专利名称：：在植物种子中生产类胡萝卜素化合物和特产油类的方法
技术领域：
：本发明涉及植物，植物细胞和种子的遗传修饰，特别是改变了类胡萝卜素生物合成和脂肪酸成分的遗传修饰。
背景技术：
：类胡萝卜素是具有各种各样应用的色素。它们是存在于绿色植物，某些霉菌，酵母和细菌中的黄色-桔黄色-红色脂类。类胡萝卜素烃是指胡萝卜素，而其氧化的衍生物是指叶黄素。类胡萝卜素是较大的类异戊二烯生物合成途径的部分，其中除了类胡萝卜素以外，产生类似于叶绿素和维生素E，维生素E活化剂这样的化合物。植物中的类胡萝卜素途径产生胡萝卜素，例如α-和β-胡萝卜素，和番茄红素和胡萝卜醇，例如叶黄素。类胡萝卜素的生物合成涉及C20前体香叶基PPi的两个分子的缩合以产生第一个C40烃八氢番茄红素。在一系列的依序的脱饱和反应中，八氢番茄红素产生番茄红素。番茄红素是环状的胡萝卜素，β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的前体。胡萝卜醇，玉米黄质和叶黄素是分别通过β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的羟化形成的。其颜色是在黄色到桔黄色范围的光谱的胡萝卜素，β-胡萝卜素大量地存在于胡萝卜的根部和植物的绿叶中。β-胡萝卜素可用作为颜料物质并且也可用作为哺乳动物的维生素A的前体。商业生产β-胡萝卜素的现行的方法包括从胡萝卜分离，化学合成和微生物生产。已知许多作物和单一的油类种子作物具有基本含量的类胡萝卜素，并且已经显示这样的天然来源的类胡萝卜素的消费对健康提供了各种有益的作用。下面的表提供了已经报道的不同植物品种中类胡萝卜素的含量。不同作物的类胡萝卜素的含量(微克/克)已经在各种各样的生物体中研究了类胡萝卜素的生物合成途径并且在从细菌到高等植物的范围内阐明了生物合成途径。参见，例如Britton,G.(1988)类胡萝卜素的生物合成，第133-182页，在T.w.Goodwin(ed.)，植物色素，1988,Academic出版社伦敦有限公司(伦敦)。也已经从各种各样的生物体包括噬夏孢欧文氏杆菌(Misawa等人(1990)细菌学杂志，172:6704-6712；草生欧文氏杆菌(申请WO91/13078,Armstrong等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA87:9975-9979)；荚膜红球菌(Armstrong等人，(1989)Mol.Gen.Genet.216:254-268,Romer等人(1993)生物化学生物物理研究通讯196:1414-1421)；嗜热栖热菌(Hoshino等人(1993)应用环境微生物学59:3150-3153)；蓝藻类细菌蓝细菌属的菌株(Genbank入藏号X63873)克隆了类胡萝卜素生物合成基因。也可参见WO96/13149和本文记载的参考文献。虽然基因已经被阐明了，但是关于这些基因在植物中的使用知道很少。调查已经显示对转基因植物中植物八氢番茄红素合成酶(Psyl)基因的过量表达或表达的抑制能够改变水果的类胡萝卜素含量。参见，Bird等人(1991)生物技术9:635-639；Bramley等人(1992)植物杂志2:343-349；和Fray和Grierson(1993)植物分子生物学，22:589-602。此外，如由Fray等人(1995)报道的，植物杂志8:693-701，水果八氢番茄红素合成酶基因在转基因番茄中的组成型表达通过使赤霉素途径的代谢改道导致植株矮小。申请WO96/13149报道了关于加强在储藏器官例如遗传工程获得的植物的块茎和根中类胡萝卜素的积累。该申请涉及在特定的预定的非光合作用的储藏器官中带颜色的天然类胡萝卜素的产生增加。该申请的实施例涉及在转化的胡萝卜根部和桔黄色的新鲜的马铃薯块茎中带色的类胡萝卜素的增加。这两种组织是营养性组织，不是种子，并且天然地具有高含量的类胡萝卜素。类胡萝卜素具有各种各样的用途。通常，类胡萝卜素可用作为添加剂例如维生素添加剂，用作为基于植物油的食品和食品成分，用作为动物饲料的饲料添加剂和用作为颜料。具体地说，发现八氢番茄红素可用于治疗皮肤失调。参见，例如美国专利4,642,318。番茄红素，α-和β-胡萝卜素可用作为食品着色剂。也已经证实消费β-胡萝卜素和番茄红素对一定种类的癌症具有预防作用。另外，摄取的叶黄素与阻止眼睛的视网膜退化有关。植物油具有各种各样的工业应用和可食用的用途。新的植物油成分和/或从生物合成或天然植物来源获得油成分的手段的改善是必须的。根据预定的油的应用，需要各种不同的脂肪酸成分。对具有特定的脂肪酸成分的修饰的油的需求很大，特别是对于油酸含量高的油。参见，Haumann,B.F.(1996)INFORM7:320-334。如由Haumann报道的，理想的烹饪用油是低饱和性，高油酸和低亚麻油酸。此外，几年来的研究已经确定了单不饱和脂肪酸作为食用组成成分的价值。几年来对于改善特定的油类的脂肪酸分布进行了尝试。例如，植物油的氧化稳定性是指其脂肪酸中的双键的数目。就是说，具有几个双键的分子被认为是更稳定的。因此，科学家们试图降低α-亚麻油酸的含量以便改善半寿期和氧化稳定性，特别是在加热状态下。对生产具有显著含量的类胡萝卜素化合物的作物和特别是植物种子的方法的需求是显而易见。另外改变植物和种子的脂肪酸含量是有益的。这样的经过改变的种子产品营养价值是有用的并且提供了产生更稳定的油类的来源。没有人报道基本上改变在植物种子中产生类胡萝卜素的含量和成分，特别是与提高类胡萝卜素的生产含量相关的方法。因此需要用于改变植物特别是种子中类胡萝卜素含量和用于生产具有修饰的类胡萝卜素成分和/或含量的油类的方法。发明概述提供了具有改变的类胡萝卜素含量和/或修饰的脂肪酸成分的转化的植物，植物细胞和种子。所述的植物，植物细胞和种子用至少一种类胡萝卜素生物合成基因转化。还提供了制备和使用本发明的转化的成分的方法。该方法可用于改变植物特别是种子中类胡萝卜素的含量以及提高用于分子农业的特定的化合物，例如用于生产特定的类胡萝卜素和维生素E。同时，转化的成分特别是种子提供了修饰的油类来源，该油类是从种子提取的以便提供包括各种类胡萝卜素和类胡萝卜素混合物的天然来源的油类产品。在本发明的特定的方面，转化的种子能够提供作为特定的类胡萝卜素产品和/或作为修饰的特产油类的来源，所述油类具有改变的类胡萝卜素或维生素E成分和/或改变的脂肪酸成分，特别是具有增高的油酸含量和降低的亚油酸和亚麻油酸含量。附图简述附图1显示SSU/crtB融合序列的核苷酸序列。附图2提供在植物种子中表达类胡萝卜素生物合成基因的构建体。附图2A显示含有可操作连接到SSU/crtB序列的napin启动子的质粒pCGN3390。附图2B显示含有可操作连接到SSU/crtE序列的napin启动子的质粒pCGN3392。附图2C含有可操作连接到SSU/crtI序列的napin启动子的质粒pCGN9010。附图2D显示含有可操作连接到SSU/crtB序列的napin启动子和含有可操作连接到SSU/crtI序列的napin启动子的质粒pCGN9009。附图2E显示含有可操作连接到SSU/crtB序列的napin启动子和可操作连接到反义ε-环化酶序列的质粒pCGN9002。附图2F显示含有可操作连接到SSU/crtB序列的napin启动子和可操作连接到反义β-环化酶序列的napin启动子的质粒pCGN9017。附图3显示对照种子的皂化样品的分析结果。附图4显示pCGN3390转化的种子的皂化样品的分析结果。附图5显示pCGN3390转化的种子的脂肪酸分析图并且证实了18∶1脂肪酸的增加与18∶2和18∶3的降低相关。附图6显示pCGN3390转化的种子的脂肪酸分析图并且证实了18∶1的增加与18∶0和20∶0的增加相关，但是对于16∶0几乎没有效果。附图7显示pCGN3390转化的种子的脂肪酸分析图并且证实了18∶1的增加与20∶0的增加充分相关。附图8显示类胡萝卜素生物合成途径。附图9提供了欧洲油菜ε-环化酶cDNA克隆9-4的序列。附图10提供了欧洲油菜ε-环化酶cDNA克隆7-6的序列。附图11提供了欧洲油菜β-环化酶cDNA克隆的序列。附图12提供了3390转化的欧洲油菜植物的T2种子分析。附图13提供了3390转化的欧洲油菜植物的T3种子分析。发明详述根据本发明，提供了用于增加植物，特别是植物种子的类胡萝卜素化合物的生产和用于改变脂肪酸成分的方法。该方法包括用至少一个类胡萝卜素生物合成基因转化植物细胞。