一种获得萝卜单倍体的育种方法

专利名称：一种获得萝卜单倍体的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种利用游离小孢子培养技术快速获得萝卜单倍体的育种方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术：
游离小孢子培养是作物产生单倍体的有效途径之一，单倍体自发或人工诱导加倍形成的加倍单倍 体(DH)群体对于作物遗传和分子育种等研究有着重要的作用(Oleszczuk, S.; Sowa， S.; Zimny, J.Direct embryogenesis and green plant regeneration from isolated microspores of hexaploid triticale(xTriticosecale Wittmack) cv. Bogo. Plant Cell Rep, 22:885-893;2004)。 ( 1 )利用小孢子培养获得的单倍体植株染色体加 倍，可以在一个世代就获得性状稳定的纯合体，大大縮短亲本纯合的时间,加快育种进程,提高所需基因 组合的选择效率。此外，利用杂交种进行小孢子培养，可以快速分离Fi中的有利基因，并快速获 得它的自交系。(2)外源基因导入的良好受体。从一个小孢子到一个幼龄的小孢子植株，都可以作为 外源基因转化和转导的较佳受体，经转化和转导的单倍体细胞，通过染色体自发或秋水仙碱等处理加 倍后可直接获得纯合二倍体转化株。(3)良好的诱变对象。以小孢子作为诱变对象的小孢子诱变，诱 变后通过染色体加倍的处理，无论显性还是隐性突变，都将在当代显现其表现型，易于选择和鉴定。 萝卜是典型的异花授粉作物，由于它的自交不亲和性和其它的物理屏障很难甚至不可能通过自交得到 萝卜的纯合体。因此，利用游离小孢子培养获得纯合的DH群体用于选育萝卜优良新品种似乎是唯一 可行的首选方法。
萝卜是十字花科作物中最不容易进行游离小孢子培养的材料之一，尽管在芸苔属很多作物中已实 现通过小孢子培养成功获得单倍体。有关萝卜游离小孢子培养研究，目前国内外仅见极少报道。总体看 来，集中表现出来的问题就是萝卜游离小孢子培养研究中出胚率较低，再生株获得数量有限(Takahata, Y.; Komatsu， Hisashi.; Kaizuma， Norihiko. Microspore culture of radish (i op/;朋w5 5<2fZvt \L):influence of genotype and culture conditions on embryogenesis. Plant Cell Report, 16:163 166; 1996; 周志国，龚义勤， 王晓武，柳李旺，张延国.不同萝卜品种游离小孢子的诱导及培养体系优化研究.西北植物学报，2007， 27 (1) :0033 0038)。本研究通过对萝卜游离小孢子进行培养，并成功获得一定数量的单倍体再生 植株，为开展萝卜种质资源的遗传研究，建立高效简便的育种方法，縮短育种年限，快速培育优良的 萝卜新品种提供了重要的理论与技术指导。

发明内容
技术问题
本发明的目的是提出一种快速获得萝卜单倍体的育种方法，从热激、花粉发育时期、不同培养基及其添加物质等几个方面对萝卜小孢子进行培养，获得再生植株，并通过鉴定为单倍体。建立了萝卜 游离小孢子培养高频再生技术体系，获得萝卜单倍体再生植株，染色体加倍后可以用于萝卜遗传育种。 技术方案
快速获得萝卜单倍体的育种方法，包括以下步骤
1) 小孢子的培养
从萝卜供体植株上挑选1.5 5.0mm的花蕾，选取瓣药比即花瓣长度/花药长度等长或花瓣微短于 花药的花蕾，用体积比75X酒精消毒60s,然后再用质量比8。/。的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌 水冲洗3次，将花蕾置于已灭菌研钵中，以B5-13液体培养基为洗液，采用挤压法游离小孢子，以400 目尼龙网过滤，并将悬浮液收集于离心管，1500rmin"离心5min，弃上清液，再加入4ml洗液离心， 重复3次，弃上清液后加入NLN-13液体培养基，调整小孢子密度达2Xl()S个/ml，分装于60xl5mm 培养皿中，添加活性炭终浓度为0.75g/ L，利用Parafilm膜封口 ，于32.5'C恒温培养箱热激处理48h， 然后于25'C条件下静止黑暗培养2-3周，获得子叶型胚状体；
