专利名称：从植物黄花蒿中分离化合物东莨菪亭的方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物黄花蒿(Artemisia annua)和其它植物科中分离用作氧化氮合成抑制剂的化合物东莨菪亭的方法。东莨菪亭属于香豆素类化合物。东莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基香豆素)是苯并-α-吡喃酮香豆素的一种衍生物，已发现它在植物中以游离状态和苷类两种形式存在。
天然香豆素类对活的生物体具有不同的和显著的作用。香豆素类具有许多药理和生理活性如抗菌、血管舒张和利尿作用、抗凝血特性、保护肝脏和呼吸兴奋。东莨菪亭显示出了非常好的生长抑制特性(Shilling D G和Yoshikawa F,Amerchem.Soc.Symp Series,330:335-342)。最近据报导东莨菪亭在鼠的巨噬细胞中显示出了对氧化氮(NO)合成的抑制作用。巨噬细胞在最终防御感染和肿瘤发展方面起重要作用，并且这种活性是通过产生几种中间物来调节的。巨噬细胞产生氧化氮能够调节杀死肿瘤细胞、细菌、真菌和寄生虫或其生长抑制剂。所以开发一种有效并经济的东莨菪亭的来源、iNOs的抑制剂对将来进行有效治疗和商业应用是有价值的(Tai-Hyun Kang等东莨菪亭来自矮蒿中的一种可诱发NO合成抑制性活性组份，P1anta Media,65:400-403,1999；来自Ttraxinus rhynchobhyeli的体外可诱发NO合成抑制性活性成分，PlantMedia,65:656-658,1999)。
东莨菪亭广泛分布于植物王国中并可从植物的不同部位(根、果、叶、茎等)中分离得到，但发现几种相关成分经常的共存从而使得分离困难。通常，香豆素类的分离最初取决于用极性递增的溶剂对干燥植物进行的连续提取，常用的溶剂为石油醚(pet ether)、苯、乙醚、丙酮或甲醇。
用于分离香豆素类的常规方法是用95％甲醇/乙醇提取干燥的粉状物质并用10％碱性溶液处理浓缩过的提取液。用乙醚提取碱性溶液以除去脂肪物质。酸化含水溶液并用乙醚或氯仿提取得到粗的香豆素类。通过硅胶或矾土的柱层析法进一步纯化得到纯的香豆素类。用升华方法能够从植物组织中分离到特定的香豆素类(如umbilliferon、东莨菪亭)(Abu-Mustafa,E.A.；E1-Tawil,B.A.H.和M.B.E.Fayez；Phytochemistry,3,701(1964))。
尽管如此，通过酸碱处理分离香豆素的方法还是不理想的，这是因为几乎不能防止某些香豆素类的降解，从而导致分离出的是人工产物而不是原始的化合物或者造成化合物损失。在另外一种方法中，通过升华进行的纯化包括形成人工产物的热降解。总回收量下降。因此未曾报道过用于商业开发的高东莨菪亭含量的植物和任何大规模分离东莨菪亭的方法。
本发明的一个目的是开发具有高东莨菪亭含量的新植物/植物部位。
本发明的另一目的是选择用于选择性提取东莨菪亭的溶剂。
本发明的又一目的是开发一种分离纯东莨菪亭的经济的方法。
因比，本发明提供了一种从植物黄花蒿和其他植物科中分离氧化氮合成抑制剂化合物东莨菪亭的方法，它包括用含水乙腈溶剂提取粉状植物部位，用氯化溶剂分配，在蒸发溶剂、残余物层物和结晶之后得到纯东莨菪亭。方法的新颖性1．选择提取东莨菪亭的植物部位，提高了产量并减少了工艺成本。
2．用含水乙腈提取该植物部位比使用其他极性溶剂如甲醇或乙醇更经济并具有更优的东莨菪亭产量。
3．在该方法中，通过避免任何酸碱处理来分离东莨菪亭从而提高产量。
4．将东莨菪亭选择性地从含水提取液转到卤化的非极性相中，从而易于纯化和分离纯的东莨菪亭。
5．在层析前纯化粗提取物得到50％的东莨菪亭结晶。
6．该方法可以重复使用溶剂和硅胶。
7．这些优点是对大规模生产东莨菪亭来说具有显著的经济价值。
本发明提供了一种从黄花蒿和其他植物科中分离用作氧化氮合成抑制剂的化合物东莨菪亭的方法，该方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶剂提取不同植物部位的干燥粉状物6-8小时，b)真空浓缩提取过的溶剂到其原始提取液的30％，c)用卤化溶剂分配浓缩的提取液从而把东莨菪亭转入非极性卤化溶剂中，d)在无水硫酸钠上把卤化溶剂干燥并蒸发溶剂，e)在甲醇中将残余物结晶并过滤晶体，f)浓缩滤液并在硅胶上进行层析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脱东莨菪亭，结晶含有东莨菪亭的级分得到纯的东莨菪亭化合物。