这一步骤具有改变类胡萝卜素生物合成特别是提高下游产物的产生，以及提供新的具有所需的脂肪酸成分的种子油类的作用。然后可以将第二个基因用于调整代谢活性以生产特定的类胡萝卜素化合物或进一步改变脂肪酸的成分。令人惊奇的是已经发现用早期的类胡萝卜素生物合成基因转化植物导致借助于类胡萝卜素途径流出物显著提高，导致特定的类胡萝卜素增高。就是说，可以被进一步加工以产生特异性类胡萝卜素的代谢活性提高。另外，转化的种子可以证实由于类胡萝卜素基因表达的结果产生改变的脂肪酸成分，例如用本文描述的从用八氢番茄红素合成酶基因转化的植物的种子所看到的。因此，利用本发明的方法提供产生高含量的特定的类胡萝卜素和/或产生具有所需的脂肪酸成分的特产油类的种子。在油菜的油类种子中，例如用早期的类胡萝卜素生物合成基因转化导致产生其α-胡萝卜素，β-胡萝卜素和叶黄素的产生显著提高的种子。另外，油菜种子显示改变的脂肪酸成分并且产生植物油，所述植物油具有增高的油酸含量和降低的亚油酸和亚麻油酸含量。因此，转化的种子提供了类胡萝卜素产物以及修饰的种子油类的来源。以这种方式，能够产生修饰的特产油类并且提供了用于提取和纯化的类胡萝卜素的新的来源。与类胡萝卜素两个主要的植物来源，万寿菊花瓣和红棕榈油(中果皮)相比，本发明的油类的稳定性得到改善。虽然在储藏于室温下的空气中的种子中观察到不稳定性，如在储藏4星期后总的类胡萝卜素含量损失约20-30％,1-2星期之后仅损失10％所证实的。与之相反，棕榈的中果皮必须在收获后1或2天内加工以便避免类胡萝卜素的大损失。此外，在氮气条件下将种子储藏之后显著降低了本发明的种子的类胡萝卜素的分解。为了生产具有类胡萝卜素生物合成增高的种子，用早期类胡萝卜素生物合成基因转化的植物是足够的。由于打算使早期类胡萝卜素生物合成基因成为香叶基香叶基焦磷酸合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶和异戊烯基二磷酸(IPP)异构酶，对于早期类胡萝卜素生物合成基因可从各种各样的来源获得，大多数情况下，可以利用各种来源的基因。但是，认识到由于共抑制，靶宿主植物的天然的植物基因的使用可以是令人满意的，其中特定的酶的增高的表达是需要的。已经分离了许多早期类胡萝卜素生物合成基因并且可用于本发明的方法，参见例如已经从荚膜红球菌(Hahn等人，(1996)细菌学杂志178:619-624和本文记载的参考文献)，Genbank入藏号U48963和X82627,ClarkiaxantianaGenbank入藏号U48962、鼠耳芥，Genbank入藏号U48961、粟酒裂殖糖酵母，Genbank入藏号U21154，人Genbank入藏号X17025、乳克鲁维氏酵母，Genbank入藏号X14230分离了IPP异构酶。从噬夏孢欧文氏杆菌(Misawa等人(1990)细菌学杂志，172:6704-6712和申请WO91/13078)；和从植物来源，包括白扇羽豆(Aitken等人，(1995)植物生理学，108:837-838)、灯笼椒(Badillo等人，(1995)植物分子生物学27:425-428)和鼠耳芥(Scolnik和Bartely(1994)植物生理学，104:1469-1470；Zhu等人(1997)植物细胞生理学38:357-361)分离了香叶基香叶基焦磷酸合成酶。从许多来源包括噬夏孢欧文氏杆菌，荚膜红色杆菌和植物(Misawa等人(1990)细菌学杂志，172:6704-6712,GenBank入藏号D90087，和申请WO91/13078,Amstrong等人，(1989)Mo1.Gen.Genet.216:254-268,Amstrong,G.A.“类胡萝卜素生物合成的遗传分析和调节，R.C.Blankenship,M.T.Madigan，和C.E.Bauer(ed.)，不产氧的光合作用细菌；光合作用的进展。KluwerAcademicPublishers,Dordrecht，荷兰，Amstrong等人，(1990)Proc.Acad.Sci.USA87:9975-9979,Amstrong等人，(1993)酶学方法214:297-311,Scolnik和Bartely(1993)生物化学杂志268:27518-27521,Barmley等人，(1992)生物化学杂志267:5036-5039,Bartely等人，(1992)植物杂志2:291-343,Ray等人(1992)植物分子生物学，19:401-404,Ray等人(1987)核酸研究15:10578,Romer等人，(1994)生物化学和生物物理研究通讯196:1414-1421,Karvouni等人，(1995)植物分子生物学27:1153-1162,GenBank入藏号U32636,Z37543,L37405,X95596,D58420,U32636,Z37543,X78814,X82458,S71770,L27652,L23424,X68017,L25812,M87280,M38424,X69172,X63873,和X60441,Amstrong,G.A.(1994)细菌学杂志176:4795-4802和本文记载的参考文献”分离了八氢番茄红素合成酶，和从许多来源包括噬夏孢欧文氏杆菌Misawa等人(1990)细菌学杂志，172:6704-6712，和申请WO91/13078(GenBank入藏号:L37405,X95596,D48420,X82458,S71770和M87280)；和从植物来源，包括玉米(Li等人(1996)植物分子生物学30:269-279)，番茄(Pecker等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4962-4966和Aracri等人(1994)植物生理学106:789)，和菜椒(灯笼椒)(Hugueney等人，(1992)生物化学杂志209:399-407),GenBank入藏号U37258,X59948,X78271，和X68058)分离了八氢番茄红素脱饱和酶。通常参见Misawa等人(1990)细菌学杂志，172:6704-6712，欧洲专利0393690B1，美国专利号5,429.939,Bartely等人，(1992)生物化学杂志267:5036-5039,Bird等人(1991)生物技术9:635-639，和美国专利号5,304,478，所有这些出版物引入本文作为参考。用早期类胡萝卜素基因(也称之为一级基因)转化提高了类胡萝卜素途径的生物合成活性，并且导致特定的类胡萝卜素例如α-和β-胡萝卜素的产生增加。如在下面的实施例中更详细描述的，通过表达作为一级基因的八氢番茄红素合成酶，通常在转化的植物的种子中获得了类胡萝卜素含量大大增加，特别是α-和β-胡萝卜素含量大大增加。从种子提取包括如此产生的类胡萝卜素的油类以提供α-和β-胡萝卜素的有价值的来源。这样的油类可用作为食品的色素，例如给人造黄油增加色素，或用作为食物油。具有高α-和β-胡萝卜素含量的可食用的食物油对防止导致夜盲症的维生素A缺乏是有利的。因此，转化植物的产生和提供有用的食物油的高α-和β-胡萝卜素油的提取在夜盲症是普遍的问题的区域例如在印度和亚洲是特别令人满意的。除了高α-和β-胡萝卜素含量以外，本文例举的油类中其它类胡萝卜素的含量也增加。例如，在来自于用八氢番茄红素合成酶基因的植物的种子，以及来自于用GGPP合成酶基因转化的植物的种子中叶黄素含量增加。此外，可以表达其它的一级基因以通过类胡萝卜素途径提供更大的流出物。例如，在含有如上所述的八氢番茄红素合成酶基因的油菜种子的油类种子中，观察到八氢番茄红素的含量增加。因此，八氢番茄红素脱饱和酶和番茄红素合成酶的表达的增加导致所产生的类胡萝卜素例如α-和β-类胡萝卜素和叶黄素含量的进一步增加。此外，表达番茄红素合成酶和GGPP合成酶基因的植物是令人满意的，并且通过将含有本文描述的这些基因的3390和3392植物进行杂交可以产生。除了本文描述的类胡萝卜素的生产途径以外，一旦通过表达一级类胡萝卜素生物合成基因或几个基因已经增加了生物合成活性，该途径转向生产特定的化合物。这样的转向涉及至少一个第二个有用基因(二级基因)的作用。二级基因可以编码迫使特定的化合物产生的酶，或可选择的是可以编码终止该途径以积累特定的化合物的基因。为了迫使产生特定的化合物，使用了编码所需的类胡萝卜素化合物的类胡萝卜素生物合成基因在该途径中表达。靶宿主植物的天然或外来的基因在所述的方法有用，包括例如来自于高等植物以外的来源例如细菌，包括欧文氏杆菌和红色杆菌种类的类胡萝卜素生物合成基因。