不能激活乳蛋白基因的转录。已知在兔及人类的未翻译区，由于可变剪接mRNAs产生的转录远不如它的初期。最近也已证明催乳素(PRL)能刺激黄体酮的产生，对维持妊娠是需要的，体外实验存在大量黄体细胞。在牛中催乳素受体(PRLR)能协调生长激素(bST)参于产生较多的乳的作用。因此，对于猪产生较多的乳也可能是重要的。在人类和小鼠中，生长激素受体(GHR)和催乳素受体(PRLR)的遗传图谱靠在一起(Arden等人1990；Barker等人1992)在猪中这两种基因是连接在一起的。已经在猪的遗传图谱上发现GHR在染色体16上。而PRLR还未在遗传图谱中发现，并且已有报导没有遗传变异性。
本发明提供一个遗传标记，基于在催乳素受体基因中多形质的发现，它与增加猪的一胎多仔数量有关。用猪的催乳素受体基因能进行基因分型，并用于测定特殊的限制性片段长度多态性(RFLPs)猪仔与增加猪的一胎多仔数量的关系。也能用于识别雌雄个体携带的一胎较多仔的基因。在此情况下的雌性个体，有可能繁殖出一个比他们的品种平均数量大的猪仔，或雄性个体因为他们的雌性个体后代有比他们繁殖的平均值较大的一胎较多仔数量。因此这种标记在繁殖计划中可作为选择工具促进谱系和品种的发展，使其繁殖生产出大量后代的小仔。
本发明的概述本发明的目的是提供一种筛选猪的方法，测定那些可能繁殖一胎较多仔的猪。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴别猪的一胎多仔数量的遗传标记的方法。
本发明的进一步的目的是提供用于一胎多仔数量的遗传标记。
本发明的另一个目的是提供一种用于评价猪的脱氧核糖核酸(DNA)的样品的工具，用于一胎多仔数量的具体的遗传标记。
其它的目的和本发明的优点一部分在说明书中解释，一部分明显地可从说明书或由本发明实施例中得知。本发明的上述目的和优点可通过说明书，并在结合附加的权利要求而得到。
为实现本发明上述目的，本发明提供一种用于筛选猪方法，以测定那些更能繁殖出一胎较多仔的小猪，或淘汰那些等位基因显示一胎较少仔的猪。测定那些繁殖时更能生产一个一胎较多仔或淘汰的猪是有等位基因指出一胎较少仔。因为“一胎较多仔”表示在一个所给种群的平均值之上的重要的一胎多仔数量。因此本发明提供一种用于筛选猪方法，测定那些更能生产一胎较多仔的猪，和/或那些很少能生产一胎较多仔的猪。这种方法包括如下步骤1)从一头猪中得到基因组DNA的样品；2)分析由1)得到的基因组DNA以测定催乳素受体的等位基因是存在的。简言之，从一头猪中得到一个遗传物质样品，并分析样品以测定在催乳素受体基因的编码区的多形质是否存在，这与增加一胎多仔的数量是相关的。
在一个优选实施例中，多形质是一个限制片段长度多形质，实验包括鉴别从猪的遗传物质中分离出来的猪的催乳素受体基因；基因与限制酶发生作用以产生不同长度基因限制片段；从一个限制模式中分离限制片段，通过电泳或高压液相层析分离(HPLC)；对一头猪的催乳素受体基因的限制片段模式进行比较，判断是否带有希望的标记。如果猪在标记实验中为阳性，它将包括在繁殖方案中。如果猪在标记基因型实验中不是阳性，它将被从这组中挑出而作它用。
在最佳实施例中，基因通过应用引物和DNA聚合酶而被分离，放大含有多形质该基因的一个特殊的区。之后，被放大的区域用限制酶消化，片段又再次被分离。这种限制性片段长度多态性(RFLP)模式的显色通过片段的简单染色来完成，或在放大时或者用引物或者用核苷三磷酸作标记。
在另一实施例中，本发明包括一种方法，在一个特殊种群中鉴别用于猪一胎多仔数量的遗传标记。雌雄猪以相同的品种或杂交或相似的遗传谱系来繁殖，以测定每个雌猪产生的后代数量。在每个猪的催乳素受体基因中的一种多形质可以鉴定，并与后代的数量有关。最好限制性片段长度多态性(RFLP)分析被用于测定多形质，优选用限制性内切核酸酶Alul消化DNA。
在可选择DNA标记的具体的等位基因和与一个特殊的基因(如催乳素受体基因在此讨论过)有关的DNA标记的等位基因之间建立连接也是可能的，如上所述与一个特殊的性能有关。因此，在目前状况下，至少在短期内，取得催乳素受体基因是可能的，选择能生产一胎较多仔的猪，另一方面间接地淘汰生产一胎较少仔的猪，通过对染色体16标记的具体的等位基因的选择，选用与一个催乳素受体有关的某些等位基因来标记。这些标记物包括SW1305,S0077,S0006,SW2411,SW1035和S0111与猪的染色体16上的催乳素受体有关，这些标记物都是微卫星和生长激素受体(GHR)。
本发明还包括一个评价猪的DNA样品的工具，以评价一个希望的遗传标记是否存在于猪的遗传物质中，表现出一胎多仔的遗传特征的猪的催乳素受体基因。最低限度，这个工具是一个含有一种或多种试剂的容器，它能鉴定猪催乳素受体基因的多形质。最好这种试剂是一组低核苷酸引物，能放大含有多形质的猪催乳素受体基因的片段。优选地，这种工具还含有限制酶，它能至少在一个地方剪切猪催乳素受体基因。在一个优选实施例中，这种限制酶是Alul或它能在相同的识别位点进行剪切。