在本发明的一个实施方案中，选用黄花蒿植物来分离东莨菪亭。据报导西班牙的黄花蒿的ariel部位含有0.02％东莨菪亭而英国的(cult)含有0.034％东莨菪亭。据报导中国的整株植物都有东莨菪亭(Brown,G.D.源于黄花蒿的两种新化合物J.Nat.Prod.58,300(1992)；Marco,J.A.；Sawz,J.F.；Bea,J.F.；Barber,O.黄花蒿中的酚类组份Pharmazie 45,382-383(1990)；Liu,H.M.；Li,G.L.,Wu,H.Z.青蒿成分的研究药学学报，37,129-143(1979))。
在印度CIMAP,Lucknow已经开发了一种产生高含量青蒿素和生物量(茎和叶)的新种黄花蒿“Jeevan raksha”。据报导青蒿素及其衍生物可以作为对氯喹等多种药物耐受的和严重的复杂疟疾的有效药。黄花蒿植物是青蒿素的唯一来源。
采用HPLC对新种黄花蒿植物的所有三个主要部位的东莨菪亭含量进行筛选。在不同部位得到的东莨菪亭的含量为叶0.2％、茎0.3％和根0.004％。东莨菪亭的产量比其他报道的植物的高很多。植物黄花蒿的茎由于不含青蒿素而被视为废物。植物茎部分的生物量是叶的五倍多。所以，我们已经选择植物花黄蒿的茎部位分离东莨菪亭。也发现茎的茎髓部分含有较少的有色和脂肪物质，这使分离和纯化东莨菪亭变得容易。
在现有技术中，已经发现使用非极性溶剂提取植物原料，会导致香豆素类回收量减少。而且，用于提取香豆素类的极性溶剂(甲醇和乙醇)会得到更多量的具有较多有色和脂肪物质的总提取物。分离脂肪和有色物质是一件困难的工作。在本发明中，我们选择了含水乙腈溶剂来提取，从而得到更多量的含有较少有色和脂肪物质的东莨菪亭。同时也使得从乙腈中分离水来回收纯的溶剂用于重复利用变得非常容易。
在现有技术中，从粗提取物中通过酸碱处理或者通过升华方法纯化东莨菪亭，由于它的重排和热分解的原因导致了东莨菪亭产量的减少。在本发明改良的方法中，通过用氯化溶剂(四氯化碳、二氯甲烷、氯仿)分配含水相选择性地将香豆素类从含水提取液转入非极性相中。采用该步骤，把大多数有色和脂肪物质留在了极性相中，从而在非极性相中富集了在粗提取液中自身容易结晶(50-60％)的东莨菪亭。结晶后留在母液中的东莨菪亭只以1∶10的比例经过硅胶柱层析法来完成纯东莨菪亭的分离。把东莨菪亭从含水提取液中分配到非极性溶剂减少了60-70％的粗提取液的容积，从而减少了该方法中硅胶和溶剂的用量。
该方法由下列操作组成1．在阴暗处干燥和研碎黄花蒿的茎。2．通过冷渗法用含水乙腈溶剂提取粉状黄花蒿茎。3．真空浓缩总提取液。4．用卤化溶剂分配含水乙腈相。5．从总卤化提取液中除去水分。6．蒸馏卤化溶剂得到残余提取液。7．从残余提取液中结晶东莨菪亭。8．过滤并浓缩母液。9．在硅胶柱上层析母液获得纯东莨菪亭。
本发明提供了一种从植物黄花蒿中提取和分离东莨菪亭的方法以克服现存方法的缺陷。本发明更具体地提供了一种从天然原料中获得更为便宜和更高产量的氧化氮合成抑制剂化合物东莨菪亭的方法。
所以，本发明提供了一种从黄花蒿中提取和分离东莨菪亭的方法，该方法包括以1∶5的比例用含水乙腈溶剂提取植物部位，优选为黄花蒿的干燥茎粉；真空浓缩提取液，用非极性卤化溶剂分配经浓缩的提取液，蒸发卤化溶剂，在甲醇中结晶残留物，过滤东莨菪亭，浓缩母液并在硅胶上层析得到纯东莨菪亭。
在本发明的一个实施方案中，用于提取的溶剂选自1∶9到9∶1的不同比例的乙腈∶水。
在本发明的另一个实施方案中，用于分配的卤化溶剂选自二氯甲烷、四氯化碳、氯仿等。在本发明的又一个实施方案中，提取东莨菪亭的植物部分选自茎、叶、根等。
在本发明的又一个实施方案中，在硅胶上分离东莨菪亭，其粗提取液与硅胶之比选自1∶5到1∶20，优选为1∶5,1∶10或1∶20。
下列实施例中所提供的本发明的细节只是用于详细说明而不是为了限定本本发明的又一个实施方案中，从植物科如伞形科、芸香科、菊科、豆科、桑科、石竹科等提取和分离东莨菪亭。
在本发明又一实施方案中，东莨菪亭是在选自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶剂中结晶的。