为了终止该途径以便积累特定的类胡萝卜素化合物，二级基因提供了抑制靶宿主植物的天然基因的转录的作用，其中由被抑制的基因编码的酶能够修饰所需的类胡萝卜素化合物。通过以该基因的有意义(共抑制)或反义方向转录被抑制的天然基因达到抑制。例如，为了使类胡萝卜素成分向高含量积累β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素例如玉米黄质，玉米黄质二葡萄糖苷，阿拉伯黄质和虾青素的积累的方向改变，需要将番茄红素ε-环化酶抑制以阻止α-胡萝卜素和其衍生物类胡萝卜素，例如叶黄素的积累。与番茄红素ε-环化酶抑制相结合，二级基因的表达增加对于特定的β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素的积累的增加也是令人满意的。例如，β-胡萝卜素羟化酶表达的增加可用于产生玉米黄质，而β-胡萝卜素羟化酶和导入酮的酶的表达的增加可用于产生虾青素。另一种可选的方法，为了积累番茄红素，番茄红素β环化酶或番茄红素ε-环化酶和番茄红素β环化酶的抑制对于降低番茄红素转变为α-和β-胡萝卜素是令人满意的。本申请需要的二级基因包括但不限于用于生产玉米黄质的β-胡萝卜素羟化酶或crtZ(Hundle等人，(1993)FEBSLett.315:329-334,Genbank入藏号M87280)；编码导入酮的酶的基因，例如ascrtW(Misawa等人(1995)细菌学杂志，177:6575-6584，和申请WO95/18220,WO96/06172)或β-C-4-加氧酶(crtO；Harker和Hirschberg(1997)FEBSLett.404:129-134)，用于生产阿拉伯黄质；用于生产虾青素的crtZ和crtW或crtO；用于生产叶黄素的ε-环化酶和ε-羟化酶；用于生产叶黄素和玉米黄质的ε-羟化酶和crtZ；用于增加β-胡萝卜素的产生的反义番茄红素ε-环化酶(Genbank入藏号U50738)；用于生产番茄红素的反义番茄红素ε-环化酶和番茄红素β-环化酶(Hugueney等人(1995)植物杂志8:417-424,CunninghamFXJr(1996)植物细胞8:1613-1626,Scolnik和Bartley(1995)植物生理学108:1343,Genbank入藏号X86452,L40176,X81787,U50739和X74599)；用于生产八氢番茄红素的反义植物八氢番茄红素脱饱和酶；等等。以这种方式，可以将该途径进行修饰以高产量地生产任何特定的需要的类胡萝卜素化合物。这样的化合物包括但不限于α-玉米黄质，β-玉米黄质，ε-胡萝卜素，六氢番茄红素，四氢番茄红素等等。利用本发明的方法，可以以高含量在所需要的种子中在类胡萝卜素途径中生产需要的任何化合物。通过反义DNA序列转化，可以将该途径操作以降低特定的类胡萝卜素的含量，所述反义序列阻止化合物前体转变为特定的待调节的类胡萝卜素。也可以选择二级基因以改变植物的脂肪酸含量以生产特产油类。例如，可以使用与特定的脂肪酸链长度具有特异性的酰基-ACP硫酯酶基因。参见例如USPN5,304,481；USPN5,455,167,WO95/13390,WO94/10288,WO92/20236,WO91/16421,WO97/12047和WO96/36719。其它所需的脂肪酸生物合成基因包括但不限于，β-酮酰基-ACP合成酶(USPN5,510,255)，脂肪酰CoA合成酶(USPN5,455,947)，脂肪酰还原酶(USPN5,370,996)和硬脂酰-ACP脱饱和酶(WO91/13972)。特别有兴趣的是使用倒捻子酰基-ACP硫酯酶作为二级基因以修饰脂肪酸含量。如在WO96/36719和WO97/12047中描述的，通过表达倒捻子酰基一ACP硫酯酶可以在种子中获得高含量的硬脂酸盐。为了将本文描述的高油酸特性的3390植物与描述于WO97/12047的5266高硬脂酸植物结合，将3390-1和5266-35之间和3390-1和5266-5之间进行了杂交。从这些杂交产生的种子含有具有高硬脂酸，低亚油酸，低亚麻油酸和高类胡萝卜素表现型的油类。本发明包括了用于生产包括一级基因或一级和二级基因的植物的方法。例如，可将所需的二级基因与一级基因(共转化)同时用于转化植物，将二级基因导入到已经用一级基因转化的植物，或者另一种可选的方法，将表达一级基因和表达二级基因的转化植物杂交以将两种基因一起带到相同的植物。通过将基因与组织特异性启动子结合，在植物的特定组织中可以改变类胡萝卜素的含量。因此，通过使用种子特异性转录起始区域可以改变在种子，包括胚和胚乳中的类胡萝卜素含量。这样的区域公开于例如美国专利5,420,034，该文献引入本文作为参考。以这种方式，转化的种子提供了生产修饰的油类的工厂。可以使用该修饰的油类，或者，可以分离油类中的化合物。因此，本发明允许生产特定的所需的化合物以及特产油类。可以使用表达盒中的编码所需酶的一级或二级基因以在转化的植物组织中表达。为了改变所需植物的类胡萝卜素或脂肪酸含量，用至少一个包括连接到所需基因的转录起始区域的表达盒转化植物。这样的表达盒提供了许多个限制性位点以便插入的基因处于调节区域的转录调节控制下。转录起始可以是天然的，或类似于宿主，或对宿主而言是外源的或异源的。“外源”是指在将要导入转录起始区域的野生型宿主中不存在转录起始区域。与储藏蛋白质例如napin,cruciferin,β-conglycinin，菜豆蛋白等等和涉及脂肪酸生物合成的蛋白质例如酰基载体蛋白质(ACP)相关的那些转录起始区域是特别需要的。参见，美国专利5,420,034，引入本文作为参考。从5’-3’转录方向，该转录盒将包括转录和转译起始区域，需要的DNA序列，和在植物中有作用的转录和作用终止区域。终止区域可以是天生具有转录起始区域的，可以天生具有所需的DNA序列，或可以来源于另一个来源。便利的终止区域是从根癌土壤杆菌的Ti质粒获得的，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区域。参见，例如Guerineau等人，(1991),Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot,(1991)，细胞，64:671-674；Sanfacon等人，(1991)，基因发展，5:141-149；Mogen等人，(1990)，植物细胞，2:1261-1272；Munroe等人，(1990)，基因，91:151-158；Ballas等人，(1989)，核酸研究，17:7891-7903；Joshi等人，(1987)，核酸研究，15:8627-9639。在大多数情况下，将本发明的所需基因用于靶击质体，例如叶绿体以便表达。以这种方式，当没有将所需的基因直接插入到质体时，表达盒还含有编码转运肽的基因以指导所需基因到质体。这样的转运肽是本领域内技术人员已知的。参见，例如VonHeijne等人，(1991)植物分子生物学报道，9:104-126；Clark等人，(1989)生物化学杂志，264:17544-17550；della-Cioppa等人，(1987)植物生理学84:965-968；Romer等人(1993)生物化学和生物物理学研究通讯196:1414-1421；和Shah等人，(1986)科学233:478-481，用于本发明的植物类胡萝卜素基因可以使用天然的或异源的转运肽。注意到，当所需的基因或DNA序列是反义DNA，靶击质体是不需要的。构建体也可以包括任何其它必要的调节子例如植物转译共有序列(Joshi,C.P.,(1987)，核酸研究，15:6643-6653)，可操作连接到所需的核苷酸序列的内含子(Luehrsen和Walbot,(1991),Mol.Gen.Genet.,255:81-93)等等。在表达盒构建体中包括5’引导序列是有利的。这样的引导序列具有加强转译的作用。转译引导序列是本领域内技术人员已知的，并且包括细小核糖核酸病毒引导序列，例如，EMCV引导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区域)(Elory-Stein,O.Fuerst,T.R.和Moss,B.(1989)PNASUSA86:6126-6130)；poty病毒引导序列，例如TEV引导序列(烟草Etch病毒)(Allison等人，(1986)；MDMV引导序列(玉米矮状花叶病毒)；病毒学，154:9-20)，人免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP),(Macejak,D.G.