专利名称：一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种黑芥小孢子组织培养获得再生植株的培养方法。
背景技术：
单倍体是指仅携有配子染色体数目的个体，在作物育种实践和遗传育种理论研究中均具有重要意义。游离小孢子培养作为人工诱导单倍体的有效途径，具有实用性。在育种实践中，对单倍体进行染色体加倍当代就可以获得纯系即双单倍体群体，比采用传统的自交纯化方法省时约3-5年，大大提高育种效率，缩短了育种周期。在遗传育种理论研究中，双单倍体在遗传上具有绝对的纯合性，是进行AFLP、RFLP和SSR等分子标记、遗传图谱绘制及重要抗性基因定位研究的良好材料，也是进行物种进化研究、遗传分析和植物基因克隆筛选的理想材料。黑芥(Ara1S1Sica nigra, BB)是十字花科芸薹属3个基本种之一,多为野生分布。已有研究表明，黑芥所在的BB基因组中存在对黑腐病主要致病生理小种I和4的抗性，对根肿病的高抗性，以及对黑胫病的全生育期抗性。而向芸薹属蔬菜，特别是受这三种病害影响较为严重的甘蓝和白菜中转移这些优良抗性基因，将对培育多抗、优质蔬菜新品种具有重要意义。但目前黑芥的抗病研究只局限于对材料各种生育期的抗病性鉴定，进一步的分子生物学研究相对滞后，进展缓慢。特别是对相关遗传图谱的绘制及重要抗性基因的定位研究极少，原因之一是缺少遗传上纯合、表现型一致的研究群体，而小孢子培养技术为获得此群体提供了一条快捷、有效的途径。黑芥是十字花科作物中最不容易进行游离小孢子培养的材料之一，尽管在芸薹属很多作物中已实现通过小孢子培养成功获得单倍体。有关黑芥游离小孢子培养研究，目前国内还未见相关报道，国外也仅 见早期的一篇报道，并且其出胚率低，再生株获得数量很有限(Lichter 1989)。本研究通过对黑芥游离小孢子进行培养，并成功获得一定数量的双单倍体再生植株，为开展黑芥种质资源的遗传研究，建立高效简便的育种方法提供重要的理论与技术指导，同时为相关遗传图谱绘制、重要抗性基因定位及物种进化研究等提供良好的研究材料。
发明内容
本发明的目的是，针对黑芥是十字花科作物中不易进行游离小孢子培养，从而也难以获得遗传上纯合、表现型一致的双单倍体再生植株材料的缺陷，提供一种使能批量获得遗传上纯合、表现型一致双单倍体再生植株材料的黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，以建立黑芥小孢子培养再生体系，加快黑芥的育种进程与效率；同时可为黑芥遗传图谱绘制及抗性基因的精确定位、克隆和转基因等研究提供材料。本发明目的通过以下技术方案来实现。—种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，该方法按如下步骤进行(I)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的重量为
1)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飞.0，过滤灭菌；
2)胚状体分化培养基B5培养基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAP
O.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +琼脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高温灭菌；
3)萌发、生根培养基MS培养基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +琼脂8 g/L,pH 5. 8,高温灭菌；
(2)供体植株、花蕾的选择与预处理
O供体植株、花蕾的选择选择生长健康的黑芥作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在O. 7^1. O之间，处于单核中晚期的花蕾为供体花蕾；
2)花蕾灭菌先用纯净水清洗花蕾3次后，将其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐温20配成的灭菌液中，摇床按50-80 rpm轻微摇晃12分钟进行表面消毒后，再在超净台上用无菌水清洗4次，备用；
3)花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将灭菌后花蕾置于无菌烧杯中，加入ImL胚状体诱导培养基后用平头玻棒压碎花蕾、再加入9 mL相同培养基并搅成悬浮液；用40Mm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，IOOOrpm离心4分钟，弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1. O个花蕾所含的小孢子量后，再将该液中的培养基与由NLN-13液体培养基+ lg/L活性炭、经高温灭菌的活性炭混合液按体积O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子悬浮液；并分装于直径为6 cm的无菌培养皿中,加盖后用parafilm膜封口，备用； (3)小孢子胚状体的诱导培养将上述培养皿置于31-33°C培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25°C恒温培养箱中，暗培养15-20天至胚状体出现；再在25°C黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成；
(4)再生植株的分化与萌发培养将子叶胚状体平放于胚状体分化培养基上，25°C每天光照16小时培养15 20天至胚状体膨大并再生出新植株；
(5)再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，25°C每天光照16小时培养至生根；将生根再生植株移入由泥炭与珍珠岩按体积2 I配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25°C下培养I周；
