专利名称：一种猪免疫力分子遗传标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物分子遗传标记制备技术领域，具体涉及一种用miR-155前体侧翼序列预示和鉴定猪免疫力的分子标记的制备和应用。
背景技术：
在现代集约化饲养方式下，疾病特别是传染病成为制约养猪业健康、持续、稳步发展的主要因素。虽然通过采取加强饲养管理、改善环境卫生条件、应用药物和疫苗进行治疗和预防等措施使疾病得到了一定的控制，但从长远来看，采用育种措施从遗传角度提高猪群抗病力，才能使养猪业真正远离疾病的困扰。个体免疫力是衡量动物抗病能力的重要指标，阐明免疫性状的遗传机制，挖掘出具有重大育种价值的关键基因，在此基础上寻找可行 的分子标记，并在生产中应用，成为分子抗病育种研究的重点之畜禽免疫性状是受多基因控制的数量性状，目前对猪分子抗病育种的研究主要集中在以下三个方面(I)猪抗病性状的QTL研究。研究发现在SSC9，5，6，13存在猪伪狂犬病毒易感或抗性QTL ;在SSCl，8存在影响白细胞数量、血细胞容积、白细胞介素2 (interleukin2, IL2)和α干扰素(interferon α ,IFN α)分泌量等免疫指标的QTL ;在SSC7存在猪肉孢子虫的易感或抗性QTL ;在3305，7，8，12，13存在红细胞性状QTL。最近的研究发现发现猪1、2-4、6-8、12、15、16和18号染色体存在控制免疫性状的QTL。(2)猪抗病性状的候选基因研究。目前研究较清楚的是猪大肠杆菌Κ88和F18受体基因。国内学者也对这类基因进行了一定程度的研究。此外，选择与免疫应答相关的基因，如干扰素(iterfeixm，IFN)及其受体基因、猪白细胞抗原复合体(swine leukocyte antigen, SLA)及其抗原呈递基因、白细胞介素(interleukin, IL)、Toll 样受体(Tolllike receptors, TLRs)、自然抗性相关巨嗤蛋白 I (natural resistance-associated macrophage proteinl,NRAMPl)基因和Mxl 等基因作为免疫性状的候选基因，进行相应的研究。(3)病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究。Petry等测定了用猪繁殖与呼吸综合症病毒处理不同品系猪后各品系个体的肺组织和支气管淋巴结中免疫基因的表达谱，发现白细胞介素8 (interleukinS，IL8)可能是一个候选抗性基因。Zhao等利用基因芯片对正常猪与沙门氏菌感染猪的肺组织基因表达谱进行了研究，发现转谷氨酰胺酶基因家族基因(transglutaminase family genes, TFG), IFNs诱导基因(GBP1，GBP2, CIS, C1R，MHC2TA，PSMB8, TAPI, TAP2)等在感染前后表达差异显著。为了寻找新的免疫性状候选基因，国内外研究者利用mRNA差异显示技术和基因芯片技术从猪免疫细胞和器官中分离出一批新基因。目前，这些差异基因作为抗病育种候选基因的相关研究正在进行。虽然猪分子抗病育种研究已取得一定的成果，但目前鉴定的候选基因无法满足抗病育种的需要。由于构建用于抗病性状QTL定位的资源家系成本高、难度大，因此，利用候选基因法挖掘抗病性状的遗传标记仍将是猪分子抗病育种研究的重要内容。miR-155第一个被发现的参与免疫调控的miRNA。基因敲除研究发现，miR-155基因敲除小鼠与正常小鼠相比，抗细菌感染能力差、抗体滴度低、T细胞反应水平低。进一步研究发，敲除miR-155导致其它基因的活性发生改变，不能进行有效的免疫反应，容易发生自身免疫和感染。对miR-155的深入研究发现，该基因在免疫系统中发挥重要的调控作用。miR-155参与固有免疫(innate immune)细胞的发育调控。例如，miR-155通过作用于SHIP I (Srchomology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase I)导致粒细胞成熟障碍。在固有免疫应答中，miR-155 革巴向 FADD (Fas-associated death domain protein)，IKK ε (I κ Bkinase ε )和 Ripkl (receptor interacting serine-threonine kinase I)，进而精细调控免疫应答。此外，miR-155在获得性免疫(acquired immune)细胞的分化发育及功能调节中也发挥作用。miR-155 通过下调 SOCS I (suppressor of cytokine signaling I)来调控 T 细胞的增殖；通过下调 AICD (activation-induced cytidine deaminase)降低 IgG I 抗体水平，进而调控B细胞的型别转换。miR-155基因在哺乳动物免疫调控中发挥重要作用，但目前未见利用猪miR-155基因来寻找猪免疫性状相关分子标记的报道。鉴于此，我们选择该基因作为猪抗病育种的候选基因，克隆了该基因及其侧翼区域，利用该序列进行多态性分析和性状关联分析，以期获得猪免疫性状相关分子标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寻找猪miR-155基因突变位点以及基因多态性的检测方法，也就是用miR-155基因预示和鉴定猪免疫力的分子标记方法。本发明的目的是这样实现的本发明提供了包括猪miR-155基因及其侧翼区域的454bp的基因组核苷酸序列，通过不同个体的基因组核苷酸序列比对提供了位于猪454bp扩增片段内部的一处单核苷酸多态性(SNP)。