2) 胚状体的萌发与植株再生
将子叶型胚状体转移到25°C、 4000Lx、 16bd—1的光照下培养5 7d，待胚状体转绿后接到继代培 养基上萌发、继代培养，继代培养基质量比为Bs+蔗糖3%+琼脂1.0%+6-BA0.2mg/L+NAA0.02 mg/L+活性炭0.lX， pH5.8;
经过3-4次继代无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，生根培养基质量比为85+蔗糖3% +琼脂0.8%+NAA0.2mg/L， pH5.8;
将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到浇透水的装有灭菌基质泥炭、营养土和蛭石的比例 为2:1:1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，相对湿度皿=85%，将营养钵放于光照培养箱中，保持25'C， 12h光照和12h黑暗的条件，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田； 4)再生植株倍性鉴定
利用根尖细胞染色体计数法鉴定取再生植株根尖于10ml离心管，经冰水混合物预处理24h,无 水乙醇冰醋酸=3: 1的卡诺固定液固定24 h，蒸馏水冲洗3次，再用1 mol /LHC1于60'C水浴锅中 解离6 7min，经解离后的材料用蒸馏水充分清洗，卡宝品红染色，压片、镜检，Nikon显微镜观察 并摄影，确定获得染色体!1=1=9的单倍体植株(对照二倍体植株染色体数目2n=2x=18);
或利用流式细胞仪鉴定称取100mg试管苗嫩茎或幼叶，在滴有2ml提取液(15mmo1 Tris-HCl， pH 7.5， 8Ommo1 L-1KC1, 20mmo1 . L-lNaCl， 20mmo1 L-lEDTA-Na-2，15m mol L-l巯基乙醇，体积 比0.05。/。的TritonX-100)的培养皿中剪碎，260目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，重复漂洗3次，离 心后弃上清液，收集沉淀细胞加入2ml染色缓冲液，在4'C黑暗条件下染色30min，用标准管收集样随 即利用流式细胞仪(American Beckman Co.)进行倍性测定，根据DNA相对含量为100 (二倍体植株DNA相对含量200为对照)，证实获得萝卜单倍体植株。 有益效果
本发明研究表明，32.5'C热激48h对于小孢子启动分裂非常必要，未经32.5'C热激处理的小孢子， 在所有基因型中均未诱导出胚状体。NLN-13液体培养基最有利于萝卜游离小孢子培养，培养基中大 量元素的减半与否不是影响萝卜出胚率的主要因素。NLN-13液体培养基中添加0.75g/L的活性炭有助 于提高胚状体的产量和质量。利用瓣药比(花瓣长度/花药长度)可以准确的判断小孢子的发育时期， 瓣药等长或花瓣微短于花药的花蕾最适于进行小孢子培养。
本发明的特点是采用简便的培养方式，从热激、花粉发育时期、不同培养基及其添加物质等方 面建立起萝卜小孢子高效培养体系，使小孢子的胚状体诱导率提高到17.03个/105，同时扩大了基因型 的范围；对萝卜小孢子的再生植株倍性利用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定，证实成功获得一 定数量的萝卜单倍体再生植株。
应用前景利用萝卜小孢子培养获得的单倍体加倍，可以在一个世代就获得性状稳定的纯合体，* 大縮短亲本纯合的时间,加快育种进程,提高所需基因组合的选择效率。此外，利用F^才料进行小孢子培 养，能够快速分离Fi中的有利基因，将获得的有利基因的单倍体加倍，可以快速获得它的自交系，有 效用于萝卜杂交育种选育优良新品种。


图l.萝卜游离小孢子的胚胎发生与植株再生.