下面结合附图，对说明书实施例进行详细解释。
附图的说明
图1描绘了3’编码序列和猪催乳素受体(PRLR)基因的未翻译区(SEQ ID No:3)。这种猪的聚合链式反应(PCR)产生的片段由来自兔或人类引物，用Amicon Microcon Filters作指导(Amicon，有限公司)被纯化。由艾奥瓦洲大学的DNA序列和合成的设备来做序列分析，用斜体部分表示的不确定性序列可能为ccaaaactac(SEQ ID No:3)-猪PCR引物一兔/人序列。
图2表示用Alul消化PCR产品的多形模式。正向的引物5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’，反向的引物5’-GGCAAG TGG TTG AAA ATG GA-3’用在下列PCR条件93℃,3分钟，35个循环93℃30秒，60℃1分钟，70℃1分钟，最终72℃3分钟。最后加Taq聚合酶，而样品被加热维持在80℃。用Alul剪切PCR产品(新英国生物实验室)，在室温120伏用6％NuSieve(FMC)琼脂糖凝胶上分离4小时，凝胶用溴化乙锭染色，泳道1是1-kb梯度，泳道2～4是三种不同的基因型。
图3表示PRLR在猪染色体16的位置，用CriMap得到多点连锁，以对数LOD比数，产生一个中性最好的图谱，3或大于3认为有意义。
图4表示用PCR引物SEQ ID NOS:1和2由聚合链式反应(PCR)实验得到的片段。
本发明的详细说明现在本发明提供具体的详细的说明，结合下列例子，解释本发明的原则。
本发明涉及用于猪的一胎多仔数量的遗传标记。它提供了一种筛选猪的方法，测定那些繁殖时更能生产一胎较多猪鉴定其催乳素受体基因中和增加一胎多仔数量相关的多形质的存在与否。这里术语“增加的一胎多仔”，指一胎多仔数量在所给群体的平均值之上的一个生物学意义的增加。
因此，本发明涉及遗传标记和识别那些遗传标记在特殊的品种，株系，群体或类别的猪中的方法，因而雌猪更能生产小仔，对于这样特殊的品种、株系、群体、或类别的猪，在猪仔数量的平均值之上可明显增加它的数量。使用一些方法鉴别这种标记的存在或缺失，包括例如单链构象多态性(SSCP)分析，限制性片段长度多态性(RFLP)分析，异源双链分析(HDA)，变性梯度凝胶电泳法，温度梯度电泳法，连接酶链式反应，甚至催乳素受体基因的直接排序及测定在3’翻译区用Alul的识别模式。
其它的技术包括非凝胶系统，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在此系统设计低核苷酸聚合链式反应(PCR)引物，突变的侧面问题，允许此区域PCR放大。然后设计一个第三低核苷酸探针使其杂化含有碱基的区域，该碱基受不同等位基因之间变化的控制。该探针用荧光染料在5’和3’两端被标记。这些染料选择互相靠近的方式，而其中一个荧光被另一个猝灭而不能被测定。用Taq DNA聚合酶使PCR引物从5’位置延伸到模板相对处，使探针导致剪切，染料被连接到5’端，通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性探针退火。去除这种猝灭效应能由染料在探针的3’端进行荧光测定。辨别不同DNA序列的产生可发现探针对模板分子的杂交是不能完成的，即有一些形式的一种错配序列，染料的剪切不会发生。因此，如果仅为低核苷酸探针的核苷酸序列对模板分子是完全互补的，这样它被结合，猝灭被除去。一种反应混合物中含有两个不同的探针序列，每个设计为相反的不同的等位基因，因此能在一个反应中测定两个等位基因。
这种限制性片段长度多态性(RFLP)的应用提供了一种测定多形质的方法。然而，因为RFLP分析的应用依赖于最终在多形质和DNA限制位点单个核酸分子上，其它测定多形质的方法也可被应用。这些方法包括分析多形的基因产品和用测定在基因产品中各种不同结果来测定多形质。
RFLP分析一般是现有技术中已知的技术。如美国专利4,582,788,1986年4月15日出版，Erlich；和Gusella的4,666,828,1987年5月19日出版，Frossard的4,772,549,1988年9月20日出版和Frossard的4,861,708,1989年8月29日出版所有这些都引入该文作为参考。广言之，这种技术包括对于得到的DNA进行研究，用限制性内切核酸酶消化DNA，分离结果片段，并测定各种基因的片段。
