来自枯草芽孢杆菌的植酸酶,编码所述植酸酶的基因,该基因产物的生产方法及其用途的制作方法

专利名称：来自枯草芽孢杆菌的植酸酶,编码所述植酸酶的基因,该基因产物的生产方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植酸酶，编码植酸酶的核酸以及植酸酶的生产方法和它的用途。
背景技术：
亚磷是生长的必需元素。在许多食品和动物饲料中，亚磷主要是以磷酸盐的形式存在，并且同被称作植酸酶(肌醇六磷酸激酶)的分子共价结合。由于肌醇六磷酸自身没有被消化好并且磷酸盐在很大程度上是在动物的小肠内被吸收的，磷酸盐在肌醇六磷酸中螯合并且没有在动物的小肠内被吸收，而是经过消化道并且被排泄掉。这造成亚磷对土地和水系的生态负担增加。另外，由于植酸酶可同许多必需矿质元素形成螯和物，并且抑制它们在消化道内的吸收，因此，植酸酶会降低食品或饲料的营养价值。
另一个同肌醇六磷酸的低消化率相关的问题是需要向动物饲料中加入无机磷酸盐，这样会使饲料的价格增加。
肌醇六磷酸是由被称作植酸酶的酶所转化的，该酶催化肌醇六磷酸水解成为肌醇和无机磷酸盐。在麸皮和植物种子中有植酸酶并且已知可用各种微生物，包括酵母，真菌和细菌来生产植酸酶。
在已知的真菌植酸酶中，Yamada等将土曲霉植酸酶纯化到均质(农业生物化学，32(10)(1968),1275-1282)，并且显示出该植酸酶的最适pH值为4.5，在pH值为4.5时最适温度为70℃并且在30到60℃的温度范围内是热稳定的。但是，所述酶在中性pH值下，特别是在pH值为7.0时则完全失活。
另外，H.J.Ullah和D.M.Gibson分离并鉴定了无花果曲霉植酸酶(Preparative Biochemistry,17(1)(1987),63-91)，并且显示出该植酸酶具有两个最适pH值，一个是2.2，另一个是5.0-5.5，在pH值为5.0时，最适温度为58℃并且在pH为5.0时直到68℃时都是热稳定的。但是，正如土曲霉植酸酶的情况一样，无花果曲霉植酸酶在pH值为7.0时也失去活性。
已经对来自土曲霉(EP 684 313)和无花果曲霉(EP 420 358)以及黑曲霉awamori变种(Piddington等，(1993)基因，133,55-62)的编码植酸酶的DNA序列做了鉴定并进行了重组表达。
也知道象枯草芽孢杆菌(V.K.Powar和V.Jagannathan,(1982)细菌学杂志，151(3),1102-1108)和枯草芽孢杆菌(纳豆变种)(M.Shimizu,(1992)生物科学、生物技术、生物化学，56(8),1266-1269和日本专利申请6-38745)一类的细菌也可以作为植酸酶的来源。
用SDS-PAGE将Shimizu(上文)描述的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶纯化至均质，显示出的分子量在36和38kD之间。当在含有0.1M马来酸，2mM的氯化钙和1.6mM的肌醇六磷酸钠的分析溶液中于37℃下测定时，该酶的最适pH值在6.0和6.5之间，当在含有0.1M的Tris-HCl缓冲液，2mM的氯化钙和1.6mM的肌醇六磷酸的溶液中于37℃下测定时，该酶的最适pH为7.0。该植酸酶的最适温度为60℃而且当该酶在上面提到的含有Tris-HCl缓冲液的溶液中温浴15分钟时，该酶直到50℃时还是稳定的。在含有所述Tris-HCl的溶液中纯化的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶的报道比活为8.7U/mg蛋白。将一个单位的植酸酶定义为在这样的分析条件下，每分钟释放1微摩尔的磷酯酰肌醇所需要的酶量。始终使用这一定义。
Powar等(如上文)描述了从枯草芽孢杆菌中分离出分子量为36.5kD并且具有肌醇六磷酸专一性的植酸酶制剂。这种酶制剂是用SDS-PAGE所纯化，并且发现包括两种植酸酶同功酶，当在含有0.1M的Tris-HCl缓冲液，0.5mM的氯化钙和0.34mM的肌醇六磷酸钠的检测溶液中于30℃下测定时，该酶所显示出的最适pH值在7.0和7.5之间。在60℃下，该植酸酶同功酶混合物显示出最大的活性并且直到70℃都是稳定的。所报道的在上述检测溶液中测定的纯化酶的比活为8.5到9.0U/mg蛋白。另外，据Powar等人(上文)报道，纯化的同功酶混合物具有水解蛋白的活性，这样会导致活性的丧失。
目前还不知道芽孢杆菌植酸酶的氨基酸序列和编码芽孢杆菌植酸酶的核酸序列。
在处理食品和动物饲料的过程中向食品和动物饲料中添加天然或重组的植酸酶，从而使肌醇六磷酸经酶转化为可消化的磷酸盐，已经有了关于这种想法的描述。JP-A-38745描述了用纯化的天然存在的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶在处理饲料和食品中的用途。另外EP420358和EP684 313中描述了曲霉植酸酶在动物饲料中的用途。
而且，也有人建议在已经被处理过的动物饲料中加入植酸酶以使所述植酸酶的酶促反应发生在动物的消化道内。
但是，在处理食品或动物饲料的温度和/或pH值下(一般是65到95℃,pH5.5到7.5)以及在单胃动物的小肠内的pH值下(一般是37-41℃,pH5.5到7.5)，上述曲霉植酸酶或者失活或者丧失了大部分活性。
而且，在上述条件下，上述芽孢杆菌植酸酶的比活及其相对活性非常低。
发明概述因为在食品处理过程中所用的、以及动物的消化道内的温度和/或pH值有所不同，所以希望提供一种在处理食品和动物饲料的温度和/或pH值下、以及在动物的消化道内的温度和/或pH下仍然具有较高比活和较高相对活性的植酸酶，从而既能使植酸酶的效果在处理食品和饲料的过程中以及在动物消化道的消化过程中能够达到最大，又能减少由动物饲料中含有的肌醇六磷酸被消化后所产生的亚磷对环境的影响。
而且，为了能够更经济地生产所述食品和动物饲料，也需要一种能够大量生产满足上面标准的植酸酶的方法。
本发明的目的之一是提供一种具有高比活的植酸酶，在食品和饲料的处理过程中能够具有高的相对活性和/或在养殖动物的消化道内能够具有高的相对活性。
本发明的另一个目的是提供编码本发明中植酸酶的核酸分子。
本发明的另一个目的是提供一种生产所述植酸酶的方法以及将所述植酸酶提供给所述动物。
下面详细的说明书会使本发明的其它目的更加清楚。
