一种玉米单倍体幼胚加倍的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玉米单倍体幼胚加倍的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是一种利用杂种优势的模式作物，其中最为关键的环节是纯系选育。常规的 玉米自交系的选育需要经过多代的自交选择，因此选育一个品种往往需要数年的时间；而 且理论上讲，即使自交n(n〇cTO)代，基因型也不能达到100%的完全纯合状态。利用孤雌 生殖诱导系诱导产生单倍体并进行人工加倍，只需两代就可以得到100%纯合的自交系，与 常规方法相比不仅大大缩短育种进程，而且节约大量的人力、物力和财力。
[0003] 单倍体加倍常用的方法有自然加倍和化学加倍。自然加倍的频率往往比较低，而 且易受环境和基因型的影响，远远不能满足单倍体育种技术规模化应用的需求。化学加倍 是目前最常用的单倍体加倍方法，加倍试剂一般是可以抑制细胞有丝分裂过程中纺锤丝的 形成，从而使复制的染色体不发生分离，形成染色体加倍的细胞。
[0004] 近年来，国内外对加倍技术进行了大量研究，取得了较大进展。目前主要存在以下 缺点：（1)单倍体的加倍依然不够高效，尤其是雄穗的加倍；（2)单倍体挑选依赖于诱导系 的颜色，由于颜色表达是逐步积累的过程，为了能够准确的挑选，需要在较晚的发育时期挑 选，但在发育晚期胚胎已处于较高的发育阶段又不利于加倍，因此需高浓度的药剂进行加 倍，以保证加倍效率，药剂的处理浓度高，不仅消耗的药剂多，而且对幼苗、处理人员身体及 环境均有伤害。因此探索一种快速、高效、低毒的玉米单倍体加倍方法对玉米育种具有重要 意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种玉米单倍体幼胚加倍的方法。
[0006] 本发明提供的玉米单倍体幼胚加倍的方法包括如下步骤：将玉米单倍体幼胚在含 有浓度为〇. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷的体系中进行加倍，实现玉米单倍体幼胚的加倍。
[0007] 上述方法中，所述甲基胺草磷在所述体系中的浓度为0. 5ymol/L或1. 0ymol/L。
[0008] 上述方法中，所述含有浓度为0. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷的体系为含有甲基 胺草磷的MS培养基；
[0009] 所述含有甲基胺草磷的MS培养基按照如下方法制备：将甲基胺草磷、MS盐、蔗糖、 吐温80、二甲基亚砜和水混匀，得到含有甲基胺草磷的MS培养基；
[0010] 所述MS盐在所述含有甲基胺草磷的MS培养基中的浓度为3.Og/L;
[0011] 所述蔗糖在所述含有甲基胺草磷的MS培养基中的浓度为30g/L;
[0012] 所述吐温80在所述含有甲基胺草磷的MS培养基中的质量分数为0. 1% ;
[0013] 所述二甲基亚砜在所述含有甲基胺草磷的MS培养基中的质量分数为2 %。
[0014] 上述方法中，所述玉米幼胚的长为2. 0-3. 0mm。
[0015] 上述方法中，所述加倍的方式为将玉米单倍体幼胚放至甲基胺草磷的体系上培 养。
[0016] 上述方法中，所述培养的条件为28 °C黑暗培养72h。
[0017] 上述方法中，所述玉米单倍体幼胚按照如下方法获得：
[0018] (1)用玉米单倍体诱导系作为父本和母本杂交，得到杂交子代；
[0019] (2)从所述杂交子代的幼胚中选取玉米单倍体幼胚。
[0020] 上述方法中，所述母本为郑单958 ;所述父本为荧光诱导系CAUyfp。
[0021] 本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
[0022] 本发明提供了上述方法在培育玉米单倍体加倍植株中的应用。
[0023] 本发明还提供了上述方法在提高玉米单倍体加倍植株的雄穗散粉率中的应用。
[0024] 本发明将单倍体诱导系授粉12天后得到的玉米幼胚转移至含有加倍药剂（甲 基胺草磷）的MS培养基中进行加倍处理，培养，得到单倍体植株。通过实验证明：浓度为 0. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷处理单倍体幼胚，可以显著地提高玉米单倍体的加倍效率， 雄穗散粉率近30 %，远远高于本实验中作为对照的处理方法或自然恢复的雄穗散粉率（一 般为5%以下），实现了不依赖于颜色挑选的玉米单倍体的早期加倍。由于早期胚胎分化处 于较早的阶段，结合茎尖分生组织分化发育的一般规律，相比于晚期加倍，在早期每加倍一 个单倍体细胞，则可能分化为更大的二倍体组织，有助于开发低浓度的加倍处理方法，不仅 可节约药品，减少环境污染，而且大大节约时间，有助于实现周年多轮生产，另外本发明的 方法对环境污染及幼苗伤害都较小，植株生长较好，为解决单倍体育种过程中自然加倍效 率低、秋水仙素加倍毒性大等技术难题提供了一个可行的方案，使单倍体育种技术的大规 模应用途径更加多样化。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 1、玉米材料的准备