在本发明中，从一头猪中得到一种遗传物质的样品。样品可由血液、组织、精液等中得到。通常，外周血液细胞被用作来源，遗传物质是DNA。获得足够的细胞数量以提供足够的DNA的量来进行分析，这个量是已知或能被现有技术中的方法测出。这种将DNA从血液细胞中分离出来的方法是现有技术。
下一个含有多形质的区域用引物和标准技术放大，如聚合酶链反应。这种技术已被公开如美国专利Mullis等的4,683,195,1987年7月28日出版，Mullis等人的4,683,202,1987年7月28日出版，Mullis等人的4,800,159,1989年1月24日出版，Gelfand等人的4,889,818,1989年12月26日出版，和Clumbus等人的4,902,624,1990年2月20日出版，所有这些都引入该文作为参考。引物的选择在提到的参考资料中被讨论并引入该文作为参考。这种引物能放大猪的催乳素受体基因的3’编码区和未翻译区，如图2所示。其它引物能按照现有技术中的那些方法结合在此来设计。
将分离出的DNA然后用限制性内切核酸酶消化，这样在一种具体的核苷酸序列，称为一个限止位点上DNA被水解地分裂或剪切。这种内切核酸酶也称为限制酶，在现有技术中这些方法是已知的。在本发明中，选择一个猪的催乳素受体基因编码区来剪切，在一个地方至少产生两个基因片段。可判定是否任何这样的片段都是多形的，是否任何的多形质的限止性片段长度多态性(RFLP)通过与现有技术结合而与一胎多仔数量相关。优选的，这种限制性内切核酸酶是Alul。Alul在序列5’-AGCT-3’剪切DNA双股链。由专业人员用现有技术的方法决定，将一定量的酶加到含有猪DNA的样品中和其它适于处理样品的适合的条件，所给的技术包含在此。
这种限制性片段然后用已知技术分析，一般包括无论是片段的分离和通过染色而显色，还是筛选序列和杂交得到一种特殊的模式，或测定不同类型的片段。后者允许鉴别一个或多个片段(标记物)用于增加的一胎多仔数量。优选的分离技术是凝胶电泳。
在此技术中，已消化的片段在支持的介质上被分离，片段的类型受所用电的范围影响。凝胶板，如琼脂糖或丙烯酰胺被用于支持介质。含有限制性片段的样品被加到凝胶的一端。一种或多种类型的标记物在相同的凝胶上作为对照能够评价这种限制性片段的类型。这种程序一般有一个溶解度，分离的片段互相有不同类型，有的为1或2个碱基对那么小。
在另一个实施例中片段被变性，并物理地由凝胶转移到一种固体支持物上，优选一个尼龙膜，接触的凝胶用一个含有适当试剂的过滤器过滤，在适当的条件下促进DNA的转化。这种试剂和条件是现有技术中那些已知的方法。因此，从分离程序中得到的DNA片段的相关的位点是存在的。
下一步骤包括测定不同类型的片段的种类或测定一个特殊的类型的片段。后者是一个遗传标记并与增加一胎多仔数量有关。优选用溴化乙锭或类似物通过对片段染色来完成。
另一种技术是杂交探针的应用，这种探针是一种低核苷酸或聚核苷酸用它们使片段杂交可以足够互补或同源，形成探针一片段复合物。优选地，探针是一个cDNA探针。这种低核苷酸或聚核苷酸用一个可测定的实体来标记。这样能够测定限止性片段，探针被杂交。探针用标准的标记技术标记。如用一种射线标记、酶标记、荧光标记、生物素-抗生物素蛋白标记等。如美国专利Ward等人，专利号为4,711,955,1987年12月8日出版。及Stavrianopoulos等人，4,868,103,1989年9月19日出版，本说明书引入两者作为参考。
探针和含有限止片段的尼龙膜在一段足够的时间和适当的杂交条件下接触，使探针与片段杂交，然后通过过滤器清洗除去未结合的探针和其它不需要的物质。
这种探针一片段复合物与过滤器结合，然后用已知技术测定。例如如果此探针已用放射性标记(32P)，测定包括用一片放射性敏感的膜接触这尼龙膜层。然后在一个适当的照射期，所研究的片段包括对照片段被显色。
测定步骤提供一个模式，结果根据类型从片段上分离。用已知类型的对照片段比较这些片段，这样的实验也在凝胶上同样进行，能评价片段类型的不同种类。也可测定在猪催乳素受体基因中的不同的多形质，通过从一定数量的不同的猪的类似的DNA分析产生的模式进行比较，这种模式不同于大部分其它的猪产生的一般的模式，这导致由于一个或多个限制性片段长度的多形质，如不同长度的限制性片段由猪催乳素受体基因被内切核苷酸酶剪切而产生。这里示出在这些猪中有不同的碱基对序列。
一种特殊的RFLP已被鉴别，例如一个特殊长度的限制性片段，用已知技术能构成一个探针到此片段，这样允许用另一种更快的形式测定这样的多形质。例如，这种DNA被消化，能用一种夹心杂交的形式，这样的实验公开于美国专利Ranki等人的4,486,539,1984年12月4日出版，Ranki等人的4,563,419,1986年1月7日出版。本说明书引入两者作为参考。样品被带入与一个捕捉探针接触，在固体载体上固定化，探针与片段结合，然后清洗载体，加入一个标记的测定探针，再清洗，对测定探针进行测定，由此证明这种理想的片段存在。