本发明的主题是植酸酶或其功能衍生物，是以所述植酸酶的比活至少是20U/mg蛋白为特征的，其中所述的比活是通过在含有100mMTris-HCl,pH7.5,1mM的氯化钙，和1.6mM的肌醇六磷酸钠溶液中于37℃下使植酸酶温浴30分钟而测定出来的。在上述条件下测定时，优选地，本发明植酸酶在具有的比活至少29U/mg蛋白，更优选地是80U/mg蛋白，最优选地是88U/mg蛋白。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述植酸酶的最适pH值至少有一个是pH6.5，其中所述的最适pH是通过在含有100mM的Tris-马来酸，1mM的氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下使植酸酶温浴30分钟而测定出来的，或者最适pH值至少有一个是pH7.0，其中所述的最适pH是通过在含有100mM的Tris-HCl,1mM的氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下使植酸酶温浴30分钟，或者通过在含有麸皮提取物，1mM的氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下使该植酸酶温浴30分钟而测定出来的。
在食品或饲料的处理过程中以及养殖动物的消化道中，植酸酶具有相当高的活性是有利的，这样可使该酶在两种情况下都能较好地行使其功能。同所述植酸酶在养殖动物的消化道内，优选地是嗉囊和/或小肠内的活性相比较，在处理饲料或食品的过程中，本发明的植酸酶的活性优选地是大于等于30％，更优选地是大于等于35％，最优选地是大于等于37％。
另外，优选地，所述植酸酶在有动物小肠内发现的消化酶存在时能够行使其功能。在动物小肠内发现的酶包括象胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和脂酶一样的胰酶。
本发明涉及的植酸酶具有上述一个或多个特性。
本发明的植酸酶可从微生物中获得，优选的微生物是芽孢杆菌菌株，更优选的是选自包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的菌群，最优选的是于1996年8月1日保藏在位于苏格兰的国家工业和海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)的枯草芽孢杆菌B13株，登记号为NCIMB-40819。
在一个优选的实施方案中，本发明的植酸酶含有与SEQ ID NO:1相应的氨基酸序列或其功能衍生物。在涉及到植酸酶时，整个说明书中的术语“其功能衍生物”是用来说明具有本发明植酸酶功能特性的植酸酶衍生物。植酸酶的功能衍生物包括天然存在的，合成的或重组生产的肽或肽的片段，具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加而仍具有本发明植酸酶一般特性的突变体或变异体。
本发明的另一个主题是一个分离的核酸或其功能衍生物，该核酸编码具有上述特性中的一种或多种的植酸酶。优选地，所述核酸含有与SEQ ID NO:1相应的DNA序列或其功能衍生物，或含有能够同与SEQID NO:1相应的DNA序列或其功能衍生物杂交的DNA序列。
本发明的进一步的主题是一个分离出的核酸，该核酸编码植酸酶或其功能衍生物，并且所述核酸是以其能够与根据SEQ ID NO:1的DNA杂交并编码所述植酸酶为特征的，所述植酸酶具有的最适pH值大于等于5.0而且比活至少为10U/mg蛋白，这一比活是在含有100mM的马来酸-Tris,1mM的氯化钙和1.6mM的肌醇六磷酸钠的检测溶液中于37℃下30分钟后测定出的。
所述核酸优选的是DNA分子。在涉及到编码植酸酶的核酸时，整个说明书中的术语“其功能衍生物”是用来说明具有编码植酸酶的功能特性的核酸衍生物。编码本发明植酸酶的核酸功能衍生物包括天然存在的，合成的或重组生产的核酸或其片段，具有一个或多个核酸缺失、取代或添加而仍编码具有本发明特性的植酸酶的突变体或变异体。编码本发明植酸酶的核酸变异体包括根据本技术领域公知的遗传密码简并性原理的等位变异体和变异体。编码本发明植酸酶的核酸突变体包括通过定点诱变技术产生的突变体(例如见，Botstein,D.和Shortle,D.,1985,科学229:1193-1201和Myer,R.M.,Lerman,L.S.,和Maniatis,T.,1985,科学229:242-247)，易错聚合酶链式反应(例如见，Leung,D.W.,Chen,E.,和Goeddel,D.V.,1989,Technique 1:11-15；Eckert,K.A.和Kunkel,T.A.,1991，聚合酶链式反应方法应用1:17-24；和Cadwell,RC.和Joyce,G.F.,1992，聚合酶链式反应方法应用2:28-33)和/或本领域公知的化学诱导突变技术(见例如，Elander,R.P在基础生物技术中的“微生物筛选，选择和菌株的进展”，J.Bu’lock和B.Kristiansen编辑，学院出版社，纽约，1987,217)。
本发明的主题也涉及一种生产本发明核酸产物的方法，其特征是，含有上述核酸的探针在标准条件下能够同被怀疑含有所述核酸的样品进行杂交以及回收所述核酸。将所述探针用于杂交的标准方法包括Southern印迹(例如见，Sambrook等，分子克隆，实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989)，PCR和RT-PCR(例如见，PCRProtocol方法和应用指南，Innis,M.A.,Gelfand,D.H.,Sninsky,J.J.和White,T.J.编辑，学院出版社纽约，1990)。杂交的优选标准反应条件是6x SSC,0.5％SDS，在50℃下过夜，或用于Southern印迹和PCR的功能等同的条件下，优选的反应条件是5mM的镁离子，Taq酶，94℃下两分钟预解链，并于92℃下20秒钟循环30次以解链，在50℃下30秒钟退火并在72℃下1分钟进行延伸反应，或在其功能等同的条件下。
本发明的主题也涉及一个含有本发明DNA分子的载体。优选地，所述载体的特征是，所述DNA分子可有效地连接到能够使所述DNA序列表达植酸酶的调节序列中。优选地，所述DNA分子含有能够使所述植酸酶进行分泌的前导序列。所述调节序列可包括原核或真核调节序列。
本发明所设计的DNA序列或载体所表达的本发明植酸酶的成熟形式可以带有或不带有天然植酸酶信号序列或在芽孢杆菌其它原核或真核细胞中行使功能的信号序列，这要根据本发明植酸酶是在细胞内表达还是分泌到细胞外而定。既可通过去除信号序列也可通过部分去除所述信号序列来实现表达。