，和Samow,P.,(1991)，自然，353:90-94；来自于苜蓿花叶病毒的mRNA的包被蛋白质的未转译的引导序列(AMVRNA4),(Jobling,S.A.和Gehrke,L.(1987)，自然，325:622-625)；烟草花叶病毒引导序列(TMV)，(Gallie,D.R.等人(1989),RNA分子生物学)，第237-256；和玉米黄萎病斑驳病病毒引导序列(MCMV)(Lommel,S.A.等人，(1991)，病毒学，81:382-385。也参见，Della-Cippoa等人，(1987)，植物生理学，84:965-968)。根据当所需的DNA序列将要表达时，合成具有植物优选密码子的序列或者具有叶绿体优选的密码子的序列是令人满意的。植物优选密码子可以由以最大量在所需的特定的植物种类中表达的蛋白质最高频率的密码子决定。参见，EPA0359472；EPA0385962；WO91/16432；Perlak等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328；和Murray等人，(1989)核酸研究17:477-498。以这种方式，将核苷酸序列改变为最适合在任何植物中表达。将所有或任何部分的基因序列最佳化或合成是已知的。就是说，合成的或部分最佳化的序列也可以使用，为了构建叶绿体优选的基因，参见USPN5,545,817。在制备转录表达盒时，对各个DNA片段进行操作以便提供正确方向和如果合适的话，正确的阅读框架的DNA序列。向着末端的方向，可以使用连接物或接头以连接DNA片段或可以使用其它操作以提供便利的限制性位点，去除超流动性的DNA，去除限制性位点等等。为了该目的，也可以使用体外诱变，引物修复，限制性，退火，切除，连接等等，其中可以涉及插入，缺失或替代，例如转运和易位。可以以许多的本领域内已知的方式将本发明的重组DNA分子导入到植物细胞。本领域内技术人员将认识到方法的选择取决于植物类型，即单子叶或双子叶，转化的靶。转化植物细胞的合适的方法包括微注射(Crossway等人，(1986)生物技术4:320-334)，电击穿(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606，土壤杆菌介导的转化(Hinchee等人，(1988)生物技术6:915-921)和弹粒加速(参见，例如Sanford等人，美国专利4,945,050；和McCabe等人，(1988)生物技术6:923-926)，也参见Weissinger等人，(1988)遗传学综述年度报告22:421-477；Sanford等人，(1987)颗粒科学和技术5:27-37(onion)；Christou等人，(1988)植物生理学，87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)生物技术6:923-926(大豆)；Datta等人，(1990)生物技术8:736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)生物技术6:559-563(玉米)；Klein等人，(1988)植物生理学91:440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)生物技术8:833-839；和Gordon-Kamm等人，(1990)植物细胞2:603-618(玉米)。另一种可选的方法，可以直接转化植物质体。在高等植物中已经报道了叶绿体的稳定转化，参见，例如SVAB等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；SVAB&Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Staub&Maliga(1993)EMBOJ.12:601-606。该方法依赖于含有选择性标记物的DNA的粒子枪的传递以及通过同源重组将该DNA靶击到质体基因组。在所述方法中，通过使用质体基因启动子或通过反式激活静止质体产生的定位是便于从例如由T7RNA聚合酶识别的选择性启动子序列表达的转基因可以完成质体基因表达。通过从核表达构建体表达特定的RNA聚合酶并且利用转运肽将聚合酶靶击到质体可以激活静止质体基因。通过使用从合适的植物组织特异性启动子表达的核编码的和特异于质体的特异性RNA聚合酶可以以这样的方法获得组织特异性表达。这样的系统已经在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305报导。根据常规方式可以将已经转化的细胞生长为植株。参见，例如，McCormick等人，植物细胞报告(1986),5:81-84。然后将这些植物生长，或者用相同的转化的株系或不同的株系授粉，并且鉴别具有所需的表现型特性的获得的杂种。生长2或多代以确保稳定地保持个体的表现型特性并且遗传，然后收获种子以确保已经获得的所需的表现型或其它特性。作为宿主细胞，可以使用任何植物品种。提供所需种子的植物品种是特别需要的。对于大多数情况，选择产生高产量的种子的植物，包含的所需的种子特异性产物，或种子或种子部分是可食用的。所需的种子包括油类种子，例如油类种子油菜种子，棉花种子，大豆，红花，太阳花，椰子，棕榈等等；谷物种子，例如，小麦，大麦，燕麦，苋，亚麻，荞麦，triticale，水稻，玉米等等；其它可食用种子或具有可食用部分的种子包括西葫芦，南瓜，芝麻，罂粟，葡萄，绿豆，花生，豌豆，菜豆，小萝卜，苜蓿，可可，咖啡，树结的坚果例如胡桃，杏仁，山核桃，鹰嘴豆等等。在本发明的一个实施方案中，种子转录起始区域与至少一个类胡萝卜素生物合成基因结合使用。这增加了类胡萝卜素途径的活性，并且改变了转化的种子中的类胡萝卜素含量。以这种方式，可以选定特定的基因以促进所需化合物的形成。当选择的基因是早期类胡萝卜素生物合成基因时，由于通过该途径的流出物增加，转化的种子的类胡萝卜素生物合成显著增加。对于，用早期类胡萝卜素生物合成基因转化的油菜种子，获得了α-胡萝卜素，β-胡萝卜素的产生显著增加并且在种子油类中叶黄素以及改变的油类脂肪酸成分增加较小。当早期类胡萝卜素生物合成基因是八氢番茄红素合成酶时，特定的类胡萝卜素的显著增加包括10-50倍的范围内的增加，优选的是至少50-100倍的增加，更优选的是，至少50-200倍的增加，例如在α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量的增加所看到的。在这种情况下，叶黄素含量也增加了，但是获得了1.5-2倍的较低的增加。同时，总类胡萝卜素含量可以增加至少10-25倍，优选的是25-60倍，更优选的是增加25-100倍。因此，用八氢番茄红素合成酶基因转化的本发明的种子其α-和β-胡萝卜素和总类胡萝卜素有本质上的增加，以及叶黄素和其它类胡萝卜素有较小的增加。在某些情况下，对于给定的类胡萝卜素化合物，对增加的倍数进行定量测定是不可能的，因为其含量太低以致于不能在非转化植物的种子中检测。对于例如欧洲油菜的情况，在用crtB基因转化的种子中检测到各种含量的α-玉米黄质，番茄红素，八氢番茄红素和六氢番茄红素，但是在未转化的欧洲油菜植物的种子中没有检测到。当早期类胡萝卜素生物合成基因是GGPP合成酶时，叶黄素和β-胡萝卜素可以获得1.5-2倍的增加。在用crtE(GGPP合成酶)基因转化的欧洲油菜植物种子中也可以检测到番茄红素。在这种情况下总的类胡萝卜素也增加约2倍。因此，已经进行遗传工程加工以表达增加含量的八氢番茄红素和GGPP合成酶的植物是类胡萝卜素的有用的来源。通过用第二基因转化，用早期类胡萝卜素基因转化实现的代谢能量可以汇集到选定的代谢化合物。如上讨论的，通过启动所需的类胡萝卜素的形成或另一种可选的方法通过将该途径终止以允许建立化合物，将第二基因设计为启动特定的类胡萝卜素的合成。因此，在本发明的转化的种子中可以产生所需的显著量的类胡萝卜素。已经用一级早期类胡萝卜素生物合成基因转化的本发明的种子也提供了新的油类成分的来源。八氢番茄红素合成酶用作为一级基因，例如导致种子油类中油酸含量本质上增加。而本质上增加是指从约5％到约40％，具体是从约20％到约40％，更具体地说从约30％到约40％的增加。因此，已经用一级早期类胡萝卜素生物合成基因转化的本发明的种子提供了具有高油酸含量的修饰的油类的来源。