在另一个实施例中，这种RFLP模式被测定，或一个特殊的多形的片段已经被测定，将它与第二种比较，已知RFLP模式或片段是与增加一胎多仔数量相关的，第二个模式或片段也由猪催乳素受体基因测定，使其在相同条件下用同样的限制性内切核苷酸酶作为和第一种同样或一个相同的探针进行。
本发明的另一个改变的实施例中，这种限制性片段能用杂交溶液测定。在此技术中，这种片段首先被用探针杂交，然后被分离。这种分离的探针一片段复合物然后如上所述被测定。通常，这样的复合物在凝胶上被测定，没有转移到过滤器上。
在大部分优选实施例中，多形质用聚合链式的反应(PCR)放大测定，没有任何探针。这样的程序在现有技术中是已知的，在美国专利中也有讨论，如4,795,699名称为“DNA聚合酶”和美国专利4,965,188“放大的方法，测定和/或使用一种热稳定的酶来克隆核苷酸序列”本说明书引入两者作为参考。
这种程序引物用于构成放大的区域，多形质位于其中。引物可优选4～30个碱基，取决于多形质周围的序列来设计，包括一个多形质的正向5’引物和一个反向的或抗一感觉引物3’。引物不需要精确的互补，实际上相等的序列也能被接受。然后加入一种DNA聚合酶，如Taq聚合酶(许多这样的聚合酶是已知的，商业上有用)，常用4种核苷三磷酸作一种缓冲试剂。测定是通过简单的染色，如用溴化乙锭，分离出的产品根据放大区域的长度用预知的类型进行测定。反应的时间，试剂和引物的设计都是现有技术中的那些已知方法，并在本专利中讨论，引入该文作参考。进一步聚合链式反应(PCR)放大可具体的用单链构象多态性(SSCP)。见Orita等人“用凝胶电泳作为单链构象多态性测定人的DNA的多形质”。PNAS 86(8),1989年4月(2766-2770)；Lessa等人“摩尔生态学”2(2)119-129页，1993年4月，“筛选技术用于测定DNA序列中变异的等位基因”均被引入本文作参考。
尽管上述方法的叙述，在术语上用了一个简单的限制酶和简单的成组引物，这些方法不限于此，一种或多种附加限制酶和/或探针和/或引物均能被应用，如果需要，附加的酶构成探针和引物能通过常规途径测定。
用于猪一胎多仔数量的遗传标记物测定如下。相同的品种或杂交品种或来自相似遗传谱系衍生的雌雄猪配对，测定每个雌猪生产的后代数。为了测定每个猪的催乳素受体基因中的多形质，亲代DNA的限制性片段长度多态性(RFLP)的分析如上所述方法进行。这种多形质和后代的数量有关。至少20最好取40只雌猪用于做这些测定。每只雌猪生产小仔的次数(如同一窝后代)至少是一次，优选循环繁殖，重复生产至少2次，最好为3次。
当进行这种分析时，多形质通过限止性内切核苷酸酶Alul进行聚合链式反应(PCR)限制性片段长度多态性(RFLP)的分析测定，由于多形质周围区的高的同源性，用类似于人类或兔的已知的催乳素序列能设计放大引物，也可用已知的猪的催乳素基因序列资料如图1表示的来设计，或甚至用基因周围紧密连接得到的序列资料来设计。根据本发明已选择一组引物来放大一个第457碱基对片段(正向引物5’-CCC AAA ACA GCA GGA CG-3’(SEQ IDNo:1)和这种反向的引物5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATGGA-3’(SEQ ID No:2))，其后产生限制性多形的片段约为124,110,79,77和67碱基对。这种多形位点位于110碱基对片段。多形的剪切位点产生一个90碱基对片段。这种多形的片段作为等位基因显示，而每个都显示和不同品种的增加一胎多仔数量相关。这样一个猪的杂合子用Alul片段显示一个模式为124,110,90,79,77和67，一个纯合子用多形的剪切位点显示了一个模式为124,90,79,77,67，而另一个纯合子显示了一个模式为124,110,79,77,67。这种基因型与一胎较多仔数量相关，另一个用在不同的品种。总结出相似的情况，公开于美国专利5,374,523名称为“牛的生长激素基因的变异的等位基因产生较多牛奶的牛的遗传标记”，发明人发现一个多形质等位基因是生长激素基因，一个等位基因形式有益于泽西种乳牛，另一个形式有益于(荷兰)霍尔斯坦种乳牛。
本发明的方法适用的试剂可包装成方便的试剂盒。这种试剂盒提供了必要的物质，如成组试剂包装成适合的容器。最少试剂盒含有一种试剂，能鉴定猪催乳素受体基因的多形质，这与增加小仔数量有关。优选地，这种试剂是一组聚合链式反应(PCR)的试剂(一组引物，DNA聚合酶和4种核苷三磷酸)用猪催乳素受体基因或其一个片段杂交。优选地，这种成组的聚合链式反应(PCR)和一个限制酶能至少包括在这试剂盒中的一个地方剪切猪的催乳素受体基因。本发明特殊优选实施例中引物是SEQ ID No:1或SEQ ID No:2，限制酶为Alul。优选地，这个试剂盒进一步包括其它的装置，如试剂用于测定或测量这些可检测的实体或提供一个对照。其它的试剂如果需要，也可用于杂交，预杂交，DNA提取，显色等。
