专利名称：一种青花菜小孢子再生植株的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种青花菜小孢子再生植株的培养方法。
背景技术：
青花菜(B rassica oleracea L var. italica)又名西兰花、绿菜花、茎椰菜等， 是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品器官的一、二生草本植物，其以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。目前，我国青花菜主栽品种大部分都来自国外，具有我们自主知识产权的品种匮乏，究其原因是因为我们自己的青花菜育种资源很少，配制不出好的材料，因此迫切需要通过育种的手段，把市场上应用的品种进行多年自交分离。传统的多代自交分离的方法一般需要 5 6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料，但其表现是否优良、能否与其它材料组配，以及配制出来的杂交种表现能否得到育种家们的认可还不得而知，这又需要6 8年的时间。小孢子培养方法可以在1 2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了 3 4年的时间，从而大大缩短了育种进程，提高了育种的效率。自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物，尤其是油菜的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量，还是胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。相对于甘蓝型油菜、结球甘蓝等作物，青花菜游离小孢子的培养难度较大。国外研究最早见于1991年Takahata等人的报道，国内则是张德双等于1997年在巴绿青花菜等品种的研究上获得成功。随后，张延国等(中国蔬菜，2005(6) :7 9)、方淑桂等(福建农林大学学报(自然科学版)，2005，34(1) :51 55)、袁素霞(中国农业科学， 2009,42(1) :189 197)等人也有报道，但青花菜小孢子胚胎发生的效率普遍不高，对难出胚的品种来说，效果很不理想。申请号为200910101722. 5的中国发明专利申请中公开了一种青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，主要涉及改变常规培养基成分和培养方法，以提高青花菜植株的二倍体率。有关芸薹属游离小孢子培养的大量研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量 (Chuong et al.，1988)，抑制了小孢子培养育种技术的应用。因此，寻找一种提高青花菜出胚率的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，采用高出胚率的油菜品种和低出胚率的青花菜品种混合培养，得到低出胚率的青花菜小孢子苗，提高青花菜小孢子培养出胚率。一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤1)取青花菜的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；
2)将灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液， 过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液， 得到小孢子混合悬浮液；3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32°C 33°C恒温热激处理1天 3天，后取出在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天，得到子叶期胚状体；4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。为了达到更好的效果，优选所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0. 7 1. 2、单核晚期至双核早期的花
O诱导后的花蕾也更利于小孢子的培养，所述的诱导的条件为在；TC 6°C诱导 0. 1小时 48小时。所述的油菜和青花菜混合花蕾中油菜花蕾与青花菜花蕾的用量一般不做特别的限定，为了达到更好的效果，进一步优选油菜花蕾的数量略大于青花菜花蕾的数量。步骤2、中，所述的灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用灭菌液将油菜和青花菜混合花蕾灭菌15 20分钟，清洗干净后得到灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾。一般用于外植体灭菌的灭菌液有升汞溶液、次氯酸钠溶液等，由于升汞溶液有很大的毒性，且污染环境，对人体有害；而次氯酸钠灭菌的效果较好，没有毒害，所述的灭菌液优选次氯酸钠溶液。以IL次氯酸钠溶液计，组成为质量百分浓度为5. 6%的次氯酸钠水溶液56ml、无水乙醇100ml、洗洁精8滴 10滴和余量的无菌水。所述的NLN-13诱导培养基为由NLN液体培养基IL和蔗糖130g组成，pH 6. 0 6. 2 ；高温高湿灭菌，备用。所述的活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2g_5g和Ig活性炭；高温灭菌，备用。所述的NLN 液体培养基，以 IL 计，组成为KN03125mg，Ca (NO3) 2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，维生素 BIO. 5mg，维生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,叶酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸IOOmg和余量的无菌水。所述的沉淀可以重复以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液。重复操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。所述的小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0. 8X IO5个/mL 1. 2X IO5个/mL。所述的过滤可采用45 μ m无菌滤网。所述的离心的条件一般为600rpm/min 900rpm/min离心3min 5min。步骤3)中，在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天的具体步骤为在黑暗条件下于25士2°C培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25士2°C条件下摇动培养；摇动培养相对于不摇动培养的小孢子胚生长的较健壮。步骤4)中，所述的培养条件为每天12小时 18小时光照和20°C 下培养；进一步优选为每天16小时光照和25°C下培养。一般培养时间为2周 3周。所述的胚状体较大时可切成多块后接种。所述的胚状体分化培养基为由MS培养基1L、蔗糖20g和琼脂IOg 12g组成， pH5. 8 6. 1 ；高温高湿灭菌。步骤5)中，所述的生根培养基为由MS培养基1L、糖20g 30g和琼脂6g 7g 组成，pH5. 6 6. 0 ；所述的糖为蔗糖或白糖；高温高湿灭菌。