在本发明的另一个实施方案中，从黄花蒿不同部位分离的东莨菪亭是茎中0.25-0.30％，叶中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
实施例-1选择提取的植物部位对黄花蒿不同部位(叶、茎、根)中东莨菪亭含量进行了对比研究。用甲醇提取0.1gm的干粉样品。过滤提取液并将溶剂蒸干。把提取物溶于1ml的甲醇中。在下列操作条件下采用配有光二极管阵列检测器的LC8A Shimadzu HPLC对每个样品中东莨菪亭的含量进行评估流动相乙腈水(30∶70)；流动速率0.8ml/min，在230nm处检测，柱-C18 Lichrosorb,10um Merck德国。用配制成1mg/5ml甲醇的标准东莨菪亭溶液的标准曲线进行定量。在不同植物部位中评估的东莨菪亭含量如下叶(0.16)，茎(0.2)和根(0.003)。
实施例-2选择提取溶剂用10ml的不同溶剂(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水、甲醇∶水(9∶1)、乙醇∶水(9∶1)和乙腈∶水(9∶1))提取黄花蒿的茎粉状样品(0.1gm),冷渗24小时。过滤各提取液并真空蒸发。将各提取物溶于1ml的HPLC级的甲醇中并用实施例-1中所述的HPLC方法评估东莨宕亭的含量。在不同溶剂中记录的黄花蒿茎中的东莨菪亭含量如下二氯甲烷(0.016％)、氯仿(0.16％)、乙酸乙酯(0.09％)、甲醇(0.2％)、乙醇(0.24％)、乙腈(0.22％)、水(0.28％)、甲醇∶水(9∶1；0.16％)、乙醇∶水(9∶1；0.23％)和乙腈∶水(9∶1；0.30％)。
实施例-3从茎中提取和分离东莨菪亭把黄花蒿茎研成粉状。用10％的含水乙腈(5×500ml)在渗滤器中提取粉状物质(100gm)6-8小时。把总提取液真空浓缩到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配浓缩过的含水提取液。在无水硫酸钠上干燥氯仿提取液并蒸发溶剂得到残余物2.0gm。把残余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小时结晶。过滤晶体化合物并干燥得到纯东莨菪亭。结晶步骤重复两次得到60％的纯化合物。以(1∶20)的比例硅胶柱色谱法分离滤液中的剩余东莨菪亭，采用4％的甲醇氯仿溶液洗脱。蒸发含有东莨菪亭的级分并结晶得到纯东莨菪亭。从100gm含有0.3％东莨菪亭含量的茎粉中得到85％的纯东莨菪亭。用mp,IR,1H,13C NMR和质谱数据来鉴别该东莨菪亭，如文献中报道的那样。
实施例-4从茎中提取和分离东莨菪亭把黄花蒿茎研成粉状。在渗滤器中用30％的含水乙腈(5×500ml)对粉状物质(100gm)提取6-8小时。把总提取液真空浓缩到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配浓缩过的含水提取液。在无水硫酸钠上干燥氯仿提取液并蒸发溶剂得到2.1gm。把残余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小时结晶。过滤晶体化合物并干燥得到纯东莨菪亭。结晶步骤重复两次得到50％的纯化合物。用(1∶10)的比例硅胶柱色谱法分离滤液中的剩余东莨菪亭，用2％的甲醇氯仿溶液洗脱。蒸发含有东莨菪亭的级分并结晶得到纯东莨菪亭。从100gm含有0.3％东莨菪亭含量的茎粉中分离得到82％的纯东莨菪亭。
实施例-5从茎中提取和分离东莨菪亭把黄花蒿茎研成粉状。在渗滤器中用70％的含水乙腈(5×500ml)对粉状物质(100gm)进行提取6-8小时。把总提取液真空浓缩到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配浓缩过的含水提取液。在无水硫酸钠上干燥氯仿提取液并蒸发溶剂得到残余物2.30gm。把残余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小时结晶。过滤晶体化合物并干燥得到纯东莨菪亭。结晶步骤重复两次得到40％的纯化合物。以(1∶5)的比例硅胶柱色谱法分离滤液中的剩余东莨菪亭，用氯仿洗脱东莨菪亭。蒸发含有东莨菪亭的级分并结晶得到纯东莨菪亭。从100gm含有0.3％东莨菪亭含量的茎粉中分离得到80％纯东莨菪亭。