本发明的方法和物质也能用于评价猪的DNA，个体猪的遗传的类型和检测猪的遗传变异。特别地，一个猪的基因组DNA的样品能用一个或多个对照参考评价，测定是否一个多形质存在于催乳素受体基因中。优选地，限制性片段长度多形性(RFLP)分析是用有关的猪催乳素受体基因来进行。并且将结果与对照比较，对照是一个不同猪的催乳素受体基因的一个RFLP分析的结果，其猪的催乳素受体基因的多形质是已知的。相似地，一个猪的催乳素受体基因型通过获得的基因组DNA的样品来测定，对这种DNA中的催乳素受体基因的RFLP进行分析，并与对照比较结果。另，对照是一个不同猪的催乳素受体基因的RFLP分析的结果。这个猪的基因型的结果通过它的催乳素受体基因的多形质来确定。最后，不同猪的遗传变异能由至少来自两头猪得到的基因组DNA的样品来测定，鉴别在催乳素受体基因中的一种多形质的存在与否，并比较结果。
这些实验对鉴别和一胎多仔数量有关的遗传标记是有用的，如上所述，用于鉴别和其它特征相关的催乳素受体基因中的其它的多形质，并用于一般的猪的基因型和类型的科学实验。
本发明的遗传标记、方法和工具对在猪的品种、谱系和种群中改善一胎多仔数量的一个繁殖计划也是有用的。母猪繁殖的连续选择至少是杂合子最好是纯合子，用于和增加一胎多仔数量相关的多形质能导致品种或谱系的雌性的每个小仔有较高数量的后代。因此，标记是选择性工具。
尽管本发明是对一个特殊问题或环境的解释，本领域普通技术人员能够从中理解，本发明的产品和方法将在下面实施例中进行说明实施例1由于高的序列同源性和转录方法的相似性，人类的(Boutin等人，1989)和兔的(Edery等人，1989)催乳素受体的cDNA序列编码被用来设计简并引物重叠在3’编码处和未翻译区。在猪基因组DNA样品和用人的作对照引物放大一个片段中约在第500碱基对。这种正向引物为5’-TCA CAA GGT CAA C/TAA AGA AG-3’(SEQ ID No:4)而反向引物为5’-TGG/A AGA AAG/A AGGCAA G/ATG GT-3’(SEQ ID No5)用在下列聚合链式反应(PCR)条件为93℃,3分钟；6个循环93℃,30秒；47℃,2分钟；72℃,3分钟，36个循环93℃,30秒；53℃,2分钟，72℃,5分钟，最后72℃,5分钟。最后加入Taq聚合酶，样品保持在80℃。
从两种动物来的片段被纯化，在正向和反向定向排序。来自编码区的序列被翻译成氨基酸，并和已知的序列比较。一个数据库研究报导兔和人的催乳素受体(PRLR)序列作为两个最好的吻合，分别为82％和74％为阳性。来自猪DNA序列，引物(正向物5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’(SEQ ID No:1)和反向引物5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3’(SEQ ID No:2))被设计来放大一个457碱基对片段(图1)。这种限制性内切核酸酶为Taq1,Sau3a,Pvull,Mspl和Alul被用来消化放大的产品，通过Alul在基因的编码区发现一种多形质。用琼脂糖凝胶电泳(图2)得到带状分离。这种片段的类型，它的聚合链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)约在片段的124,110,79,77和67碱基对，具有多形的位点位于110碱基对片段。当这种多形的剪切位点出现在片段的90碱基对。见图4用于片段产生的模式。一个PiGMaP参考家系(Archibald等人1995)用提供信息的所用的家系进行基因分型，用CriMap软件对基因型用两点连接来分析(Green等人1990)以优势对数(LOD)比数大于3为有意义。这种催乳素受体(PRLR)的基因座与3个标记物紧密相连，它公开发表的PiGMaP连接图谱中的猪染色体16上发现。也做了多点分析产生一个最好的染色体16基因图谱(图3)，包括所有的连接标记。
实施例2用催乳素受体遗传标记的聚合链式反应(PCR)实验聚合链式反应(PCR)放大实验优选下列参数。