就是说，可以将类胡萝卜素生物合成基因，特别是早期类胡萝卜素生物合成基因用于生产重量百分数具有至少70％油酸的种子。通过本发明可以改变任何种子中油酸含量，即使这些种子天然具有高油酸含量。通过本发明对天然具有高油酸含量的种子的改变可以导致总油酸含量高至80％。重要的是，亚油酸和亚麻油酸含量也降低。而亚油酸脂肪酸含量的降低从约10％到25％，优选从约25％到约40％，更优选的是从约35％到约60％。而亚麻油酸含量的降低是指从约10％到约30％，优选的是约30％到约60％，更优选的是约50％到约75％。因此，本发明的方法导致产生比天然存在的油类更具有氧化稳定性的油类。本发明的修饰的油类是低饱和的，高油酸和低亚麻油酸的。此外，本发明提供了单不饱和脂肪酸含量高的油类，它作为可食用成分是重要的。基于本文公开的方法，可以将种子油类进行修饰以将油类加工为高油酸含量和高含量的所需的类胡萝卜素。高油酸和高α-和β-胡萝卜素油类具有较长的半寿期，因为油酸和α-和β-胡萝卜素含量提供稳定性。也注意到这样的油类作为类胡萝卜素的来源比天然的红棕榈油是更令人满意的，该油类含有高含量的饱和的脂肪酸。因此本发明的转化的种子提供了类胡萝卜素产物以及修饰的脂肪酸的来源。当计划生产所需的特定的类胡萝卜素化合物时，可以利用本领域内技术人员已知的方法用于纯化类胡萝卜素化合物。以相同的方式，可以利用本领域内技术人员可获得的方法生产从油类纯化的类胡萝卜素。通常参见，WO96/13149和Favati等人，(1988)食品科学杂志53:1532和这些文献引入本文作为参考。除了种子中类胡萝卜素含量改变以外，可以改变维生素E的含量，优选的是增加。具有维生素E，特别是α-维生素E含量增加这样的种子是令人满意的，因为α-维生素E是维生素E家属的最重要的形式。维生素E对人类和其它动物的营养是必要的。根据在体内具有保持红血细胞的完整性的功能，如在细胞的呼吸中是必要的维生素E，参与了DNA的生物合成，并且作为具有保护细胞免受致癌物作用的抗氧化剂可以获得证据。因此，具有增加的维生素E含量的种子和油类是令人满意的。本发明提供了α-维生素E含量具有将近50％的增加的油类，使用本发明的方法可以使种子油类具有更高的增加，直到2-5倍。另外发现转化的种子和胚胎可用作为可筛选的标记物。就是说，由于类胡萝卜素含量增高的结果，基于颜色通过目测可以决定和选择转化的种子和胚胎。转化的种子或胚胎由于类胡萝卜素含量增高显示从黄色到桔黄色到红色范围内的颜色。因此，当植物转化方法涉及胚胎发生阶段，例如在对于棉花或大豆的转化，可以将类胡萝卜素基因作为标记基因用于转化试验以允许目测选择转化体。另外，如下面的实施例中进一步描述的，易于鉴定分离的种子。为了描述而不是为了限制提供下面的实施例。试验实施例Ⅰ表达构建体和植物转化A．噬夏孢欧文氏杆菌类胡萝卜素生物合成基因与SSU的融合体(1)八氢番茄红素合成酶通过PCR将SSU引导序列和crtB基因序列连接。SSU/crtB融合体的序列显示于附图1。如下所述将从核苷酸5057到5363(根据Misawa等人(1990)(见上文)的编号)的crtB基因与SSU引导序列连接。在SSU引导序列起始位点的上游包含BglⅡ位点以便有助于克隆。在crtB的5057位的核苷酸胸腺嘧啶被改变为腺嘌呤以在SSU引导序列/crtB接点处制备第一个氨基酸甲硫氨酸，和拼接位点cys-met-asn。SSU的天然拼接位点是cys-met-gln。注意Misawa等人(1990)(见上文)指出crtB的编码序列的起始位点是在核苷酸5096。因此，在crtB的编码序列的公开的位点的上游和在crtB/SSU融合体的SSU拼接位点之后有13个氨基酸。从欧文氏杆菌crtB上游序列转译的这些氨基酸中的12个和增加了一个是甲硫氨酸。然后将从5363(EcoRⅤ)到6009(EcoRⅠ)的crtB结合到SSU-crtB融合体以获得完整的SSU-crtB融合体构建体，将该构建体命名为pCGN3373(附图1)。(2)八氢番茄红素脱饱和酶Misawa等人(植物杂志(1993)4:833-840)描述了包含融合到Rubisco豆的小亚单位的转运肽序列的噬夏孢欧文氏杆菌crtI基因的质粒。将含有SSU-crtI融合体和nos3’终止区域的该质粒的约2.1kb的XbaⅠ/EcoRⅠ片段克隆到从napin5’启动子表达的位置。(3)GGPP合成酶获得了含有融合到噬夏孢欧文氏杆菌crtE基因的SSU转运肽的类似的构建体。pCGN3360的约1.2片段的BglⅡ/BamHⅠ片段上存在SSU-crtE融合体。B．用于植物转化的表达构建体(1)八氢番茄红素合成酶用BglⅡ和BamHⅠ切割携带整个SSU/crtB融合体的pCGN3373以切除SSU/crtB融合体。将获得的片段连接到pCGN3223的napin表达盒的BamHⅠ位点(参见WO94/10288描述了napin表达盒)。用HindⅢ消化获得的构建体pCGN3389以切除napin5’-SSU/crtB-napin3’片段，然后将它克隆到HindⅢ裂解的pCGN1559PASS，产生pCGN3390。pCGN1559PASS是用于土壤杆菌介导的转化的两性载体例如由McBride等人描述的(植物分子生物学(1990)14:269-276)和通过用含有下面的限制性消化位点Asp718/AscⅠ/PacⅠ/XbaⅠ/BamHⅠ/SwaⅠ/Sse8387(PstI)/HindⅢ的接头区域替代pCGN1559接头区域从pCGN1559制备。在附图2A提供了pCGN3390的图谱。(2)八氢番茄红素脱饱和酶将如上所述的包括napin5’/SSU-crtⅠ融合体/nos3’构建体的片段克隆到用于植物转化的两性载体，导致产生pCGN9010。在附图2C提供了pCGN9010的图谱。(3)GGPP合成酶用BglⅡ和BamHⅠ切割携带整个SSU/crtE融合体的pCGN3360以切除SSU/crtE融合体。将获得的1.2kb的片段连接到pCGN3223的napin表达盒的BamHⅠ位点。用HindⅢ消化获得的构建体pCGN3391以切除napin启动子-SSU/crtE/napin3’片段，然后将它克隆到HindⅢ裂解的pCGN1559PASS，产生pCGN3392。在附图2B提供了pCGN3392的图谱。(4)八氢番茄红素合成酶十八氢番茄红素脱饱和酶将来自于pCGN3389的napin5’-SSU/crtB-napin3’片段和存在于pCGN9010的napin5’/SSU-crtⅠ融合体/nos3’片段插入到两性载体，导致产生pCGN9009，显示于附图2D。(5)反义ε-环化酶+八氢番茄红素合成酶通过PCR，利用从鼠耳芥ε-环化酶基因设计的引物分离欧洲油菜ε-环化酶基因(CunnunghamFXJr(1996)植物细胞8:1613-1626)。在附图9(克隆9-4)和10(克隆7-6)提供了欧洲油菜ε-环化酶基因的序列。通过cDNA克隆9-4的XhoⅠ/BamHⅠ片段克隆到用XhoⅠ和BglⅠ消化的napin表达盒(pCGN3233)制备反义构建体。将napin5’-反义ε-环化酶-napin3’片段与napin5’-SSU/crtB-napin3’片段一起克隆到两性载体用于植物转化，获得的pCGN9002显示了附图2E。(6)反义β-环化酶十八氢番茄红素合成酶通过PCR，利用从鼠耳芥β-环化酶基因设计的引物分离欧洲油菜β-环化酶基因(CunnunghamFXJr(1996)植物细胞8:1613-1626)。在附图11提供了欧洲油菜β-环化酶cDNA32-3的序列。通过将β-环化酶cDNA克隆克隆到用XhoⅠ消化的napin表达盒(pCGN3223)制备反义构建体。选择以反义方向含有β-环化酶的克隆。将napin5’-反义β-环化酶-napin3’片段与napin5’-SSU/crtB-napin3’片段一起克隆到两性载体用于植物转化，获得的pCGN9017显示了附图2F。C．植物转化如Radke等人，(应用遗传学理论(1988)75:685-694和植物细胞报告(1992)11:499-505)的描述获得了含有如上所述构建体的转化的欧洲油菜。实施例2转基因植物的分析A．目测观察和分离比例在开花期后21天，28天和35天对212/86的napin-SSU引导序列/crtB植物进行标记。当在28天收获第一个植株3390-1时，一些种子明显呈桔黄色。AT35dpa，桔黄色是明显的，足以获得分离比例。桔黄色种子的这种趋势已经继续被看到，并且在已经获得的收获的17个品系的各种中看到。