本发明的主题还涉及用上述核酸或载体转化的原核细胞。优选地，所述宿主细胞选自包括大肠杆菌，芽孢杆菌属，乳杆菌和乳球菌的菌群。
本发明的主题还涉及用上述核酸或载体转化的真核细胞。优选地，所述宿主细胞选自包括曲霉属，腐质霉属，毕赤氏酵母属，木霉属，糖酵母属，以及象大豆，玉米和油菜籽一样的植物类群。
本发明的主题也涉及到植酸酶重组产物的生产方法，该方法的特征是，在适宜的条件下培养上述真核或原核宿主细胞并回收所述植酸酶。
关于本发明植酸酶的一个优选的实施方案是根据上述方法获得植酸酶。
本发明的进一步的主题是能够生产本发明植酸酶的微生物细胞或孢子的用途，即作为微生态制剂或可直接用于饲养动物的微生物产品。所述用途的优选的实施方案是本发明中产植酸酶的芽孢杆菌属和乳杆菌属。
本发明的进一步的主题也是本发明植酸酶在食品或动物饲料中的用途。
本发明的进一步的主题是含有植酸酶的食品或动物饲料。优选地，所述食品或动物饲料含有作为添加剂的植酸酶，且在所述动物的消化道内，优选地在所述动物的嗉囊和/或小肠内是有活性的，优选地，所述动物选自由包括家禽的鸟类，包括牛、羊和猪的反刍动物类以及包括鱼和虾的水生养殖动物类所构成的类群。优选地，所述添加剂在食品或饲料的处理过程中是有活性的。
本发明进一步的主题也是用于生产食品或动物饲料的方法，该方法是以将本发明的植酸酶同所述食品或动物饲料相混合为特征的。所述植酸酶在处理前以干燥产品形式添加，或者在处理前或处理后以液态产品添加。如果使用的是干粉，应当将植酸酶以液态形式稀释到象被研磨的谷物一样的干燥载体上。
本发明的主题也涉及食品或动物饲料的生产方法，该方法的特征是，将能够表达本发明植酸酶的原核细胞和/或孢子加入到所述食品或动物饲料中。
本发明的主题也涉及在肌醇和无机磷酸盐的产物中，有或没有辅助磷酸酶时本发明植酸酶的用途。
本发明的进一步的主题是减少动物粪尿中亚磷水平的方法，这种方法的特征是，所述动物是用本发明的动物饲料喂养的，饲料的用量能够有效地转化所述动物饲料中含有的肌醇六磷酸。定义在整个说明书中将术语“植酸酶”定义为一种能够催化肌醇六磷酸水解并释放无机磷酸盐的蛋白或多肽。
在整个说明书中将植酸酶的比活定义为含有植酸酶的溶液中每毫克蛋白的单位(U)数，其中所述植酸酶作为一个单独的电泳带可通过SDS-PAGE检测出来。1个单位是指当所述酶在含有100mM的Tris-HCl,pH7.5,1mM氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下温浴30分钟时，每分钟释放1微摩尔Pi所需的酶量。
在整个说明书中将植酸酶的相对活性定义为，同所述酶在最适温度和/或pH值时的活性相比，该酶在一定的温度和/或pH值条件下的活性。
附图的简要说明

图1植酸酶的SDS-PAGE凝胶纯化(方法)；图2纯化的植酸酶的等电聚焦凝胶；图3在不同的温度下，pH值对植酸酶活性的影响；图4在给定的缓冲液中pH值对植酸酶的温度活性分布图的影响；图5在不同的温度下，pH值对小麦麸皮提取物中植酸酶活性的影响；图6pH值对小麦麸皮提取物中植酸酶温度活性分布图的影响；图7在相当于处理饲料和消化过程中的温度和pH值的条件下，植酸酶的相对活性；图8用从氨基酸序列中推导出的引物以使编码枯草芽孢杆菌植酸酶基因进行PCR扩增反应的结果；图9枯草芽孢杆菌植酸酶的基因结构。本发明的详细描述通过下面的实施例对本发明进行更加详尽的说明。实施例1在整个研究过程中所用的枯草芽孢杆菌B13保藏在位于苏格兰的国家工业和海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)，登记号为NCIMB-40819。培养基用每升含有5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨和10gNaCl的Luria培养基培养接种物以生产植酸酶。
用小麦麸皮提取物作为生产酶的培养基并按如下面方法来制备。用1000毫升在121℃下高压灭菌60分钟的水对100克小麦麸皮进行提取。用六层干酪虑布过滤提取物，然后加水将提取物的体积调节到1升。向该提取物中添加0.4g的(NH4)2SO4,0.2g的7水硫酸镁，10g酪胨，0.5g磷酸二氢钾和0.4g磷酸氢二钾。提取物最终的pH为6.5。将提取物基质在121℃下高温灭菌15分钟。在接种前，加入5％的氯化钙(已经过滤灭菌的)使其最终浓度为0.2％。酶的生产接种物从添加有0.2％氯化钙的Luria培养基的冷冻原种中长出。最初的接种物于30℃下在旋转式摇瓶机中生长24小时。向小麦麸皮培养基中逐次加入10％的接种物使培养物按比例逐步增加。将5升批次的培养物在小麦麸皮培养基中于30℃下振荡培养91小时以生产酶。蛋白质分析用牛血清清蛋白作为标准，根据生产商的建议，用Bio-Rad ProteinMicroassay Procedure测定了蛋白质的浓度。植酸酶的纯化除非另有说明，所有的纯化步骤都是在0-4℃下进行的。将细菌在7000xg下离心沉淀30分钟。测定所收集上清液的体积并加入氯化钙使最终浓度达到1mM。在不断搅拌的过程中向上清液中加入3个体积的冰乙醇(-20℃)使酶沉淀出来。持续搅拌45分钟使沉淀反应过夜。通过在1800xg下离心20分钟来收集沉淀。所得的沉淀用冰乙醇(-20℃)洗涤一次再用冰丙酮(-20℃)洗涤一次。在氮气流的条件下，将过量的丙酮从沉淀中蒸发掉，然后用冷冻干燥法完成干燥。
干燥的沉淀被溶解在100mM的Tris-HCl,pH7.5，并添加有1mM氯化钙的300ml溶液中。在不断搅拌下向该溶液中缓缓加入硫酸铵直到饱和度为65％。将溶液在4℃下温浴过夜，于4℃下在9000xg的转速下离心60分钟以使该溶液澄清然后加入硫酸铵使饱和度达到85％，再将溶液在4℃下温浴过夜，然后加入硫酸铵使饱和度达到85％。按前面的方法收集沉淀然后溶解在100mM的Tris-HCl,pH7.5，并添加有1mM氯化钙的溶液中。在-20℃下保存酶制剂的等分试样。当在实验中要使用时，通过用PD-10(Pharmacia)凝胶过滤层析柱凝胶过滤酶制剂到所需给定的缓冲液中。纯化植酸酶的方案如表1所示。
表1纯化的植酸酶的比活度