引物正向引物5’-CCCAAAACAGCAGGAGAACG-3’(SEQ IDNo:1)反向引物5’-GGCAAGTGGTTGAAAATGGA-3’(SEQ ID No:2)PCR条件混合物混合 25uL反应物10×PCR缓冲液(Promega) 2.5uL25mM Mgcl2(Promega) 2.0uL10mM dNTP’s(Boehringer Mannheim)0.5uL20pmol/uL正向引物0.5uL20pmol/uL反向引物0.5uLdd无菌水 17.5uL12.5ng/uL DNA1.5uLTaq聚合酶(Promega) 0.125uL前面六种试剂混合为18.5uL，预混合加入每个试管。然后加入DNA，再重叠滴加灭菌的矿物油，试管放在循环仪的一端保持在80℃，将Tag与保留的混合液混合并加5uL到试管，使其确实埋在油的顶层之下。
热循环仪计划1．93℃3分钟2．93℃30秒3．60℃1分钟4．72℃1分钟5．回到第2步骤，进行34个循环6．72℃3分钟7．保持在4℃5uL的PCR产品加入2uL的6×加样染料被放到一个1％琼脂糖凝胶上进行检测。在120V用溴化乙锭染色30分钟。
用Alul消化消化混合液(每20uL PCR产品) 每uL10×NEBuffer2(新英国生物实验室) 2.5uL8U/uL Alul(新英国生物实验室)0.5uL加灭菌水2.0uL混合这些试剂并加5uL到每个试管，在37℃培养这种样品一夜。
凝胶电泳由加样分离片段，消化产品加5uL6×加样染料于一个6％NuSieve(FMC)琼脂糖凝胶上，在120V室温下3小时。用具有溴化乙锭的凝胶染色。用PCR-RFLP实验确定片段的类型约在124,110,79,77和67碱基对，用多形的位点位于片段的110碱基对。片段的多形剪切点存在一个90碱基对上产生。因此，一个杂合子能有带状存在于124,110,90,79,77和67位点上。而纯合子的带状分别在124,90,79,77和67及124,110,79和67。
图4是一个由PCR实验得到的片段图(A是没有Alul位点的等位基因，B是有Alul位点的等位基因)。
实施例3基因型和一胎多仔数量有关聚合链式反应(PCR)实验由猪改进公司(PIC)在几个母猪中如实施例2详细地进行。由PIC公司列出19只母猪用作实验动物，它们是6个月期间内的同一窝，小猪在这期间出生，它们保持作为繁殖的家系。采集血或组织样品，并送到实验室，提取样品的DNA，用作催乳素受体(PRLR)和聚合链式反应(PCR)实验。有1～3个雌性猪实验记录用于分析。用新生的小仔的总数来评价繁殖系数(BV TNB)，母猪的每次成功的产子数用一个混合的线状的模型作为一个重复的记录。只用前三窝的母猪。这种模型包括一窝内嵌组的小仔的相关的寿命，窝数固定的作用，所用的类型(自然地或人为地)饲养小仔的月份，及随机的永久的环境和动物影响。采用的电流h2为0.10并可重复为0.21。平均生产的小仔数(AV NB)用每个雌猪总的窝数(1-3)取算术均数来计算。用新生产的小仔总数来评价繁殖的系数(BV TNB)和平均生产小仔数(AV NB)做基因型的比较，将BV TNB和AV NB单个地平均用于每个基因型。结果见表1。
表1用催乳素受体(PRLR)基因型同一谱系的19个母猪的样品的平均数BB基因型(n=18) BV TNBAV NB平均 0.203610.32Std Dev0.39841.746193Std Err0.09390.411838AB基因型(n=75) BV TNBAV NB平均AB 0.12039.66Std Dev AB 0.53172.77238Std Err AB 0.06220.320136AA基因型(n=109)BV TNBAV NB平均AA 0.07559.75Std Dev AA 0.57572.51 3279Std Err AA 0.05510.243064实施例4用一种大白系，一种Meishan合成系和Landrace系的猪做催乳素受体分析的概括来自1077只母猪的总的2714只记录的小仔，包括一胎多仔数量分析。特征包括5种不同的来自PIC系的母猪新生的小仔总数(TNB)，新生的存活的仔数(NBA)。这5个测试系是大白种(两个不同的起源)，Landrace起源种，以及合成系由3/4的Duroc种，1/4大白种组成，大白种/Meishan起源种。这种催乳素受体(PRLR)基因型显示了这些实验系中有3个系在一胎多仔变异上解释为在统计学上有意义。有两个系没有显示任何统计学上有意义的影响(P＞0.1，结果没有显示)。3个系有统计学意义的每个系的新生的小仔的总数(TNB)和新生的存活仔数(NBA)的最小适合的平均值总结在表2中。
由血液和尾组织提取DNA，如上述实施例2一样分析DNA。
模型包括固定的作用如畜群活动期，使用的类型，催乳素受体，窝数(1,2,3+)，相关变异；雌激素(ESR)和随机的影响种畜。
畜群之间的相互作用，雌激素受体(ESR)和催乳素受体(PRLR)用于实验也有意义，用于小仔特征的遗传率表面分别为0.10和可重复为0.21。等位基因的可替代的作用通过催乳素受体(PRLR)可替代的基因型来评价一个相关变异的杂合子，它包括一个等位基因存在的数(0,1或2)。由纯合子平均基因型的平均值作为杂合子的偏差的意义来评价优势作用。