(6)再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶，用德国Partec公司生产的partec PA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性。本发明的有益效果是1、本发明对黑芥的小孢子进行培养，能批量获得遗传上纯合、表现型一致的双单倍体再生植株材料，以建立黑芥小孢子培养再生体系，加快黑芥的育种进程与效率；同时可为黑芥遗传图谱绘制及抗性基因的精确定位、克隆和转基因等研究提供材料。2、本发明黑芥小孢子培养的出胚率，最高可达15个胚/蕾；
3、本发明胚状体的出苗率，平均达50%。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1 :(黑芥小孢子培养再生植株的方法I)(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的重量为
I)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130 g/L, pH 6.0，过滤灭菌(其中NLN-13培养基配方见表I) ; 2)胚状体分化培养基=B5培养基+ ZT 1.5 mg/L + NAA
O.05 mg/L + BAP O. 8 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂 7 g/L, pH 6. 0，高温灭菌，(其中 B5 培养基配方见表I);
3)萌发、生根培养基MS培养基+ NAA O. 08 mg/L +蔗糖30 g/L +琼脂7g/L，pH
5.8，高温灭菌(其中MS培养基配方见表I)；
表i Xm-13、B;和MS培养基配方
权利要求
1. 一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，其特征在于按如下步骤进行 (I)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的重量为 1)胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飞.0，过滤灭菌； 2)胚状体分化培养基B5培养基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAPO.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +琼脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高温灭菌； 3)萌发、生根培养基MS培养基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +琼脂8 g/L,pH 5. 8,高温灭菌； (2)供体植株、花蕾的选择与预处理 O供体植株、花蕾的选择选择生长健康的黑芥作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在O. 7^1. O之间，处于单核中晚期的花蕾为供体花蕾； 2)花蕾灭菌先用纯净水清洗花蕾3次后，将其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐温20配成的灭菌液中，摇床按50-80 rpm轻微摇晃12分钟进行表面消毒后，再在超净台上用无菌水清洗4次，备用； 3)花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将灭菌后花蕾置于无菌烧杯中，加入ImL胚状体诱导培养基后用平头玻棒压碎花蕾、再加入9 mL相同培养基并搅成悬浮液；用40Mm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，IOOOrpm离心4分钟，弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1. O个花蕾所含的小孢子量后，再将该液中的培养基与由NLN-13液体培养基+ lg/L活性炭、经高温灭菌的活性炭混合液按体积O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子悬浮液；并分装于直径为6 cm的无菌培养皿中,加盖后用parafilm膜封口，备用； (3)小孢子胚状体的诱导培养将上述培养皿置于31-33°C培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25°C恒温培养箱中，暗培养15-20天至胚状体出现；再在25°C黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成； (4)再生植株的分化与萌发培养将子叶胚状体平放于胚状体分化培养基上，25°C每天光照16小时培养15 20天至胚状体膨大并再生出新植株； (5)再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，25°C每天光照16小时培养至生根；将生根再生植株移入由泥炭与珍珠岩按体积2 1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25 °C下培养I周； (6)再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶，用德国Partec公司生产的partec PA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性。
全文摘要
本发明公开了一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。方法包括(1)培养基的配制；(2)供体植株、花蕾的选择与预处理；(3)小孢子胚状体的诱导培养；(4)再生植株的分化与萌发培养；(5)再生植株的生根培养与移栽；(6)再生植株的倍性检测等步骤。本发明对黑芥的小孢子进行培养，其出胚率最高达15个胚/蕾，出苗率平均达50%，能批量获得遗传上纯合、表现型一致的双单倍体再生植株材料。本发明可在黑芥育种、遗传图谱、抗性基因定位、克隆及转基因等研究领域中推广应用。
文档编号A01H4/00GK103053424SQ20131001392
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者盛小光, 顾宏辉, 虞慧芳, 赵振卿, 王建升, 许映君 申请人:浙江省农业科学院