具体为一种猪miR-155前体侧翼序列SNP作为猪免疫性状的遗传标记，它是序列表SEQ ID No. I所不碱基序列。在序列表SEQ ID NO. I序列158bp处有一个碱基突变C158-T158,并导致 HhaI-RFLP 多态性。制备该基因片段的步骤如下(I)选择民猪、长白猪和杜洛克猪各一头为试验材料，从猪血液中提取DNA ；(2)从miRBase下载猪miR-155基因的前体序列和成熟序列，利用ENSEMBL数据库(Sscrofa9)进行pre_miRNA染色体定位,将前体序列向5’和3’侧翼区分别步移600bp和300bp后下载序列。根据下载序列设计引物对如下F5/ -CTACCCACTTCGACTTATGAC-3'，R 5/ GGAACATCCCAGTGACCAG-3'；(3) PCR 扩增；(4) PCR产物纯化、克隆、测序。(5)序列比对分析。
本发明提供了鉴定上述序列158bp处C/T变异的限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)基因型分型方法。其步骤包括(I)在猪基因组DNA中进行PCR扩增；(2) PCR扩增片段HhaI酶切分型及检测。本发明进一步提供了利用HhaI PCR-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的相关关系。根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。
图I :是本发明中用于检测分子标记的所克隆的猪miR-155及其侧翼区域序列，图中方框标记为碱基的突变位点，序列首尾的阴影区为引物对。
图2 :不同猪种经序列比对后发现的SNP位点，用方框标记。图3 :琼脂糖凝胶浓度为I. 5%;泳道M为DNAMarker DL2, 000 ;泳道I代表引物扩增片段，片段大小为454bp。图4 :琼脂糖胶浓度为I. 5% ;泳道M为DNAMarker DL2, 000 ；2~4泳道为TT基因型，454bp ；1和6泳道为TC基因型，295bp，159bp和454bp ；5泳道为CC基因型，295bp和159bp。
具体实施例方式下面举例对本发明做进一步说明。实施例I :基因片段的获得及多态性检测方法的建立I猪miR-155基因及其侧翼区域DNA序列扩增(I)引物设计选择中国地方品种民猪和西方品种长白猪、杜洛克猪为试验材料，从miRBase下载ssc-miR-155基因的前体序列和成熟序列，利用ENSEMBL数据库(Sscrofa9)进行pre-miRNA染色体定位,将前体序列向5’和3’侧翼区分别步移600bp和300bp后下载序列。根据下载序列设计引物，引物序列如下正向引物F : 5' -CTACCCACTTCGACTTATGAC-3'反向引物R : 5' -GGTTCATCCCAGTGACCAG-3'用此引物在3个猪种基因组DNA(分别为民猪、长白猪和杜洛克猪)中进行PCR扩增，PCR反应体系为25μ 1，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200 μ mol/L，每条引物浓度为 O. 4 μ mol/L, 2U 的 Taq DNA 聚合酶(Biostar International, Canada) , 12. 5 μ I buffer,加去离子水至总体积25 μ I ;PCR反应程序94°C预变性4min ;然后94°C变性50s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸IOmin0 PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，用引物扩增得到了 454bp特异性扩增片段，用于回收测序。(2)PCR产物的纯化、克隆和测序具体操作步骤如下PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入I. 5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作，具体步骤是每IOOmg的凝胶中加300 μ L的SI液,于65°C温育IOmin至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500 μ L的Wl液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500 μ L 的 Wl 液,静置 lmin, 9200g 离心 30s,取下 Minicolumn 装入 I. 5mlEpendorff 管中,加入25 μ L的灭菌水或者TE液,静置Imin之后，9200g离心lmin,以洗脱DNA存于Ependorff管中。连接反应将纯化PCR产物与pMD18-T Vector连接，连接反应总体积是10 μ L，其中包括 2 X Rapid Ligation Bufer,2. 5μ L ；Vector (50ng), O. 5 μ L ;回收 DNA，7-8 μ L。稍微弹打混合均匀，于16°C连接Ih以上或者4°C连接过夜。感受态细胞的制备 从37°C培养了 16_20h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落接种于2mL LB中，于37°C振荡培养3h，转接ImL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37°C振荡培养约4h，待0D600达到O. 3-0. 