主要结论·大白种合成种·指出一个优势作用样品用1197只记录的小仔的400只母猪组成。AA动物在新生的存活仔数量(NBA)方面有一个0.66猪/小仔的优点，超过其它两个基因型(P＜0.05)。指出了B等位基因的优势作用。
·Meishan合成种·显性作用有意义(超显性)一超过所有的窝，但主要是第一窝。
样品用832只记录的小仔的261只母猪组成。有一个另外的显性作用，其新生的总的小仔数TNB(P＜0.05)，新生的小仔存活数NBA(P＜0.05)，在此系中NBA有超显性的作用(＜0.01)。
·Landrace合成种·指出一种附加作用样品用685只记录的小仔的416只母猪组成。已经测定一个猪的每个小仔中两个纯合子基因型之间存在一个较大的不同，用两者表示TNB(P＜0.08)和NBA(P＜0.1)，具有A等位基因是可用的。
在新生的小仔的总数(TNB)的作用和新生的小仔的存活数(NBA)在每个种群都显示了相同的倾向。结果在表2中指出催乳素受体(PRLR)在3个商业系中对一胎多仔，如TNB和NBA测量的结果都产生一个有意义的作用。这表明每个不同的品系的遗传背景在它的品种和数值大小中起着作用，这些就是特征的作用。另外，用此系的任何新生的后代出生重量的平均值在实验中没有发现有意义的变异，这是一个潜在的观察价值，如在小仔数量和新生小仔的平均重量之间有一个正常的相反的关系。催乳素受体的等位基因可能因此而提供一个增加一胎较多仔的重量的方法。
表2用三种商业猪系在每种催乳素受体(PRLR)基因型的最小的适合的平均值用TNB,NBA和平均的出生重量(ABW)表示超过每一代的平均值。
<p>a=附加作用；d=优势作用；作用是有意义的在aP＜0.1,bP＜0.05,cP＜0.01实施例5不同品种之间的变异另外，样品来自七种已分类的品种，包括美国品种ChesterWhite种；Duroc种Hampshire种；Landrace种；和Yorkshire种；中国的Meishan种和European Large White种(表3)表3<
一些品种在PRLR的基因频率存在不同，一个多形质存在位于基因的3’区是重要的，因为PRLR另一个剪接在这个基因区的另一地方发现，许多品种的等位基因的频率不同，建议一个等位基因在一些种群的选择可能和另一种的相反。
下面参考资料引入本发明作为参考。
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权利要求
1．一种筛选猪的方法，它用于测定那些更能生产一胎较多仔的猪，包括由猪得到基因物质的样品；在催乳素受体基因中存在一种多形质的实验；所述的样品与增加一胎多仔数量有关。
2．根据权利要求1的方法，其特征在于所述的实验步骤可从一组中选择，包括分析限制性片段长度多态性(RFLP)，单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
3．根据权利要求1的方法，其特征在于所述的实验步骤用于所述的多形质的存在，包括步骤用限制酶消化所述的基因物质，那样至少在一个地方剪切猪的催乳素受体基因；分离来自所述的消化液得到的片段；测定所述的片段产生的限制模式；还包括用所述的限制酶得到的猪的催乳素受体基因的所述的模式具有一个第二限制模式，其特征在于所述的第二限制模式和增加小仔数量有关。
4．根据权利要求3的方法，其特征在于所述的限制酶是Alul。
5．根据权利要求3的方法，其特征在于所述的分离是用凝胶电泳。
6．根据权利要求3的方法，其特征在于所述比较限制模式的步骤包括鉴定具体片段和比较片段的大小。
7．根据权利要求3的方法，进一步的步骤包括用前述的消化步骤放大一定量或一部分猪的催乳素受体基因，因为那里含有所述的多形质。
8．根据权利要求3的方法，其特征在于所述的多形质是一个多形的Alul限止位点。
9．根据权利要求8的方法，其特征在于所述的限止位点位于猪的催乳素受体基因的3’编码位。
10．根据权利要求7的方法，其特征在于所述的放大包括的步骤选择能够放大含有一个多形的Alul位点的猪催乳素受体基因的一个区的正向和反向序列引物。
11．根据权利要求10的方法，其特征在于所述的正向和反向引物的选择是依赖于SEQ ID No:3。
12．根据权利要求10的方法，其特征在于所述的引物是SEQID No:4和SEQ ID No:5。
13．根据权利要求12的方法，其特征在于所述的正向引物选自一组包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:4，而所述的反向引物选自一组包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:5。
