专利名称：一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，特别涉及一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、 引物和试剂盒。
背景技术：
丝绸是中国古老文化的象征，中国古老的丝绸业为中华民族文化织绣了光辉的篇章，对促进世界人类文明的发展作出了不可磨灭的贡献。中国丝绸以其卓越的品质、精美的花色和丰富的文化内涵闻名于世。几千年前，当丝绸沿着古丝绸之路传向欧洲，它所带去的，不仅仅是一件件华美的服饰、饰品，更是东方古老灿烂的文明，丝绸从那时起，几乎就成为了东方文明的传播者和象征。目前已知的最早丝织物，是出土于距今约4700年良诸文化的遗址。中国是家蚕丝的发源地，养蚕，缫丝是我国古代在纤维利用上最重要的成就。早在新石器时代，我国已发明丝绸织造以及朱砂染色技术，此后随着织机的不断改进，印染技术的不断提高，丝织品种日益丰富，并形成了一个完整的染织工艺体系，使我国古代的丝绸染织技术领先于世界各国。 根据中国“十一五”规划，到2010年，蚕茧产量应达85-90万吨，蚕农年收入达到200亿元； 丝产量达17-19万吨，烘茧和丝绸印染等领域的总体耗水耗能比2005年降低10% -20%, 丝绸工业年产值2500亿元；真丝绸年出口创汇50-55亿美元，初步实现“丝绸大国”向“丝绸强国”转变的目标。从本质上讲，丝是绢丝昆虫茧的主要成分。目前世界范围内使用的绝大部分都是桑蚕，即我们通常说的家蚕。此外，柞蚕丝也有少量生产，但由于其品质不足，常常被与麻或者棉混纺。绢丝昆虫种类很多，在脉翅目(Neuroptera)、毛翅目(Trichoptera)、双翅目 (Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)和鳞翅目(Lepidoptera)中都有吐丝的，统称为绢丝昆虫。在所有绢丝昆虫中，鳞翅目中的蚕蛾科(Bombycidae)和天蚕蛾科(Saturniinae)(也翻译为大蚕蛾科)的应用价值较高，此外还有栎枯叶蛾科(Lasiocampidae)的一种分布于西西里岛和希腊的栎枯叶蛾具有有应用价值。目前所说的野蚕主要是指天蚕蛾科成员。我国比较容易找到到的有柞蚕属、樗蚕属、柳蚕属、樟蚕属、栗蚕属、透目天蚕属、黄目天蚕属七个属。此外其他属我国也有记载日本锈斑天蚕属、鹿纹天蚕属、惜古比天蚕属、日月天蚕属、丁目天蚕属和合目天蚕属。其中有经济价值且可以人工养殖的至少有以下14种，其中经济价值最高的为小字大蚕蛾、琥珀蚕、天蚕。目前，在我国有野生或养殖记录的为天蚕。天蚕又称为日本柞蚕。属鳞翅目，大蚕蛾科，又名山蚕，学名Antheraea yamamai Guerin-Meneville。主要分布于中国、朝鲜、韩国、日本等地。天蚕茧色为绿色，能缫丝，丝质优美、轻柔，不需要染色而能保持天然绿色，并具有独特的光泽。织成丝绸色泽艳丽、美观，是高级的丝织品。茧呈长椭圆形，长径45-53cm，短径23-27cm。茧色可深绿、浅绿、深金黄色，但绝大部分为绿色，一侧色较深，一侧较浅。在人工饲养条件下，茧为黄绿色。茧能缫丝，1000粒茧可缫生丝250-300g，一粒茧丝长600-700m。纤度比桑蚕丝粗一倍；伸度约 40-50%，比桑蚕丝高1. 8倍；强力约为桑蚕丝的2. 5倍。织成丝绸色泽艳丽、美观，可与其它纤维混织，是极高级的丝织物。在国外，一些贵族还依然保持古老的传统观念，凡是外国商人来中国购货时都说，他们非常喜欢天蚕丝制品，认为可保平安、吉祥如意，能带来好运。 用天蚕丝在服装和饰品上点缀一点点，价格即惊人的昂贵，而且是当吉祥符用。他们把点缀天蚕丝的服装作为世代相传的宝贝珍藏，多把天蚕丝制成神殿里用的缦和帘，用来供养至高无上的神佛。所以我国天蚕丝刚刚被发现，外商就纷纷争相大量抢购，出口价最高时曾卖到人民币3万元/公斤。天蚕的出现也给我国带来了经济的繁荣和昌盛。上个世纪末，日本商人带来的一份报纸报道的新闻消息记载，当时中国长沙马王堆出土了一座千年古墓，其中所有的纺织品都风化成碎片了，只有木乃伊身上的一件衣服还完好，并且有一定的拉力， 经化验后，证明是中国一千多年前的天蚕丝制作而成的。因此，国际市场上持续了长时间的天蚕丝热潮，外国商人疯狂地抢购天蚕丝原料。由于野生天蚕丝稀有十分昂贵，我国自己一直没有天蚕丝制成品，那时只出口原料。现在我们天蚕丝珍品已经试制出来了，这是我们纺织丝绸服装业的骄傲。除天蚕丝外，天蚕幼虫、蚕蛹和成蛾都是极其重要的药材和保健品。 因此，天蚕本身是既具有经济价值的和开发前景的昆虫资源。野生天蚕的收集中，面临的最大问题是如何对收集的品种进行鉴定。而本发明开发出天蚕专用的鉴别标记序列，用于野生天蚕制种前的鉴定。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对缺乏有效的天蚕鉴定方法的不足，提供一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下本发明的技术方案一是，一种鉴定天蚕的遗传标记物，它的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的连续的20-483个碱基序列。 