[0028] 2013年5月中旬于北京上庄中国农业大学实验基地种植郑单958(共十行）， 作为母本材料；种植焚光诱导系CAUYFP两行，作为父本材料。其中，玉米（Zeamays L.)杂交种郑单958是北京思农种业有限公司的产品，执行标准：GB4404. 1-2008 ; 焚光诱导系CAUYFP在文献"ZhaoX，XuX，etal.Fertilizationanduniparental chromosomeeliminationduringcrosseswithmaizehaploidinducers[J].Plant physiology, 2013, 163(2) : 721-731. "中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0029] 2、组织培养材料的准备
[0030] MS培养基的制备方法：每升MS培养基中含有MS盐（MS盐是上海宇涵生物科技有 限公司的产品，产品目录号140225) 3. 0g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至5. 8， 倒入三角瓶中，加7. 5g琼脂。
[0031] 含加倍药剂的MS培养基的制备方法：向MS培养基中添加适量的加倍药剂及助剂 (吐温和二甲基亚砜），混匀，得到含加倍药剂的MS培养基。其中，加倍药剂：甲基胺草磷 (APM)是sigma公司的产品，产品目录号为Sigma03992 ;吐温80 :单独灭菌后加入或直接加 入培养基灭菌均可；二甲基亚砜（DMS0):过滤除菌后加入。
[0032] 实施例1、玉米单倍体幼胚加倍的方法
[0033] ( -）从成苗率筛选玉米单倍体幼胚加倍的最佳加倍试剂浓度
[0034] 一、杂交子代幼胚的获得
[0035] 1、杂交
[0036] (1)杂交亲本
[0037] 以郑单958为母本，荧光诱导系CAUYFP为父本，杂交，得到杂交子代。
[0038] (2)杂交具体方法
[0039] 待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；花丝吐出后，同一时间剪花 丝，第二天统一授粉，授粉后12天左右，得到胚长为2. 0-3. 0_的杂交子代；
[0040] 同时将郑单958自交1代作为荧光观察的对照子代。
[0041] 2、拟单倍体幼胚的获得
[0042] 取胚长为2. 0-3. 0_的杂交子代和对照子代的幼穗，第二天剥胚（幼穗取回后可 暂放于4°C，但不宜太久）。具体步骤如下：将干净无虫害的幼穗去除苞叶，摘去花丝，75% 酒精短暂消毒后放入超净工作台。置于事先准备好的次氯酸钠溶液（利用灭菌去离子水配 制2 %次氯酸钠溶液，滴加两滴吐温80)中进行表面消毒20min。期间将玉米搅动2-3次， 消毒更彻底。消毒完成后拿出，放置片刻，控水后即可开始剥胚，得到杂交子代幼胚和对照 子代幼胚，所剥取的玉米幼胚，具有一片较大的子叶，即盾片，呈弧形隆起；近轴侧，面平，有 较小的胚体，由胚芽、胚轴、胚根组成。
[0043] 杂交子代中有杂合二倍体形式也有单倍体形式。
[0044] 将杂交子代幼胚和对照子代幼胚整齐摆放于MS培养基上，注意胚面朝下，紧贴MS 培养基。每个培养皿放7x7或者8x8方阵，便于逐个进行荧光观察，选取拟单倍体幼胚，并 做标记。
[0045] 拟单倍体幼胚的筛选方法如下：利用体式荧光显微镜（OLYMPUSDP72)(目镜1. 0 倍，分辨率1360x1024,ISO(相机感光度）定为200,曝光时间100ms;曝光和ISO参数可根 据实际情况调高，以能够明显区分对照和杂合二倍体为准）观察幼胚荧光信号强弱并参考 对照子代幼胚的荧光值，将二者区分：杂合二倍体幼胚的荧光强度明显高于对照子代的幼 胚的荧光强度，而单倍体幼胚和对照子代的幼胚的荧光强度相近，均明显低于杂合二倍体 幼胚的荧光强度。
[0046] 二、不同浓度的加倍药剂（APM)处理
[0047] 将杂合二倍体幼胚和挑选出的拟单倍体幼胚分别转移至含有加倍药剂的MS培养 基上，胚面朝下紧贴培养基，28°C黑暗处理72h，得到处理后的幼胚。不同处理组的培养基成 分如下所示：
[0048] (1)处理组1的含有加倍药剂的MS培养基：3.Og/LMS盐、30g/L蔗糖、7. 5g/L琼 脂、0.2ymol/L加倍药剂（APM)、2% (质量分数）二甲基亚砜、0? 1% (质量分数）吐温80 ;
[0049] (2)处理组2的含有加倍药剂的MS培养基：3. 0g/LMS盐、30g/L蔗糖、7. 5g/L琼 脂、0.5ymol/L加倍药剂（APM)、2% (质量分数）二甲基亚砜、0? 1% (质量分数）吐温80 ;
[0050] (3)处理组3的含有加倍药剂的MS培养基：3. 0g/LMS盐、30g/L蔗糖、7. 5g/L琼 脂、1.0ymol/L加倍药剂（APM)、2% (质量分数）二甲基亚砜、0? 1% (质量分数）吐温80 ;
[0051] (4)处理组4的含有加倍药剂的MS培养基：3. 0g/L MS盐、30g/L蔗糖、7. 5g/L琼 脂、2.5ymol/L加倍药剂（APM)、2% (质量分数）二甲基亚砜、0? 1% (质量分数）吐温80 ;
[0052] (5)处理组5的含有加倍药剂的MS培养基：3.Og/LMS盐、30g/L蔗糖、7. 5g/L琼 脂、5.0ymol/L加倍药剂（APM)、2% (质量分数）二甲基亚砜、0? 1% (质量分数）吐温80 ;
[0053] (6)对照组的培养基：3.Og/LMS盐、30