分子量和等电点的测定根据生产商的建议，以Phamacia低分子量电泳校准试剂盒作为标准，用SDS 8-25％的梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(PhastGelSDS-page)在Pharmacia Phast电泳仪中测定上面纯化的植酸酶的分子量。以PharmaciaIEF校准试剂盒作为标准，用PhastGel IEF 3-9等电聚焦凝胶在相同的系统中测定等电点。
用SDS-PAGE测定的B13植酸酶的分子量为43,000(图1)。B13植酸酶等电点pH为6.5(图2)。底物特异性通过用每种酶的标准活性分析，测定了植酸酶的底物特异性(在0.1M的Tris-HCl,pH为7.5)。除了肌醇六磷酸外，β-磷酸甘油，6-磷酸-D-葡萄糖，对硝基苯基磷酸，ATP,ADP,AMP,1,6-二磷酸果糖，3-磷酸甘油酸，双-(对硝基苯基)磷酸和α,β-亚甲基腺苷-5’-二磷酸都被用作不同的底物。底物特异性的分析结果如表2所示。
表2植酸酶的底物特异性
酶分析除非另有说明，通过将150μl的酶制剂同2mM的肌醇六磷酸钠一起在添加有1mM氯化钙的100mM pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中于37℃下温浴30分钟而测定植酸酶的活性。温浴后，通过加入750μ1 5％的三氯乙酸以终止反应。在加入1500μl显色剂(4倍体积的1.5％钼酸铵在5.5％硫酸中的溶液和1倍体积的2.7％的硫酸亚铁；Shimizu,M.,1992；生物科学、生物技术、生物化学56:1266-1269)后，根据与磷酸盐在700nm处的标准分光光度值的比较来测定磷酸盐的解离。一个单位的酶活被定义为在实验条件下，每分钟释放1微摩尔Pi所需的酶量。比活以每毫克蛋白的酶活性单位来表示。在表3中总结了上述方法所纯化的植酸酶的特性。
表3植酸酶的特性
pH和温度活性分布图植酸酶的pH和温度活性分布图是在给定的缓冲液和小麦麸皮提取物中分析得到的。于37℃的最适条件下，分析中所用的酶浓度给出了30分钟温浴期间的线性正磷酸盐的解离。
所用的给定缓冲液是100mM的甘氨酸pH3.0,100mM的琥珀酸pH5.0,100mM的Tris-马来酸pH5.0,6.0,7.0以及8.0,100mM的Tris-HCl pH7.5,8和9。所有缓冲液中都添加2mM的肌醇六磷酸钠和1mM的氯化钙。在这些缓冲液中于不同的温度下(37,45,55,65,75℃)进行酶分析。将600μl缓冲液加热到相应的温度，并加入150μl的酶制剂以起始反应。经30分钟温浴后反应被终止，并用前面描述的方法测定解离的无机正磷酸盐。重复进行酶分析。在酶分析的开始和结束时测定反应混合物的准确pH值。按照上面的描述测定蛋白浓度并在不同的pH值和不同的温度下计算酶的比活度。
将50g小麦麸皮溶解在500ml蒸馏水中，接着在121℃下高压灭菌60分钟以制备小麦麸皮提取物。用干酪滤布过滤该提取物，并用蒸馏水将体积调整到500ml，然后在15,000rpm转速下将提取物离心15分钟并收集上清液。将上清液等分试样的pH值调整为3.0,5.5,7.0,8.0和9.0，用蒸馏水按1∶10的比例稀释并添加2mM的肌醇六磷酸钠和1mM的氯化钙。将600μl的pH值被调整过的小麦麸皮提取物加热到所需温度(37,55和75℃)并通过加入150μl的酶制剂来起始反应。温浴30分钟后反应被终止，并按照上面所描述的方法测定解离的无机正磷酸盐。重复进行酶分析。在酶分析的开始和结束时测定反应混合物的准确pH值。pH值对酶活性的影响用给定的缓冲液和调整了pH值的小麦麸皮测定pH范围从3.0到8.5之间植酸酶的相对活性。很明显，不仅缓冲液的pH值，而且缓冲液的酸性组份也影响植酸酶的活性。为了覆盖pH值的范围，使用了四种不同缓冲液或通过加入HCl或NaOH而调整了pH值的小麦麸皮提取物。由于加入酶会影响反应物的pH值，所以在30分钟温浴的开始和结束时测定了每种试样混合物的准确pH值。在反应过程中，pH值的变化是较小的。
在pH值活性图谱的确过程中用了准确的反应pH值。
图3a到3e显示了在37和75℃之间的5个不同的温度之下，B13植酸酶在给定的缓冲液中的pH活性图谱。不论温度是多少，植酸酶在pH值为7.5时都显示出最大活性。
一般地，动物混合饲料的pH值范围是5.5到7.5。
植酸酶的最适温度是55℃。在上述给定缓冲液中，pH值对植酸酶温度活性图谱的影响如图4所示。
小麦麸皮提取物可能提供了一种比任何给定缓冲液更接近于饲料和动物消化时的环境。我们在37,55和75℃下测定了植酸酶的pH活性图谱。该酶在小麦麸皮提取物中的活性是其在给定缓冲液中活性的两倍(图5a到5c)。该图谱同由给定缓冲液中得到的图谱没有差异(图6)。
图7说明了在类似于饲料加工和适用于烤焙的小鸡的消化过程中的pH值和温度条件下，两个植酸酶的比活度。用于本图的数据是从上述实验中得到的(图5a到5c)。实施例2编码植酸酶基因的克隆N-端序列的测定用Edman降解法，经Perkin-Elmer Procice测序系统测定由SDS-PAGE纯化的枯草芽孢杆菌B13植酸酶的N-端序列。得到了25个氨基酸长的N-端序列。为了获得该氨基酸序列的更多信息，用lysC酶消化纯化的植酸酶以获得内源性肽并用反相高效液相层析纯化消化产物。在反相高效液相层析纯化后，脂环化的植酸酶也进行LysC消化。用相同的系统测定通过反相高效液相层析纯化的植酸酶中未脂环化的肽的序列。使植酸酶脂环化以鉴定是否存在硫桥。脂环化和未脂环化的植酸酶LysC消化产物的反相高效液相层析谱没有差别，这表明植酸酶中没有硫桥。
测定19个纯化肽的序列，得到14个序列互不相同的肽(第5到23个氨基酸)和总共227个氨基酸。所有肽的序列如表4所示，包括相当于植酸酶N-端的序列。用质谱仪测定肽的分子量并与所计算的分子量相比较。
表4通过N-端氨基酸序列得到的肽
*N-端序列用PCR鉴定编码植酸酶的序列以这些肽的序列为基础，设计了PCR引物(见表5)。用PTC-255DNAEngine和Perkin-Elmer Taq聚合酶实施所有PCR反应。
表5在各种最适条件下，PCR引物只得到一个片段
N=A,T,G或C；I=肌苷；以按照Sambrook等(上文)分离的枯草芽孢杆菌B13 DNA为模板，用这些引物在不同的退火温度下(45,50,55和60℃)和不同的镁浓度(1.25,2.5,5和10mM)下进行PCR反应，以使PCR反应条件最优化。选择出下面的PCR方案在进行92℃下2秒钟的解链循环前，先在94℃下预解链2分钟，50℃下退火30秒钟，72℃下扩增60秒钟在，反应在5mM浓度的镁中进行。在每种最适条件下，表5所给出的引物只扩增一个片段。这些扩增的PCR片段如图8所示。