优选448 483bp个碱基序列；更优选序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸，或者序列表中SEQ ID N0. 4 9任一项所示序列的核苷酸。该鉴定天蚕的遗传标记物或者是和序列表中SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的连续的20 483个碱基序列的具有90%以上同源性的序列。在本领域，具有 90%同源性的基因一般就被认为是同一个基因。本发明的技术方案二是，一种鉴定天蚕的引物，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ IDN0. 3所示的序列相同或者互补。所述的引物优选为序列如SEQ ID N0. 4所示，SEQ ID N0. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，或者 SEQ IDN0. 9 所示的核苷酸。本发明的技术方案三是，一种鉴定天蚕的试剂盒，含有特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与 SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互补，且扩增产物的长度为40 483bp。较佳的，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一个如 SEQID N0. 5所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID N0. 6所示，另一个如SEQID N0. 7所示； 或者，一个引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一个如SEQID N0. 9所示。所述的试剂盒还包括1)DNA裂解液，2) PCR反应缓冲液，3) dNTP，4) Taq DNA聚合酶。更佳的，还包括阳性对照，所述的阳性对照是天蚕基因组DNA，优选如序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸。本发明的技术方案四是，一种天蚕的分子鉴定方法，包括以下步骤(1)抽提样品的DNA;(2)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与SEQ ID NO. 1，或者SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互补，且扩增产物的长度为70 300bp ；(3)检测扩增产物的存在，存在扩增产物就表示样品中存在来自天蚕的个体、器官、组织、细胞、基因组DNA或者存在如序列表中SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3 所示序列中的连续的20-483个碱基序列的核苷酸。步骤⑵中所述的PCR扩增，较佳的，反应体系为模板DNA 0. 016 μ g/ μ 1，dNTPs 各 0.02mM，lXEx Buffer (含镁离子)，正向引物 0. 4 μ M，反向引物 0. 4 μ M，Ex taq 0. 04U/ μ 1 ；反应程序为94°C预变性5分钟，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7分钟。本发明的技术方案五是，一种如上所述的鉴定天蚕的遗传标记物的用途，用于鉴定天蚕。以能检测到样品中含有该遗传标记物或其片段，表示样品是天蚕。检测到碱基长度为20 448bp的该遗传标记物的片段，也表示样品是天蚕。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下在野生天蚕制种前，需要对收集的天蚕样品进行鉴定，使用本发明则可以方便、快速、准确的鉴定天蚕。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是PCR产物序列7、8、9(从第二道开始从左到右依次开始)琼脂糖电泳图谱。 M，分子量标准；1，引物1和2的扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID N0. 1。2，引物3和4扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID N0. 2。3，引物5和6扩增产物，扩增产物序列是SEQ ID N0. 3。
具体实施例方式本发明人经过深入而广泛的研究，从天蚕中发现三段核苷酸序列，它们是天蚕的部分基因，经过序列同源性检索，发现它们和其他物种包括绢丝昆虫的同源性很低，表明它们是天蚕特有的序列，是天蚕特征序列。从这些核苷酸序列中选择一段序列作为引物或探针，具有很好的物种特征性，可用于天蚕的鉴定。因此，进一步的本发明人通过仔细分析和反复实验，在这三段核苷酸序列中寻找到合适的引物对，可以经PCR扩增获得条带清晰的扩增产物，继而用于鉴定天蚕品种，从而完成了本发明。一、由信息检索可知序列的天蚕特异性本发明人在研究7种绢丝昆虫-天蚕(Antheraea yamamai ；giant silkworm ；Japanese oak silkmoth)、 中国丰乍胃(Antheraea pernyi ；tussah ；Chinese oak silkmoth)、玻 白香(Antheraea assama ；muga silkworm)、蓖麻香(Samia Cynthia ；