下面的表1显示分离比例一览表。表1B．发育的种子的类胡萝卜素分析如下所述开花期后约35天从收获的种子提取类胡萝卜素。在200微升的70％丙酮/30％甲醇中研磨转基因植株3390-1的桔黄色种子的8个种子样品和212/86品种油菜对照植株的8个种子样品。然后将研磨的种子混合物在离心机旋转约5分钟并且去除上清液。用沉淀的种子材料进行另外两次的70％丙酮/30％甲醇提取并且收集所有上清液合并并且标记为A/M提取物。在提取过程的此时，对照种子沉淀是白色的，而转基因种子的种子沉淀具有桔黄色。然后将沉淀用醚提取两次并且合并获得的上清液和标记为E提取物。然后如下所述将A/M提取物转移到醚。向提取物加入450微升醚和600微升的水，随后去除醚层。然后用400微升的醚将A/M提取物洗涤两次以上，合并来自于三个A/M洗液的醚组分。用400微升的水将如上所述的E提取物洗涤并且与A/M醚组分合并。用氮气将合并的醚组分吸胀到体积为约300微升并且用注射用微过滤器过滤。用约100微升醚浸洗样品小管并且类似地将浸洗液过滤并且与起始滤液合并。此时总体积为约150微升。将50微升的样液储藏于-20℃直到用于进一步分析，如下所述将获得的100微升样品皂化。将溶于甲醇的100微升的10％的氢氧化钾(KOH)加入到各个100微升的样品并且将该混合物在黑暗的室温下储藏约2小时。然后将400微升的水加入到该样品，去除醚相。为了进行更好的醚分离，用饱和的氯化钠替代水。然后用100微升的醚提取该水溶液2次以上，合并醚样品并且用水洗涤。然后在RaininmicrosorbC18柱(25厘米长度，4.6毫米外部直径)上，以每分钟1.5毫升的流速，通过HPLC分析方法对皂化的样品进行分析。用于洗脱的梯度如下A=乙腈B=己烷/二氯甲烷(1∶1)C=甲醇起始溶液是70∶20∶10(A∶B∶C)。在2.5分钟时该溶液在5分钟内蔓延为65∶25∶10(A∶B∶C)并且在12.5分钟内保持该状况。然后在2分钟内该溶液蔓延为70∶20∶10(A∶B∶C)，随后在注射下一次样品之前延迟3分钟。在450和280纳米处连续监测洗脱样品的吸收值并且使用已知的化学和生物学标准以鉴别各种吸收峰。在附图3和4，分别提供对照和pCGN3390转化种子的皂化的样品的分析结果。观察到转基因植株种子的α-和β-胡萝卜素和八氢番茄红素的含量明显增加，以及羟基化的类胡萝卜素，叶黄素的含量增加较小。C．crtB转基因植株的成熟的种子的类胡萝卜素和维生素E分析将成熟的3390T2种子送到分析实验室利用本领域内已知的标准的HPLC方法进行定量分析。这些分析的结果显示于下面的表2。化合物含量以微克/克表示。基于种子的颜色选择命名为“酱紫色(Maroon)”的种子。与该品种的野生型植株的种子的棕黑色外形相反，具有桔黄色胚的种子在成熟时显示紫酱色。根据颜色不能选择的种子命名为“Random”。因为对于Kan,3390-1分离为3∶1,“Random”群体包括无效比例。紫酱色群体仅含有转基因。由于从该群体排除无效的尝试，包含纯合体是有利的。表2*nd=未检测在非转基因的样品中，“其它”包括大多数非常极性的化合物，例如新黄质，紫黄质等等。在转基因的样品中，“其它”包括这些和另外的化合物，例如δ-胡萝卜素，链孢红素和单环化的类胡萝卜素。附图12列出了来自于欧洲油菜品种Quantum(SP30021)的转化植株的3390T2种子的类胡萝卜素分析的结果。附图13列出了来自于欧洲油菜品种212/86(SP001)的转化植株的3390T3种子的类胡萝卜素分析的结果。上述结果显示由于crtB基因表达的结果成熟种子中α-和β-胡萝卜素的含量显著增加。通常，类胡萝卜素总体的增加是非常高的，对于着色的类胡萝卜素如果包括八氢番茄红素和六氢番茄红素，近乎50倍，和高达60倍。显然通过类异戊二烯途径的流出物已经急剧增加。另外，注意到α-维生素E(维生素E)含量也增加近乎50％。D．繁殖研究将10个3390-1的成熟的种子和10个212/86对照的种子种植于土壤，在大的人能穿过的生长室内生长。转基因的种植比对照晚1-2天出现，但是，所有10个种子发芽。当它们开始出现时，转基因植株是淡粉色，但是1-2天以后变为绿色。在第一片真叶出现时，没有观察到颜色的不同。从转基因和对照种子生长的植株正常发育。E．脂肪酸分析通过从转基因植株3390-1和3390-8收获的单个T2种子的GC分析测定成熟种子的脂肪酸成分。对从Random(R)和Maroon(M)(如上定义)群体获得的单个种子进行分析并且与从212/86对照(SP001-1)获得的种子比较。下面的表3提供了这些分析的结果，以％重量表示总的脂肪酸量。表33390-1和3390-8品系的脂肪酸成分</tables>上述资料显示来自于各个转基因品系的种子的油酸(18∶1)有本质上的增加。油酸的增加是亚油酸和亚麻油酸消耗的结果，在转基因品系中这两者的量降低。也观察到18∶0和20∶0脂肪酸增加。基于这些资料，可以鉴别在Random群体中存在的无效种子并且在表3中用星号(*)标记。来自于各个转基因品系的所有Maroon群体的种子有观察到的改变的脂肪酸成分，证实改变的脂肪酸成分是crtB基因表达的结果。附图5-7提供了在转基因种子中的脂肪酸成分资料的趋势，这种趋势指明了脂肪酸成分的变化与观察到的18∶1含量的增加的正负关系。18∶1的增加与18∶2和18∶3的降低相关(附图5)。18∶1增加也与18∶0和20∶0的增加相关，但是对16∶0的作用几乎没有看到(附图6)。18∶0的增加也与20∶0的增加相关(附图7)。F．来自于crtE转基因植株的成熟种子的类胡萝卜素分析在被转化的成熟的3392欧洲油菜植株的T2种子中分析类胡萝卜素以表达噬夏孢欧文氏杆菌crtE基因。在植株3392-SP30021-16的种子中观察到叶黄素和β-胡萝卜素的含量增加约2倍。在这些种子中也检测到番茄红素和在未转化的对照植株的种子中没有检测到。对来自于另外的3392转化体的种子进行分析没有显示类胡萝卜素含量有显著的增加。实施例3crtB植株的杂交A．转基因油类的特性为了评估napin-crtB转基因植株的高油酸特性以及所表达的其它油类特性，制备3390-1-6-8与山竹果硫酯酶(5266)和肉豆蔻硫酯酶(3854；参见WO96/23892)的杂交。将两个低亚油酸(LPOO4和LP30108)品种制备杂交。对分离的种子进行类胡萝卜素和脂肪酸成分的半种子分析，下面的表4和5显示了平均半种子值。表4从3390杂交获得的半种子的类胡萝卜素含量杂交叶黄素番茄红素α-胡萝卜素β-胡萝素总数F13390-SP001-1-6-8×SP3002121.626.2271.5413.1732F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-5-2618.021.7187.9284.1511F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-216.222.1223.0318.4579F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-1219.522.9196.8312.8552F13390-SP001-1-6-8×LP30108-1923.722.7213.4355.0614F1LP30108-19×F13390-SP001-1-6-816.419.6156.7224.5417表5从3390杂交获得的半种子的脂肪酸成分菌株_1D％14∶0％16∶0％18∶0％18∶1％18∶2％18∶3％20∶0(3390-SP001-1-6-8X0.053.551.7074.7811.295.710.73SP30021)(3390-SP001-1-6-8X0.063.8411.3762.8611.065.083.385266-SP30021-35-12)(3390-SP001-1-6-8X0.063.6811.2764.809.815.163.045266-SP30021-35-2)3390-SPOO1-1-6-8X0.063.6615.3660.789.304.773.875266-SP30021-5-26(3390-SP001-1-6-1X2.699.803.6564.629.724.571.513854-SP30021-20-3)(3390-SP001-1-6-1X6.1416.355.1254.918.234.232.033854-SP30021-20-1)(3390-SP001-1-6-1X0.073.8211.6764.5211.463.143.085266-LP004-2-31)(3390-SP001-1-6-8X0.053.801.4473.6614.023.930.67LP30108-19)(LP30108-19X0.043.311.7979.699.262.970.753390-SP001-1-6-8)SPOO1-4-100.074.440.9956.0621.7914.310.443390-SPOO1-1-6-80.043.461.4477.269.305.710.63如上面所述的结果，通过转化的植物中早期类胡萝卜素生物合成基因在优选地在植物种子组织中表达的启动子的调节控制下进行表达可以获得α-和β-胡萝卜素急剧增加(100到200倍)和总类胡萝卜素增加60倍。