将最长的PCR片段(用引物6465和6470所扩增的)克隆到pCR 2.1载体中(Invitrogen Corp.,Inc.,圣地亚哥，美国)并用Sanger双脱氧法测定其序列。这样的结果是鉴定出了本发明植酸酶的部分DNA序列(准确长度为989bp)。植酸酶基因PCR产物的限制酶分析为了证实这些PCR片段是植酸酶片段，使用了限制酶HinfⅠ，它能够将最短的PCR片段裂解为两个长度大约为100bp的片段。用HinfⅠ切割所得片段同从N-末端得到的片段的大小一样。也用EcoRⅠ切割PCR片段，用EcoRⅠ切割的两个最长的植酸酶PCR片段证实了图9所示的草图。植酸酶基因所编码植酸酶的Southern印迹分析如Sambrook等所描述(上文，1989)，从枯草芽孢杆菌B13中分离出基因组DNA。所用限制酶来自Boehringer-Mannheim那些酶。用EcoRⅠ部分消化枯草芽孢杆菌B13 DNA并在琼脂糖凝胶中分离消化片段。将分离的片段Southern印迹到尼龙膜上。将尼龙膜同32P标记的N-端寡核苷酸探针，GA(C/T)CC(G/A/T)TA(C/T)CA(C/T)TT(C/T)AC(G/A/T)GTNAA(C/T)GC(G/A/T)GC(G/A/T)GAAAC，进行杂交以测定含有推定植酸酶基因的片段的近似大小。Southern印迹显示出有同图9给出的基因结构一致，大小约为1700bp和1000bp的两条带。枯草芽孢杆菌B13基因组文库的筛选按照生产商的建议，用StratageneλZapⅡ/EcoRⅠ/CIAP克隆试剂盒将EcoRⅠ部分消化的枯草芽孢杆菌B 13 DNA克隆到λZapⅡ中。用Boehringer-Mannheim的EasyToHyb杂交试剂盒，根据生产商提供的建议，以上述用洋地黄毒苷标记的最长PCR片段(989bp)为杂交引物，对λZapⅡ文库进行筛选。
用100,000pfu的λZapⅡ枯草芽孢杆菌B13基因组文库噬菌体侵染XL-1Blue MRF’宿主细胞。将被侵染的细胞用TOP琼脂糖在LB琼脂平皿上涂平板。将形成的噬菌斑转移到尼龙膜上并用经洋地黄毒苷标记的989bp的杂交探针进行筛选。发现一些几乎没有背景的强阳性克隆。将这些阳性克隆集中并用于第二轮杂交中。在第二轮杂交中，阳性噬菌斑仍然呈阳性，将它们集中并用辅助噬菌体切割以得到pBluescript SK(-)噬菌粒。得到的噬菌粒被转化到大肠杆菌宿主细胞中并将小量制备所得DNA用于分析插入DNA和DNA的序列。编码植酸酶基因DNA序列的鉴定编码植酸酶的DNA序列和推测的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由SEQ ID NO:1所推测植酸酶前蛋白分子量大约是41,900道尔顿，推测成熟蛋白(即没有信号序列的蛋白)的分子量大约为39,000道尔顿。这同用SDS-PAGE所测定的植酸酶的分子量一致(图1)。
成熟蛋白N-末端相对于SEQ ID NO:1的第30个氨基酸(Leu-30)。实施例3重组植酸酶在大肠杆菌中的表达用也含有用于克隆到载体pQE-30和pQE-60(Qiagen,Chatsworth,CA，美国)中的限制位点的引物，通过PCR扩增编码成熟肽的DNA。在各种情况下，5’引物编码MfeⅠ位点(与Eco RⅠ相容)以及后面跟随的一个核糖体结合位点和成熟蛋白的氨基末端。用于构建pQE-30的3’引物与天然蛋白终止密码子以及后面跟随的一个用于克隆的SalⅠ位点的下游杂交。将所得的PCR产物克隆到用EcoRⅠ/SalⅠ消化的pQE-30中。这一构建体应当生产同在氨基末端带有甲硫氨酸的成熟天然产物一样的蛋白质。
用于pQE-30和pQE-60构建体的5’引物GTTTCTCAATTGAAGGAGGAATTTAAATGCTGTCCGATCCTTATCATTTTACMfeⅠ RBS MetLeuSerAspProTyrHisPhe用于pQE-30构建体的3’引物AATAAGTCGACGTACGACCGGATTCCGGCTGTGCTSalⅠ用于pQE-30构建体的3’引物编码蛋白的C端(不含终止密码子)以及后面跟随的BglⅡ克隆位点。载体序列提供了编码组氨酸标记的核苷酸以便于所表达蛋白的纯化。将PCR产物克隆到用Eco RⅠ/BglⅡ消化的pQE-60中。可按照生产商的建议(Qiagen)，用Ni-NTA树脂从细胞裂解物中纯化这一构建体所表达的酶。
用于pQE-60构建体的3’引物AATAAAGATCTTTTTCCGCTTCTGTCGGTCAGTTBglⅡ然后将所述构建体转化到表达宿主M15/pREP4细胞系中(Quiagen)。使M15/pREP4细胞系处于感受态并用标准方法进行转化(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,分子克隆，实验手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989)。该细胞系含有一个质粒(pREP4)，该质粒能组成型地表达乳糖阻遏蛋白。这使在开放阅读框上游具有两个乳糖阻遏蛋白识别序列的pQE-30和pQE-60中的表达构建体能够被强烈抑制。载体用了能够有效地被大肠杆菌RNA聚合酶识别的噬菌体T5启动子。这些构建体在添加有氨苄青霉素，二甲氧基苯基青霉素和卡那霉素的LB培养基中于37℃下培养过夜。在新鲜培养基中将过夜培养物稀释到1∶30并生长至OD600值为0.8，在这时用1.5mM的IPTG进行诱导。在经过另外3小时的生长后，收集并洗涤细胞，并通过超声处理裂解。通过离心清除裂解物的残渣。清除后的裂解物的等分试样也用于酶分析。于42℃下，在反应缓冲液(100mM Tris-100mM的马来酸，pH7,1mM的氯化钙和2mM的肌醇六磷酸钠)中分析30分钟。所得结果如表6所示。
表6