所述的MS 培养基，以 IL 计，组成为:NH4H031650mg, KN031900mg, CaCl2 · 2H20 440mg, KH2PO4170mg, MgSO4 · 7H20 370mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3B036 . 2mg, MnSO4 · H2O 16. 9mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 83mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,烟酸 0. 5mg,维生素 BIO. lmg,维生素B60. 5mg和余量的无菌水。移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，用质量百分浓度为75% 80%的百菌清 (如市售的百菌清可湿性粉剂)800 1000倍(稀释的倍数)液浸泡组培苗根部1 2分钟后植于青花菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养15 20天后移栽。通过百菌清来杀菌，并给予一定的缓冲环境，以更好的使在生长环境较好的实验室里生长的组培苗适应较严酷的自然环境。所述的鉴定可采用本领域常用的倍性鉴定方法，如取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性，并从再生植株群体中鉴定出油菜再生苗和青花菜再生苗。可用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞仪进行倍性分析和再生植株种类的鉴定。本发明的有益效果为1、本发明针对现有青花菜小孢子培养出胚率低，尤其是非常难以出胚的品种，提供了一种提高出胚率的方法，采用易出胚的油菜品种和难出胚的青花菜花蕾混合培养的方法，以易出胚的材料带动难出胚的材料出胚，提高青花菜的出胚率。本发明方法混合培养青花菜出胚率最高达138个/蕾，而对照青花菜出胚率最高仅为2个/蕾，解决了青花菜小孢子培养胚胎发生频率较低的问题，提高了小孢子培养技术的利用效率。2、经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，在相同的条件下混合培养最后得到14株青花菜小孢子苗，而青花菜花蕾单独培养的对照株数为0株。
具体实施例方式实施例1培养方法按如下步骤进行。(1)培养基配制包括小孢子不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培养基中所含的重量为表INLN和MS培养基配方表
权利要求
1.一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤1)取青花菜的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；2)将灭菌后的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32°C 33°C恒温热激处理1天 3天，后取出在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天，得到子叶期胚状体；4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。
2.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1)中， 所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0. 7 1. 2、单核晚期至双核早期的花蕾。
3.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1)中， 所述的诱导的条件为在3°C 6°C诱导0. 1小时 48小时。
4.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中， 所述的NLN-13诱导培养基为由NLN液体培养基IL和蔗糖130g组成，pH 6. 0 6. 2 ；所述的活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2g-5g和Ig活性炭；所述的NLN液体培养基，以IL计，组成为KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，维生素 BIO. 5mg，维生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,叶酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸IOOmg和余量的无菌水。
5.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中， 所述的沉淀重复以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液。
6.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2)中， 所述的小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0. 8X IO5个/mL 1. 2X IO5个/mL。
7.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤3)中， 在黑暗条件下于25 士 2°C培养20天 30天的具体步骤为在黑暗条件下于25 士 2°C培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25士2°C条件下摇动培养。
8.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4)中， 所述的培养条件为每天12小时 18小时光照和20°C 下培养。
9.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4)中， 所述的胚状体分化培养基为由MS培养基1L、蔗糖20g和琼脂IOg 12g组成，pH5. 8 6. 1。
10.根据权利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤5)中，所述的生根培养基为由MS培养基1L、糖20g 30g和琼脂6g 7g组成，pH5. 6 6.0;所述的糖为蔗糖或白糖。
全文摘要
本发明公开了一种青花菜小孢子再生植株的培养方法，包括取青花菜和油菜的花序，直接或诱导后取花序上的花蕾，灭菌后加入NLN-13诱导培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子悬浮液；经热激处理后培养，得到子叶期胚状体；接种至胚状体分化培养基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性，并从再生植株群体中鉴定出油菜再生苗和青花菜再生苗。该方法将易出胚的油菜与难出胚的青花菜品种混合培养，以易出胚的材料带动难出胚的材料出胚，提高青花菜的出胚率。
文档编号A01H4/00GK102239803SQ20111011253
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者周伟军, 庄义庆, 张振超, 耿鑫鑫, 许玲 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所, 浙江大学