eri-silkworm)、清新透目天香(Rhodinia newara)、柳香(Actias selene Hubner)-的 5
龄幼虫吐丝器官丝腺转录组的时候，将获得的该7物种的高质量转录组相互之间使用采用 blastp程序，并将家蚕基因集纳入分析，设置相似性cutoff为10-8进行相互比对，结果使用solar软件连接起来，将同源基因分类为单拷贝基因(blastp只有一个hit)和多拷贝基因(blastp有多个hit)。在这过程中筛选获得了在天蚕中特异，而在其物种中没有的基因片段，即作为鉴别天蚕的特征序列。这三段序列即序列表中SEQ ID NO. 1，SEQID NO. 2，和 SEQ ID NO. 3所示。在本领域，具有90%同源性的基因一般就被认为是同一个基因。二、野生天蚕资源分子鉴定的PCR试剂盒本发明提供一种快速检测天蚕的PCR试剂盒，包括1)DNA裂解液，2) 10倍PCR缓冲液，3)(1^1^溶液，4打39 DNA聚合酶，和5)引物对。其中，1) 4)可以是本领域常规的PCR试剂盒中的部件。5)引物对，则是本发明特别设计的。所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO. 1 (或者 SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3)所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID NO. 1(或者SEQ ID N0. 2，或者SEQID N0. 3)所示的序列互补，且扩增产物的长度为40 448bp。较佳的一个例子是，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一个如SEQ ID N0. 5所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID N0. 6所示，另一个如SEQ ID N0. 7所示；或者， 一个引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一个如SEQ ID N0. 9所示。在本发明的一优选方案中，正向引物和反向引物各3pmol，0. 2mMdNTPs, 1. 5U的 Taq 酶(Takara exTaq)。其中正向引物为 SEQ ID N0. 4, SEQID NO. 6，或者 SEQ ID Ν0· 8 所示的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID N0. 5, SEQ ID NO. 7，或者SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列。较佳的，所述的快速检测天蚕的PCR试剂盒还包括阳性对照。阳性对照较佳的是如SEQ ID N0. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示的序列的核苷酸片段。三、野生天蚕资源分子鉴定的方法本发明还提供一种野生天蚕资源分子鉴定的方法，包括以下步骤1)提取天蚕基因组DNA ；2)以提取的基因组DNA为模板，以本发明的引物对为引物，进行PCR扩增；3)将PCR产物进行琼脂糖电泳检测。其中，提取天蚕基因组DNA的方法采用本领域现有技术，可以从粪便、体表、血液中提取DNA。DNA提取可采用多种方法。较佳的用本发明试剂盒提供的裂解液裂解天蚕丝腺，从中提取DNA。步骤2)所述的PCR扩增条件可以是常规的PCR扩增条件，较佳的，PCR反应体系为模板 DNA 0. 016yg/y 1，dNTPs 各 0. 02mM，lXEx Buffer (含镁离子)，正向引物 0. 4μΜ，反向引物0. 4μΜ，Εχ taq 0. 04υ/μ 1。PCR反应程序较佳的为94°C预变性5分钟， 然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7分钟。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件 (例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1野生天蚕资源的分子鉴定对已经有的天蚕提取基因组DNA，可以从粪便、体表、血液中提取DNA，DNA提取可采用多种现有技术中的方法，此处不做特殊说明。采用表1中引物，引物组合对为引物1 和引物2、引物3和引物4、引物5和引物6。按照表2所述的体系进行PCR反应。实验中是使用了 TaKaRa Ex Taq HSPCR试剂盒进行PCR扩增。PCR扩增程序为94°C预变性5分钟，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7分钟。表1.鉴定天蚕的引物
权利要求