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名芬恩饲料国际有限公司(B)街道P.O.BOX777(C)城镇Marlborough(D)城市威斯特郡(E)国家英国(F)邮政编码(ZIP):SN8 1XN(ⅱ)发明名称植酸酶，编码所述植酸酶的基因，植酸酶的生产方法和用途(ⅲ)序列数目2(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Versopm#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1290个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)最初来源(A)生物体枯草芽孢杆菌(B)菌株B13(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置91.1239(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:1接原文第28页到第31页的序列表1CACATTTGAC AATTTTCACA AAAACTTAAC ACTGACAATC ATGTATATAT GTTACAATTG60AAGTGCACGT TCATAAAAGG AGGAAGTAAA ATG AAT CAT TCA AAA ACA CTT TTG114Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu1 5TTA ACC GCG GCG GCC GGA CTG ATG CTC ACA TGC GGT GCG GTG TCT TCC 162Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser10 15 20CAG GCA AAG CAT AAG CTG TCC GAT CCT TAT CAT TTT ACC GTG AAT GCA 210Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala25 30 35 40GCG GCG GAA ACG GAA CCG GTT GAT ACG GCC GGT GAC GCG GCT GAT GAT 258Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp45 50 55CCT GCG ATT TGG CTG GAC CCC AAG ACT CCT CAG AAC AGC AAA TTG ATT306Pro Ala Ile Trp Leu Asp Pro Lys Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile60 65 70ACG ACC AAT AAA AAA TCA GGT TTA GTC GTT TAC AGC CTT GAT GGT AAG354Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys75 80 85ATG CTT CAT TCC TAT AAT ACC GGG AAG CTG AAC AAT GTC GAT ATC CGT402Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg90 95 100TAT GAT TTT CCG TTG AAC GGC AAA AAA GTC GAT ATC GCG GCA GCA TCC450Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser105 110 115 120AAT CGG TCT GAA GGA AAA AAT ACC ATT GAG ATT TAC GCT ATT GAT GGA498Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly125 130 135AAA AAC GGC ACA TTA CAA AGC ATG ACA GAT CCA GAC CAT CCG ATT GCA546Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala140 145 150ACA GCA ATT AAT GAG GTA TAC GGT TTT ACC TTA TAC CAC AGT CAA AAA594Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys155 160 165ACA GGA AAA TAT TAC GCG ATG GTG ACA GGA AAA GAG GGT GAA TTT GAA642Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu170 175 180CAA TAC GAA TTA AAG GCG GAC AAA AAT GGA TAC ATA TCC GGC AAA AAG690Gln Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys185 190 195 200GTA CGG GCG TTT AAA ATG AAT TCC CAG ACG GAA GGG ATG GCA GCA GAC738Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp205 210 215GAT GAA TAC GGC AGG CTT TAT ATC GCA GAA GAA GAT GAG GCC ATT TGG786Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr Ile Ala Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp220 225 230AAG TTC AGC GCC GAG CCG GAC GGC GGC AGT AAC GGA ACG GTT ATC GAC834Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp235 240 245CGT GCC GAC GGC AGG CAT TTA ACT CGT GAT ATT GAA GGA TTG ACG ATT882Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile250 255 260TAC TAC GCT GCT GAC GGG AAA GGC TAT CTG ATG GCA TCA AGC CAG GGA930Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly265 270 275 280AAC AGC