实施例-6从叶中提取和分离东莨菪亭把黄花蒿叶研成粉状。用己烷(5×400ml)给粉状物质(100gm)脱脂。给叶脱脂后，再在渗滤器中用70％含水乙腈(5×500ml)对剩余的残渣提取6-8小时。把总提取液真空浓缩到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配浓缩过的含水提取液。在无水硫酸钠上干燥氯仿提取液并蒸发溶剂得到残余物2.0gm。把残余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小时结晶。过滤晶体化合物并干燥得到纯东莨菪亭。结晶步骤重复两次得到30％的纯化合物。以(1∶20)的比例的硅胶柱色谱法分离滤液中的剩余东莨菪亭，用4％的甲醇氯仿溶液洗脱。蒸发含有东莨菪亭的级分并结晶得到纯东莨菪亭。从100gm含有0.23％东莨菪亭含量的叶粉中得到80％的纯东莨菪亭。
本发明的主题提取和分离东莨菪亭的方法具有许多优点。1．在该方法中避免使用会减少东莨菪亭含量的现有技术中分离总香豆素类所用的酸碱处理。2．用含水乙腈溶剂提取比用其他极性溶剂如甲醇、乙醇和水的提取更经济并且东莨菪亭的产量更高。3．由于在层析前50％的东莨菪亭结晶，所以硅胶量已经减少。4．该方法可以使溶剂重复使用。5．选择植物茎进行提取提高了东莨菪亭的产量并减少了生产成本，这是因为黄花蒿茎中不含青蒿素，因而它是一种废物。6．茎中东莨菪亭的含量高，在蒿属植物中茎生物量是叶的五倍并且在茎部位中含有较少的有色物质，使纯化简单。7．该优点对从黄花蒿中大规模生产东莨菪亭来说具有显著经济价值。
权利要求
1.一种从黄花蒿和其他植物科中分离用作氧化氮合成抑制剂的化合物东莨菪亭的方法，该方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶剂提取不同植物部位的干燥粉状物6-8小时，b)真空浓缩提取过的溶剂到其原始提取液的30％，c)用卤化溶剂分配浓缩的提取液从而把东莨菪亭转入非极性卤化溶剂中，d)在无水硫酸钠上把卤化溶剂干燥并蒸发溶剂，e)在甲醇中将残余物结晶并过滤晶体，f)浓缩滤液并在硅胶上进行层析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脱东莨菪亭，结晶含有东莨菪亭的级分得到纯的东莨菪亭化合物。
2．按照权利要求1的方法，其中其他植物科为伞形科、芸香科、菊科、豆科、桑科、石竹科等。
3．按照权利要求1的方法，其中用于提取的植物部位选自茎、叶、根等。
4．按照权利要求1的方法，其中乙腈-水溶剂比为9∶1到1∶9。
5．按照权利要求1的方法，其中卤化溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等。
6．按照权利要求1的方法，其中在选自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶剂中结晶东莨菪亭。
7．按照权利要求1的方法，其中通过硅胶柱层析法从母液中得到东莨菪亭，其中粗提取液与硅胶的比的范围为1∶5到1∶20，优选为1∶5、1∶10或1∶20。
8．按照权利要求1的方法，其中从黄花蒿不同部位分离的东莨菪亭的范围为茎中0.25-0.30％，叶中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
全文摘要
从黄花蒿和其他植物科中分离用作氧化氮合成抑制剂的化合物东莨菪亭的方法,包括用含水乙腈溶剂以1∶5的比例提取不同植物部位的干燥粉状物6—8小时,真空浓缩所提取的溶剂到原始提取液的30%,用卤化溶剂分配浓缩的提取液从而把东莨菪亭转入非极性卤化溶剂中,在无水硫酸钠上把卤化溶剂干燥并蒸发溶剂,在甲醇中将残余物结晶并过滤晶体,浓缩滤液并在硅胶上层析,用氯仿甲醇混合液洗脱东莨菪亭,结晶含有东莨菪亭的级分得到纯的东莨菪亭化合物。
文档编号C07D311/16GK1315324SQ00108330
公开日2001年10月3日 申请日期2000年3月30日 优先权日2000年3月30日
发明者D·C·杰恩, N·潘特, M·M·谷普塔, R·S·布哈库尼, R·K·威马, S·坦多恩, S·K·谷普塔, A·特瓦里, A·P·卡霍尔, S·库马 申请人:科学与工业研究会