1.一种鉴定天蚕的遗传标记物，其特征在于，它的核苷酸序列是1)序列表中SEQID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的连续的20 483个碱基序列；或者2)和序列表中SEQID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的连续的 20 483个碱基序列的具有90%以上同源性的序列。
2.如权利要求1所述的遗传标记物，其特征在于，所述的遗传标记物是1)序列表中SEQID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸；或者2)和序列表中SEQID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列具有90%以上同源性的核苷酸。
3.一种鉴定天蚕的引物，其特征在于，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同或者互补。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述的引物为序列如SEQIDW).4所示，SEQ ID N0. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，或者 SEQ ID NO. 9 所示的核苷酸。
5.一种鉴定天蚕的试剂盒，其特征在于，其含有特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对， 所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID NO. 1, 或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互补，且扩增产物的长度为70 300bp。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物对中，一个引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一个如SEQ ID N0. 5所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID N0.6所示，另一个如SEQ ID N0. 7所示；或者，一个引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一个如SEQ ID N0. 9所示。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括1)DNA裂解液，2) PCR反应缓冲液，3) dNTP，4) Taq DNA聚合酶。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照，所述的阳性对照是如序列表中SEQ ID N0. 1，SEQ ID NO. 2，或SEQID NO. 3所示序列的核苷酸。
9.一种天蚕的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)抽提样品的DNA;(2)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增天蚕遗产标记物的引物对进行PCR扩增， 其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，且所述的引物对中，一个引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一个引物的序列与SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互补，且扩增产物的长度为70 300bp ；(3)检测扩增产物的存在，存在扩增产物就表示样品中存在来自天蚕的个体、器官、组织、细胞、基因组DNA或者存在如序列表中SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3所示序列中的连续的20-483个碱基序列的核苷酸。
10.一种如权利要求1所述的鉴定天蚕的遗传标记物的用途，用于鉴定天蚕，以能检测到样品中含有该遗传标记物或其片段，表示样品是天蚕。
全文摘要
本发明公开了一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒。具体的，本发明提供了3条天蚕特异性的核苷酸序列，是序列表中SEQID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列中的连续的20-483个碱基序列。本发明还提供了以该序列为基础设计的寡核苷酸引物，用这些引物快速特异性检测天蚕的方法，以及所用的试剂盒。在野生天蚕制种前，需要对收集的天蚕样品进行鉴定，使用本发明则可以方便、快速、准确的鉴定天蚕。
文档编号C12Q1/68GK102286626SQ201110253329
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者卢翌铭, 胡颂军, 董扬 申请人:湘潭市祂施尔生物科技有限公司