4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10_15min， 然后将菌液转入离心管中于4°C 4，OOOg离心IOmin以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用IOmL冰预冷的O. lmol/L的CaCl2重悬沉淀,冰浴30min,重复4°C 4, OOOg离心IOmin一次，用4ml冰预冷的O. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，置4°C保存备用。转化在灭菌的1.5mL离心管中加入100 μ L感受态细胞，于冰上加入连接产物5 μ L，用移液枪吸打均匀，冰浴30min ;将离心管置于42°C的循环水浴中(勿震动)，热激90s后迅速冰浴2min ;再往离心管中加入400 μ L LB培养液，在37°C摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min ;离心，去除部分上清液，取100 μ L复苏后的菌液布于含Amp的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37°C培养14-16小时，观察有无菌落长出；阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取转化好的菌斑接入含ImLLB的I. 5mL离心管中并于37°C振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用M13(上海生物工程有限公司提供)测序通用引物(退火温度58-60°C )进行PCR扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由大连宝生物工程有限公司完成。(3) DNA序列比对不同猪种的PCR产物序列经ClusterW软件进行序列比对(图2)。上述扩增片段大小为454bp，位于该片段的158bp处的C/T变异引起了 HhaI酶切位点(GCG丨C)多态性(图I)。据此，采用HhaI PCR-RFLP方法进行SNP分型。II PCR-RFLP诊断方法建立取8·5μ I PCR 产物加入O. 5μ 1(10υ/μ I)限制性内切酶和 1μ I 10 X buffer ( ^10XBSA)，37°C HhaI酶切4h，取5μ I酶切产物用琼脂糖电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为454bp，HhaI酶切多态性位点位于该片段的158bp处，当158bp处为C碱基时，会产生限制性内切酶HhaI的酶切位点(GCGC)，所以HhaI消化PCR产物后会产生2个片段(295bp和159bp)，将其命名为CC基因型；当158bp处变异位点为T碱基时(GTGC)，则不存在HhaI酶切位点，HhaI消化PCR产物后会产生I个片段(454bp)，将其命名为TT基因型；当158bp处变异位点位点为T/C杂合时，HhaI消化PCR产物后会产生3个片段(454bp，295bp和159bp)，将其命名为TC基因型(图4)。实施例2 :本发明克隆的分子标记在不同猪种中的分布状态检测为了确定分子标记在不同猪种中的分布状态，选择民猪、长白猪、大白猪和杜洛克猪为试验材料。采用实施例I所建立的HhaI PCR-RFLP方法检测该标记位点在不同猪种中的基因频率和基因型频率。由表I可见，在民猪和大白猪中存在3种基因型；在长白猪中只有AA基因型；在杜洛克猪中只有AA和AB两种基因型。B等位基因在中国地方品种民猪中频率最高，为O. 47 ;在西方品种中基因频率较低，其中大白猪中为O. 45，杜洛克猪为O. 02，长白猪中为O。在所检测猪种中，大白猪为国外引进品种，但与民猪一样，基因型分布比较平衡。表I miR-155基因侧翼区SNP位点等位基因与基因型频率在不同猪种中的分布
权利要求
1.一种猪免疫力分子遗传标记，它是序列表SEQ ID No. I所示碱基序列。
2.一种猪免疫力分子遗传标记，其特征在于序列表SEQ ID NO. I序列158bp处有一个碱基突变C158-T158，并导致HhaI-RFLP多态性。
3.根据权利要求I所述的一种猪免疫力分子遗传标记，其特征在于所述的C158-T158碱基突变，用于检测碱基该突变的方法包括以下步骤从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物HhaI PCR-RFLP(Restriction Fragments Length Polymorphism)基因型分型，其中，用于PCR扩增的引物序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示碱基序列。
4.权利要求1-2任一项所述的一种猪免疫力分子遗传标记在猪辅助选择育种中的应用。
5.根据权利要求3—种猪免疫力分子遗传标记，其特征在于所述的引物对在猪分子标记辅助选择育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种猪免疫力分子遗传标记及其应用，具体涉及一种猪miR-155前体侧翼序列SNP作为猪免疫性状的遗传标记，它是序列表SEQ ID No.1所示碱基序列。在序列表SEQ ID NO.1序列158bp处有一个碱基突变C158-T158，并导致HhaI-RFLP多态性。本发明用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。
文档编号C12N15/11GK102827835SQ201210178819
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者牛步月, 杨秀芹, 王希彪 申请人:东北农业大学