在流出物中这样的增加启动如上所述的特产产物的产生途径，也导致产生α-维生素E(维生素E)的产生增加。此外，在转基因植物的种子中也可以改变脂肪酸成分是显然的。以这种方式，可以将种子用于产生新的产品以便生产特定的类胡萝卜素，以提供高油酸等等。本说明书中提到的所有出版物和专利申请代表了本发明涉及的领域内技术人员的含量。所有出版物和专利申请以相同的程度引入本文作为参考，就象各个单个的出版物或专利申请特异地和单个地引入本文作为参考一样。虽然，借助于说明和为了清楚理解的目的的实施例详细地描述了本发明，但是在本申请所附加的权利要求书的范围可对其进行一些改变和修饰是显而易见的。权利要求1．用于改变宿主植物的种子的类胡萝卜素含量的方法，所述方法包括用一个构建体转化所述宿主植物，所述构建体包括作为可操作连接成分的来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域、质体转运肽、至少一个类胡萝卜素生物合成基因的DNA编码序列和转录终止区域。2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的类胡萝卜素含量被提高了。3．根据权利要求1所述的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因编码选自于下列组的酶香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶，β-胡萝卜素羟化酶，ε-羟化酶，番茄红素ε-环化酶，番茄红素β-环化酶和由crtW编码的虾青素生物合成酶。4．根据权利要求1所述的方法，其中所述的DNA编码序列通过反义或共抑制降低了所述宿主植物的天然的类胡萝卜素生物合成基因的表达。5．根据权利要求4所述的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因选自于下列组番茄红素ε-环化酶，番茄红素β-环化酶，ε-羟化酶，β-羟化酶，和八氢番茄红素脱饱和酶。6．根据权利要求2所述的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因不是所述宿主植物的天然基因。7．根据权利要求2所述的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因来自于原核生物。8．根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主植物是油类种子油菜植物。9．根据权利要求1所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于优选地在油菜种子组织中表达的基因。10．根据权利要求9所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于napin基因。11．提高宿主植物种子的类胡萝卜素生物合成的流出物含量的方法，所述方法包括用构建体转化所述宿主植物，所述构建体包括作为可操作连接成分的来自于优选在植物种子中表达的基因的转录起始区域、质体转运肽、一级基因的DNA编码序列、转录终止区域，其中所述的一级基因是早期类胡萝卜素生物合成基因。12．根据权利要求11所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码选自于下列组的酶香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶和异戊烯基二磷酸异构酶。13．根据权利要求12所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合成酶。14．根据权利要求11所述的方法，其中所述的基因来自于原核生物。15．根据权利要求13所述的方法，其中所述的基因是crtB。16．根据权利要求11所述的方法，其中所述宿主植物用第二早期类胡萝卜素生物合成基因转化。17．根据权利要求16所述的方法，其中所述的一级基因编码八氢番茄红素合成酶，并且所述第二早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素脱饱和酶。18．根据权利要求17所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于优选地在油菜种子组织中表达的基因。19．根据权利要求17所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于napin基因。20．提高宿主植物的种子的α-和β-胡萝卜素含量的方法，所述的方法包括用表达盒转化所述的宿主植物，所述表达盒包括作为可操作连接成分的来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域、质体转运肽、一级基因的DNA编码序列和转录终止区域，其中所述的一级基因是早期类胡萝卜素生物合成基因，所述基因选自于下列组香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶。21．根据权利要求20所述的方法，其中所述种子的叶黄素含量提高了。22．根据权利要求20或21所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合成酶。23．根据权利要求20或21所述的方法，其中所述的基因来自于非高等植物来源。24．根据权利要求22所述的方法，其中所述的基因是crtB。25．根据权利要求20所述的方法，其中所述的宿主植物是油类种子油菜植物。26．根据权利要求20所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于优选地在油菜种子组织中表达的基因。27．根据权利要求26所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于napin基因。28．用于在种子中生产所需的类胡萝卜素化合物的方法，所述方法包括获得产生所述种子的转化的植物，所述植物具有和表达其基因组可操作连接到质体转运肽的一级基因和来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域，其中所述的一级基因是早期类胡萝卜素生物合成基因；和至少一个二级基因，它可操作连接到来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域，其中所述二级基因编码该途径的类胡萝卜素生物合成基因，以使所述类胡萝卜素化合物可操作连接到质体转运肽，或通过抑制能够修饰所述类胡萝卜素化合物的酶的表达提供了导致所述类胡萝卜素化合物积累的DNA序列的转录，其中所述抑制是通过反义或共抑制所述的酶获得的。29．根据权利要求28所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码选自于下列组的酶香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶。30．根据权利要求29所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合成酶。31．根据权利要求28所述的方法，其中所述的二级基因编码选自于下列组的酶β-胡萝卜素羟化酶，由crtW编码的虾青素生物合成酶，和ε-羟化酶，或其中所述的二级基因抑制编码番茄红素ε-环化酶、番茄红素β-环化酶或八氢番茄红素脱饱和酶的内源性植物基因的转录。32．