(A)单核靠边期的小孢子。Bar=10nm。 (B)花蕾中游离出来的小孢子。Bar=35 nm。 (C)膨大的 小孢子。Bar=20nm。 (D)球形胚。Bar= 150 Mm。 (E)心型胚。Bai=200 pm。 (F)鱼雷型胚。Bar=200 ^m。 (G)子叶型胚。Bai=200 nm。 (H)转到继代培养基上的子叶胚。Bar=l. 5 cm。 (I)再生植株 生根。BaF4cm。 (J)再生株的根尖染色体(n=x=9) 。 Bai=2 pm。 (K)再生株的根尖染色体(2n=2x=18)。 Bar=2pm。 (L)再生株的根尖染色体(4n=4x=36) 。 Bar=2 nm。 图2.利用流式细胞仪鉴定再生植株的倍性(a，b和c)
(a)小孢子单倍体再生植株。(b)小孢子双单倍体再生植株。(c)小孢子四倍体再生植株。D和E两峰 分别代表G〖和G2时期。
具体实施方式
(1) 小孢子的培养
从萝卜材料NAU-xxxs-03 (王玮,柳李旺,龚义勤,等.萝卜肉质根膨大过程中碳水化合物与蔗糖代谢 相关酶活性分析.园艺学报，2007， 34(5): 1313-1316)供体植株上挑选大约1.5 5.0mm左右的花蕾，
利用瓣药比(花瓣长度/花药长度)，选取瓣药比等长或花瓣微短于花药的花蕾，花蕾用75%酒精消毒60s，然后再用8%的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗3次。将花蕾置于已灭菌研钵中，以 添加质量比0.015%Ca2+ 、 pH为5.8的B5-13液体培养基(85+13%蔗糖，B5培养基见Gamborg, O丄.； Miller, R.A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.Exp Cell Res.50:151-158;1968)为洗液，采用挤压法游离小孢子。以400目尼龙网过滤，并将悬浮液收集于离 心管，1500rmin—1离心5min，弃上清液，再加入4ml洗液离心，重复3次。弃上清液后加入NLN-13 液体培养基(NLN +13%蔗糖，NLN培养基见Lichter, R. Induction of haploid plants from isolated pollen of 5rasWca Twpwj L. Z Pflanzenphysiol,105:427 434;1982)，调整小孢子浓度达2X 105个/ml，分装于60 xl5mm培养皿中，添加活性炭终浓度为0.75g/L，利用Parafilm膜封口 ，于32.5'C恒温培养箱热激处 理48h，然后于25。C条件下静止黑暗培养2-3周，利用倒置显微镜观察小孢子的发育过程，得到子叶 型胚状体。
(2) 胚状体的萌发与植株再生
将子叶型胚状体转移到25'C、 4000Lx、 16h'd—1的光照下培养5 7d，待胚状体转绿后接到培养基 Bs +蔗糖3%+琼脂1.0%+6-BA0.2mg/L +NAA0.02 mg/L+活性炭0.1%, pH5.8上萌发、继代培养。 经过3-4次继代无根试管苗转移到培养基Bs+蔗糖3% +琼脂0.8% +NAA0.2 mg/L，pH5.8中生根培 养。
将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到浇透水的装有灭菌基质泥炭、营养土和蛭石的体积 比为2:1:1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，相对湿度1111=85%，将营养钵放于光照培养箱中，保持25 'C， 12h光照和12h黑暗的条件，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田；
(3) 再生植株倍性鉴定
利用根尖细胞染色体计数法和流式细胞仪，鉴定再生植株倍性。取再生植株根尖于10ml离心管， 经冰水混合物预处理24h后。卡诺固定液(无水乙醇冰醋酸=3: 1, V/V)固定24h，蒸馏水冲洗3 次，再用lmol/LHCl于6(TC水浴锅中解离6 7min，经解离后的材料用蒸馏水充分清洗，卡宝品红 染色，压片、镜检(段永红,李素清,牛西午,孙毅.锦鸡儿属植物4个种的核型分析.武汉植物学研 究.2006,24(5):413 417)， Nikon显微镜观察并摄影，确定获得染色体n=x=9的单倍体植株(对照二倍 体植株染色体数目2n=2x=18)。
或利用流式细胞仪鉴定称取100mg试管苗嫩茎或幼叶，在滴有2ml提取液(15mmo1 Tris-HCl， pH 7.5, 80m mol L-lKCl, 20m mol L-lNaCl, 20m mol . L-IEDTA-Na-2，15m mol L-l巯基乙醇，体积 比0.05。/。TritonX-100)的培养皿中剪碎，260目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，重复漂洗3次，离心 后弃上清液，收集沉淀细胞加入2ml染色缓冲液(RNase: PI=1:25, V/V，张振超,张蜀宁,张伟,张红亮. 四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定.西北植物学报，2007，27(l):0028-0032)，在4'C黑暗条件下染色30min，用标准管收集样随即利用流式细胞仪(American Beckman Co.)进行倍性测定，根据DNA 相对含量为100 (二倍体植株DNA相对含量200为对照)，证实获得萝卜单倍体植株。利用上述方法本发 明还在一些其他萝卜品种中成功得到单倍体植株。