14．根据权利要求12的方法，其特征在于所述的成组的引物包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。
15．根据权利要求6的方法，其特征在于所述测定所述的片段的不同类型的步骤包括存在已知类型的一个对照DNA片段的凝胶电泳类型来分离所述的片段；用一个探针与所述的分离片段接触使其和所述的片段杂交形成探针片段复合物；并用测定探针片段复合物的存在来测定分离片段的类型并用有关的所述的对照DNA片段来测定它们的相对位置。
16．根据权利要求15的方法，其特征在于所述的限制酶是Alul，而所述的RFLP是从一组包括一个110碱基对片段和一个90碱基对片段提取的。
17．一种用于猪仔数量的鉴别基因标记的方法包括步骤来自同一品种或杂交品种或类似的基因谱系的衍生物的雌雄猪繁殖；测定每个母猪产生的后代的数量；测定每个母猪的催乳素受体基因的多形质；每个母猪具有的多形质和产生的后代数量有关，因此可用于鉴别猪仔数量的一种多形质。
18．根据权利要求17的方法，还包括通过所述标记对预测能增加一胎多仔数的育种猪的选择的步骤。
19．根据权利要求17的方法，所述的分析包括用限制酶Alul消化PCR放大的DNA。
20．根据权利要求14的方法，其特征在于与增加一胎多仔相关的多形质，用第一和第二引物SEQ ID No:1和2其中至少包括4个相接续的碱基对来测定。
21．用于评价猪的DNA样品的一种试剂盒包括一种容器和一组试剂能鉴定猪的催乳素受体基因中的一种多形质。
22．根据权利要求21的试剂盒，其特征在于所述的试剂是一种用具有猪催乳素受体基因或及其一个片段放大的引物。
23．根据权利要求24的试剂盒，进一步包括一种DNA聚合酶，一种在至少一个地方剪切猪的催乳素受体基因的限制酶；和能够放大含有多形的位点的猪催乳素受体基因的一个区的第一和第二引物。
24．一种用于评价猪催乳素受体基因中存在多形的Alul位点的引物，其特征在于所述的引物包括选自一组的序列包括SEQ IDNo:1,SEQ ID No:2,SEQ ID No:4和SEQ ID No:5。
25．一种与增加猪的一胎多仔的数量有关的遗传标记，所述的标记包括在猪催乳素受体基因中的一种多形质。
26．根据权利要求25的遗传标记，其特征在于所述的多形质是一个Alul限止位点。
27．根据权利要求25的标记，其特征在于所述的多形质是位于猪催乳素受体基因的翻译的和未翻译的3’区。
28．来自猪催乳素受体基因的3’翻译的和未翻译区的DNA序列，所述的序列包括SEQ ID No:3。
29．为放大猪催乳素受体基因的多形的Alul限止位点而设计的一种引物，所述的引物是4个或更多个来自SEQ ID No:3的连续的碱基。
30．用于放大猪催乳素受体基因的多形的Alul限止位点而设计的引物，其特征在于所述的引物是从SEQ ID No:3产生的一种反向引物。
31．一种筛选猪的方法，用于测定那些更能生产一胎较多仔的猪，和/或那些很少能生产一胎较多仔的猪，这种方法包括的步骤测定猪催乳素受体存在的等位基因；用已知的基因测定影响一胎多仔的其它标记的等位基因；选择能够结合的等位基因的动物，淘汰那些不能结合的等位基因的动物。
32．根据权利要求31的方法，其特征在于测定一胎多仔数量的第二基因是ESR。
33．根据权利要求31的方法，其特征在于催乳素受体的等位基因的测定包括测定至少与一种DNA标记无论是直接还是间接连锁到催乳素受体有关的至少一种等位基因的存在。
34．根据权利要求31的方法，其特征在于DNA标记是一种微卫星。
35．根据权利要求31的方法，其特征在于DNA标记是SW1305,S0077,S0006,SW2411,SW1035和S0111。
36．根据权利要求31的方法，其特征在于DNA标记是生长激素受体(GHR)。
37．根据权利要求1的方法，其特征在于所述的标记与维持一胎较多仔的出生重量有关。
38．一种筛选猪的方法，用于测定那些更能生产一胎较多仔的猪，包括从猪得到基因物质的样品；在催乳素受体基因中一种多形质存在的实验，所述的样品与维持一胎较多仔的猪出生重量有关。
全文摘要
本发明公开了用于猪的一胎多仔数量的基因标记,鉴别这些标记的方法,筛选猪的方法,测定那些更能生产一胎多仔的猪并取筛选的那些猪用于进一步繁殖目的。这种标记依赖于猪催乳素受体基因编码含有的特定多形质的存在或缺失。
文档编号C12Q1/68GK1230227SQ9719774
公开日1999年9月29日 申请日期1997年6月30日 优先权日1996年7月19日
发明者马克思·F·罗切斯特, 埃米·L·文森特, 克里斯托弗·K·塔格尔 申请人:衣阿华大学研究基金会有限公司