根据权利要求31所述的方法，其中所述的二级基因编码β-胡萝卜素羟化酶。33．根据权利要求31所述的方法，其中所述的二级基因编码由crtW编码的虾青素生物合成酶。34．根据权利要求31所述的方法，其中所述的植物表达两个二级基因。35．根据权利要求34所述的方法，其中所述的二级基因是crtZ和crtW。36．根据权利要求31所述的方法，其中所述的二级基因导致抑制番茄红素ε-环化酶的转录。37．根据权利要求34所述的方法，其中所述的二级基因导致抑制番茄红素ε-环化酶和番茄红素β-环化酶的转录。38．根据权利要求31所述的方法，其中所述的二级基因编码ε-羟化酶。39．根据权利要求34所述的方法，其中所述的二级基因是ε-羟化酶和crtZ。40．根据权利要求31所述的方法，其中所述的二级基因编码八氢番茄红素脱饱和酶。41．根据权利要求28所述的方法，其中所述的种子是油菜。42．根据权利要求27所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于优选地在油菜种子组织中表达的基因。43．根据权利要求42所述的方法，其中所述转录起始区域来自于napin基因。44．用于改变所需植物的种子的脂肪酸含量的方法，所述方法包括用一个表达盒转化所述的植物，该表达盒包括作为可操作连接的成分的来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域、质体转运肽、一级基因的DNA编码序列，和转录终止区域，其中所述的一级基因是早期类胡萝卜素生物合成基因。45．根据权利要求44所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码选自于下列组的酶香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶。46．根据权利要求45所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合成酶。47．根据权利要求44所述的方法，其中所述的植物是油菜种子作物作物，它选自于下列组油类种子油菜，棉花，大豆，红花，太阳花，椰子，棕榈和谷物。48．根据权利要求47所述的方法，其中所述的植物是油类种子油菜。49．根据权利要求46所述的方法，其中所述的基因是crtB。50．根据权利要求44所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于优选地在油菜种子中表达的基因。51．根据权利要求44所述的方法，其中所述的转录起始区域来自于napin基因。52．根据权利要求44所述的方法，其中所述的种子包括增加的油酸。53．根据权利要求52所述的方法，其中所述的种子的亚油酸和/或亚麻油酸脂肪酸含量降低。54．筛选转化的种子或转化的胚的方法，所述的方法包括用一个表达盒转化所述的植物，该表达盒包括作为可操作连接成分的来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域，质体转运肽，至少一个类胡萝卜素生物合成基因的DNA编码序列，和转录终止区域，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码选自于下列组的酶香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶和选择显示黄色、桔黄色或红色的所述的转化的种子或转化的胚。55．根据权利要求54所述的方法，其中所述早期类胡萝卜素生物合成基因是八氢番茄红素合成酶。56．根据权利要求55的方法，其中所述植物是油类种子油菜植物和其中所述的转化胚显示桔黄色。57．在植物转化中将类胡萝卜素生物合成基因用作为标记基因的方法，其中所述的方法包括用所需的基因和类胡萝卜素生物合成基因转化植物，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因可操作连接到转运肽和来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域，和通过筛选显示黄色、桔黄色或红色的胚或从所述的转化植物的种子筛选具有黄色、桔黄色到红色的种子而选择所述的转化的植物。58．根据权利要求57所述的方法，其中所述的类胡萝卜素生物合成基因选自于下列组香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶。59．根据权利要求58所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因是八氢番茄红素合成酶。60．产生具有改变的类胡萝卜素含量的种子的转基因植物。61．根据权利要求60所述的植物，其中所述的种子中至少一种所需的类胡萝卜素化合物含量增高，所述化合物选自于下列组α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，番茄红素，叶黄素，玉米黄质，角黄素，八氢番茄红素，α-玉米黄质，β-玉米黄质，ζ-玉米黄质，六氢番茄红素，链孢红素和虾青素。62．根据权利要求61所述的植物，其中所述的种子产生增高含量的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素、叶黄素。63．根据权利要求62所述的植物，其中所述的种子还具有改变的脂肪酸成分。64．根据权利要求63所述的植物，其中所述的种子具有增高含量的油酸和降低含量的亚油酸和/或亚麻油酸。65．具有改变的类胡萝卜素含量的转化的种子。66．根据权利要求65所述的转化的种子，其中所述的种子中至少一种所需的类胡萝卜素化合物的含量增高，所述化合物选自于下列组α-胡萝卜素，β-胡萝卜素，番茄红素，叶黄素，玉米黄质，角黄素，α-玉米黄质，β-玉米黄质，ζ-玉米黄质，六氢番茄红素，链孢红素和虾青素。67．根据权利要求66所述的转化的种子，其中所述的种子产生增高含量的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素、叶黄素。68．根据权利要求65所述的转化的种子，其中所述的种子具有改变的脂肪酸成分。69．根据权利要求68所述的转化的种子，其中所述的种子具有增高含量的油酸和降低含量的亚油酸和/或亚麻油酸。70．用于提高宿主植物的种子的维生素E含量的方法，所述方法包括用表达盒转化所述的宿主植物，该表达盒包括作为可操作连接成分的来自于优选地在植物种子中表达的基因的转录起始区域、质体转运肽、一级基因的DNA编码序列、转录终止区域，其中所述的一级基因是早期类胡萝卜素生物合成基因，选自于下列组香叶基香叶基焦磷酸盐合成酶，八氢番茄红素合成酶，八氢番茄红素脱饱和酶，异戊烯基二磷酸异构酶。71．根据权利要求70所述的方法，其中所述的早期类胡萝卜素生物合成基因编码八氢番茄红素合成酶。72．根据权利要求71所述的方法，其中在所述种子中α-维生素E含量提高至少50％。73．根据权利要求71所述的方法，其中所述的基因来自于非高等植物来源。74．根据权利要求73所述的方法，其中所述的基因是crtB。75．根据权利要求70所述的方法，其中所述的宿主植物是油类种子油菜植物。76．由权利要求1,11,20,28,44和70任一项所述的方法产生的种子。77．由权利要求1,11,20,28,44,54,57和70任一项所述的方法产生的植物。78．从由权利要求1,11,20,28,44和70任一项所述的方法产生的种子提取的油类。79．从由权利要求1,11,20,28和70任一项所述的方法产生的种子提取的粉。80．根据权利要求1,11,20,28和70任一项所述的方法，其中所述的种子来自于选自于下列组的植物油类种子油菜，棉花，大豆，红花，太阳花，椰子，棕榈，小麦，大麦，水稻，玉米，燕麦，苋，西葫芦，南瓜，芝麻，罂粟，葡萄，绿豆，花生，豌豆，菜豆，小萝卜，苜蓿，可可，咖啡，树生坚果。81．根据权利要求80所述的方法，其中所述种子来自于油类种子作物植物，选自于下列组油类种子油菜，棉花，大豆，红花，太阳花，棕榈，椰子和谷物。全文摘要提供了用于生产具有改变的类胡萝卜素、脂肪酸和维生素E成分的植物和种子的方法。该方法对于提高油料种子植物中类胡萝卜素含量和提供所需的高油酸种子油类具有特定的用途。文档编号C12P7/64GK1227609SQ97197150公开日1999年9月1日申请日期1997年8月8日优先权日1996年8月9日发明者克里斯蒂娜·K·休梅克申请人:卡尔金公司