应用前景利用萝卜进行小孢子培养获得的单倍体植株染色体加倍，可以在一个世代就获得性状 稳定的纯合体，大大缩短亲本纯合的时间,加快育种进程,提高所需基因组合的选择效率。此外，利用萝 卜Fi代杂交种进行小孢子培养，能够快速分离Fi中的有利基因，将获得的有利基因的单倍体加倍，可 以快速获得它的自交系，有效用于萝卜杂交育种选育优良新品种，对于生产实践具有广泛的指导意义 与切实可行性。
权利要求
1.一种获得萝卜单倍体的育种方法，包括以下步骤1)小孢子的培养从萝卜供体植株上挑选1.5～5.0mm的花蕾，选取瓣药比即花瓣长度/花药长度等长或花瓣微短于花药的花蕾，用体积比75％酒精消毒60s，然后再用质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗3次，将花蕾置于已灭菌研钵中，添加质量比0.015％Ca2+、pH为5.8的B5-13液体培养基为洗液，采用挤压法游离小孢子，以400目尼龙网过滤，并将悬浮液收集于离心管，1500r·min-1离心5min，弃上清液，再加入4ml洗液离心，重复3次，弃上清液后加入NLN-13液体培养基，调整小孢子浓度达2×105个/ml，分装于60×15mm培养皿中，添加活性炭终浓度为0.75g/L，利用Parafilm膜封口，于32.5℃恒温培养箱热激处理48h，然后于25℃条件下静止黑暗培养2-3周，获得子叶型胚状体；2)胚状体的萌发与植株再生将子叶型胚状体转移到25℃、4000Lx、16h·d-1的光照下培养5～7d，待胚状体转绿后接到继代培养基上萌发、继代培养，继代培养基质量比为B5+蔗糖3％+琼脂1.0％+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+活性炭0.1％，pH5.8；经过3-4次继代无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，生根培养基质量比为B5+蔗糖3％+琼脂0.8％+NAA0.2mg/L，pH5.8；将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到浇透水的装有灭菌基质泥炭、营养土和蛭石的体积比为2∶1∶1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，相对湿度RH＝85％，将营养钵放于光照培养箱中，保持25℃，12h光照和12h黑暗的条件，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田；3)再生植株倍性鉴定利用根尖细胞染色体计数法鉴定取再生植株根尖于10ml离心管，经冰水混合物预处理24h，无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1的卡诺固定液固定24h，蒸馏水冲洗3次，再用1mol/L HCl于60℃水浴锅中解离6～7min，经解离后的材料用蒸馏水充分清洗，卡宝品红染色，压片、镜检，Nikon显微镜观察并摄影，确定获得染色体n＝x＝9的为单倍体植株，对照二倍体植株染色体数目2n＝2x＝18；或利用流式细胞仪鉴定称取100mg试管苗嫩茎或幼叶，在滴有2ml提取液的培养皿中剪碎，提取液为15m mol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，80m mol ·L-1KCl，20m mol·L-1NaCl，20m mol·L-1EDTA-Na-2，15mmol·L-1巯基乙醇，体积比0.05％的TritonX-100；260目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，重复漂洗3次，离心后弃上清液，收集沉淀细胞加入2ml RNase和PI体积比为1∶25的染色缓冲液，在4℃黑暗条件下染色30min，用标准管收集样随即利用流式细胞仪进行倍性测定，测得DNA相对含量为100相对于对照二倍体植株DNA相对含量为200，证实获得萝卜单倍体植株。
全文摘要
本发明公开了一种快速获得萝卜单倍体的育种方法，属于植物遗传育种领域。包括32.5℃恒温培养箱热激处理48h的小孢子培养获得子叶型胚状体，25℃、4000Lx、16h·d^-1的光照下培养5～7d，待胚状体转绿后接到继代培养基、生根培养基上萌发与植株再生，再利用根尖细胞染色体计数法或利用流式细胞仪进行再生植株倍性鉴定。通过本发明方法成功获得萝卜单倍体再生植株，使小孢子的胚状体诱导率提高到17.03个/10⁵。本发明利用小孢子培养方法获得中国萝卜的单倍体植株，染色体加倍后得到纯合自交系，可用于萝卜遗传改良与新品种选育。
文档编号C12N5/04GK101283674SQ20081012389
公开日2008年10月15日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者周治国, 张翠萍, 柳李旺, 赵艳玲, 龚义勤 申请人:南京农业大学