AGC TAC GCC ATT TAT GAC AGA CAA GGA AAG AAC AAA TAT GTT978Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp Arg Gln Gly Lys Asn Lys Tyr Val285 290 295GCG GAT TTT CGC ATA ACA GAC GGT CCT GAA ACA GAC GGG ACA AGC GAT 1026Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp300 305 310ACA GAC GGA ATT GAC GTT CTG GGT TTC GGA CTG GGG CCT GAA TAT CCG 1074Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro315 320 325TTC GGT ATT TTT GTC GCA CAG GAC GGT GAA AAT ATA GAT CAC GGC CAA 1122Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln330 335 340AAG GCC AAT CAA AAT TTT AAA ATC GTG CCA TGG GAA AGA ATT GCT GAT 1170Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp345 350 355 360CAA ATC GGT TTC CGC CCG CTG GCA AAT GAA CAG GTT GAC CCG AGA AAA 1218Gln Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ala Asn Glu Gln Val Asp Pro Arg Lys365 370 375CTG ACC GAC AGA AGC GGA AAA TAAACATGCA AAAAGCAGCT TATACAAGCT 1269Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys380GCTTTTTGCA TGTGAAGAAC G 1290(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度383个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met1 5 10 15Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp20 25 30Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp35 40 45Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ile Trp Leu Asp Pro Lys50 55 60Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu65 70 75 80Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly85 90 95Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys100 105 110Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr115 120 125Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met130 135 140Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly145 150 155 160Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val165 170 175Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys180 185 190Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser195 200 205Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr Ile210 215 220Ala Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly225 230 235 240Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr245 250 255Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly260 265 270Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp275 280 285Arg Gln Gly Lys Asn Lys Tyr Val Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly290 295 300Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly305 310 315 320Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp325 330 335Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile340 345 350Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp Gln Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ala355 360 365Asn Glu Gln Val Asp Pro Arg Lys Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys370 375 380
权利要求
1．植酸酶或其功能衍生物，其特征为所述植酸酶具有至少20U/mg蛋白的比活，其中所述比活是通过在含有100mM Tris-HCl,pH7.5,1mM氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下，将所述植酸酶温浴30分钟而测定的。
2．根据权利要求1的植酸酶，其特征为所述植酸酶有一个大于等于6.5的最适pH值，其中所述最适pH值是在含有100mM Tris-马来酸，1mM氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下将所述植酸酶温浴30分钟而测定的，或者所述植酸酶有一个大于等于7.0的最适pH值，其中所述最适pH值是在含有100mM Tris-HCl,1mM氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中或者在含有小麦麸皮提取物，1mM的氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下，将所述植酸酶温浴30分钟而测定的。
3．根据权利要求1或2的植酸酶，其特征为所述植酸酶在动物小肠内有消化酶存在时能够行使功能。
4．根据权利要求1到3中的任一植酸酶，其特征为在食品或饲料的处理过程中，同饲养动物消化道中的植酸酶相比，所述植酸酶的比活大于等于30％。
5．根据权利要求1到4中的任一植酸酶，其特征为所述植酸酶是从微生物中得到的。
6．根据权利要求1到5中的任一植酸酶，其特征为所述微生物是芽孢杆菌的一株。
7．根据权利要求1到6中的任一植酸酶，其特征为所述芽孢杆菌的菌株选自包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的菌群。
8．根据权利要求1到7中的任一植酸酶，其特征为所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌BS13株，该菌株保藏在位于苏格兰的国家工业和海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏号为NCIMB-40819。
9．根据权利要求1到8中的任一植酸酶，其特征为所述植酸酶含有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能衍生物。
10．分离核酸或其功能衍生物，编码根据权利要求1到9中的任一植酸酶。
11．根据权利要求10的核酸，其特征为所述核酸含有一个根据SEQID NO:1的DNA序列或其功能衍生物。
12．根据权利要求10的核酸，其特征为所述核酸同根据SEQ IDNO:1的DNA序列或其功能衍生物杂交。
13．一个分离的编码植酸酶的核酸序列，其特征为所述核酸序列同根据SEQ ID NO:1的DNA杂交并编码植酸酶，该植酸酶具有大于或等于5.0的最适pH值以及至少10U/mg蛋白的比活，该比活是在含有100mM Tris-马来酸，1mM氯化钙，以及1.6mM的肌醇六磷酸钠的溶液中于37℃下温浴植酸酶30分钟而测定的。
14．根据权利要求10到13的任一核酸，其特征为所述核酸是DNA分子。
15．含有根据权利要求14的DNA分子的载体。
16．根据权利要求15的载体，其特征为所述DNA分子被有效地连接到能够使所述DNA序列表达植酸酶的调节序列上。
17．根据权利要求16的载体，其特征为所述DNA分子含有一个能够使所述植酸酶分泌的引导序列。
18．用根据权利要求10到17的任一核酸或载体所转化的原核宿主细胞。
19．根据权利要求18的原核宿主细胞，其特征为所述宿主细胞选自包括大肠杆菌，芽孢杆菌属，乳酸杆菌属以及乳酸球菌属的群体。
20．用根据权利要求10到17的任一核酸或载体所转化的真核宿主细胞或生物体。
21．根据权利要求20的真核宿主或生物体，其特征为所述宿主细胞选自包括曲霉属，腐质霉属，毕赤氏酵母属，木霉属，糖酵母属，以及象大豆，玉米和油菜籽一样的植物类群。
22．植酸酶重组产物的制备方法，其特征为在适宜的条件下培养根据权利要求18到21的任一宿主细胞或生物体并回收所述植酸酶。
23．根据权利要求1到9的任一植酸酶在食品或动物饲料中的用途。
24．含有根据权利要求1到9中任一植酸酶的食品或动物饲料。
25．根据权利要求24的食品或动物饲料，其特征为所述食品或动物饲料含有在所述动物消化道中具有活性的植酸酶作为添加剂。
26．根据权利要求24的食品或动物饲料，其特征为所述食品或动物饲料含有在食品或动物饲料处理过程中具有活性的植酸酶作为添加剂。
27．生产根据权利要求24到26的食品或动物饲料的方法，其特征为所述植酸酶是以液态形式喷洒到所述食品或动物饲料上。
28．生产根据权利要求24到26的食品或动物饲料的方法，其特征为所述植酸酶是以干燥产品的形式同所述食品或动物饲料相混合的。
29．根据权利要求24到26的动物饲料是用于选自由包括家禽的鸟类，包括牛、羊和猪的反刍动物以及包括鱼和虾的水生养殖动物所构成的类群。
30．根据权利要求1到9的任一植酸酶是用于生产肌醇，无机磷酸盐和磷酸化的中间产物。
31．降低动物粪尿中植酸酶水平的方法，其特征为用一定量能够有效转化所述动物饲料中植酸酶的根据权利要求24到26的动物饲料来饲养动物。
32．编码根据权利要求1到9中任一植酸酶的核酸的生产方法，其特征为含有根据权利要求10到13中任一核酸的引物同怀疑含有的所述核酸的试样杂交以及回收所述核酸。
33．用能够表达根据权利要求1到9中任一植酸酶的的原核细胞或孢子作为微生态制剂或直接饲养动物的微生物。
34．含有能够表达根据权利要求1到9的植酸酶的原核细胞或孢子的食品或动物饲料。
35．食品或动物饲料的生产方法，其特征为将能够表达根据权利要求1到9的植酸酶的原核细胞和/或孢子加到食品或动物饲料中。
全文摘要
本发明涉及一种具有的比活至少为20U/mg蛋白的植酸酶或其功能衍生物。本发明还涉及编码所述植酸酶的核酸和生产植酸酶的方法以及植酸酶在农业、食品和动物饲料处理过程中的应用。
文档编号C12Q1/68GK1228120SQ97197336
公开日1999年9月8日 申请日期1997年8月12日 优先权日1996年8月13日
发明者尤哈·阿帕雅拉蒂, 佩卡·海基宁, 雅纳·凯鲁武奥, 马尔科·劳拉尤斯, 安德鲁·摩根, 佩伊维·努尔米宁, 奥斯莫·西卡宁 申请人:芬恩饲料国际有限公司