专利名称：一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种单倍体育种技术。
背景技术：
通过单倍体培养，丰富的分离、变异和重组在当代就能显示，并可以通过染色体加 倍以纯合的形式永久稳定下来。与常规育种技术相比较，单倍体育种技术具有以下优势首 先，可显著加快纯合速度，应用单倍体育种可缩短作物育种周期5-6个世代；其次，加倍单 倍体的隐性基因不受显性基因遮盖而能正常表达，可显著提高基因型的选择效率和选择的 准确性，有利于多基因重组和隐性基因的选择。此外，单倍体培养在遗传分析、基因工程、分 子生物学及物种进化等领域，都有重要的应用和研究价值。甜辣椒(即Capsicum annuum L.，包括甜椒和辣椒等不同基因型)单倍体的发生 主要通过雄核发育途径，即可通过花药培养和游离小孢子培养得到其单倍体。20世纪70 年代，我国在国际上最早开展了甜辣椒花药培养研究。其后，国内外的多位科研工作者在甜 辣椒花药培养和游离小孢子培养上投入了大量精力。目前，甜辣椒花药培养获得了一定发 展，但真实培养效率不能令人满意，尚存在基因型反应率低、有效胚状体发生率低、培养周 期长、内生菌污染严重等问题。因此，要获得一定群体规模的加倍单倍体须耗费大量资源和 工作量，培养时间也大大拉长，不能满足育种实践需要。游离小孢子培养不受母体组织影响，且成熟游离培养体系的一次培养产胚量大， 同时游离小孢子还具备分散性单细胞特点，是理想的遗传转化受体材料。但甜辣椒游离小 孢子培养难度大，国内外曾有过辣椒基因型材料的成功报道，但关于甜椒基因型材料尚无 成功报道，经本实验室数次重复，发现报道方法受基因型限制大，甜椒材料基本上无法获得 理想的胚状体发生率及再生株获得率。此外，在普通的甜辣椒单倍体培育实验中，单倍体植株的加倍也一直是一个难点。 经过自然加倍或人工加倍得到的双单倍体(Doubled Haploid,DH)植株对于育种、分子生物 学、遗传学研究等具有重要意义。而甜辣椒小孢子培养或花药培养得到的再生株中，自然加 倍的DH株所占比例仅为30%左右。其余为单倍体、混倍体、非整倍体等，其中单倍体所占比 例最大，约为55%左右(培养基、培养条件和基因型的不同可导致差异)。现有技术中常用 的田间秋水仙碱加倍法的加倍效果也并不理想。因此，大量的单倍体植株被浪费，限制了甜 辣椒单倍体培育技术的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够解决上述问题，可以较为高效地获得甜辣椒双单倍 体植株的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其步骤如下(1)选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株，通过镜检选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾，4°C低温预处理花蕾1-3天；(2)选取合适大小的花蕾——不同基因型的处在上述发育时期的花蕾大小可有不 同，大致上，合适的花蕾处在花瓣与花萼呈平齐状态至花瓣稍长于花萼的状态之间，更一般 地，可选择花瓣不短于花萼的花蕾；将花蕾剥去花萼后，先用75% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8-10% (ν/ν)的次氯酸 钠振荡消毒10-20min，然后用无菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作台上将花药完好无损地剥离，以每60mm直径培养皿接种12_18枚花药 的密度接种于N4-3固液双层培养基上，所述N4-3固液双层培养基的配方为固体层NTH培养基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和 琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；液体层NTH培养基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；所述固体层经121°C高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；(4)花药先在观_351条件下黑暗培养1-10天，再转移到25_28°C条件下继续黑暗培养；(5)培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，将子叶型胚状体转移到不加激素 的MS基本培养基上，培育壮苗。如上所述的获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其中，所述NTH培养基的配方为硝酸铵825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/ L,磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水 钼酸钠:0. 25mg/L,无水硫酸铜0. 025mg/L,六水氯化钴0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，烟酸 5mg/L，盐酸吡哆醇0. 5mg/L,盐酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,叶酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。一种用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，为固液双层培养基，其配方为固体层NTH培养基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和 琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；液体层NTH培养基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；所述固体层经121°C高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌。如上所述的用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其中，所述NTH培养基的配 方为硝酸铵825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/ L,磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水 钼酸钠:0. 25mg/L,无水硫酸铜0. 025mg/L,六水氯化钴0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，烟酸 5mg/L，盐酸吡哆醇0. 5mg/L,盐酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,叶酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。本发明的有益效果为应用本发明的培育方法，甜辣椒胚状体的发生突破了基因型的限制，特别是甜椒 基因型的培养效率得到了大幅度提高。同时，甜椒和辣椒的再生株中DH株比率均得到了明显提高。本发明培育方法及培养基中的组分戊炔草胺是一种生产上常用的选择性除草剂， 其作为一种抗微管物质，可有效抑制纺锤丝的形成，使植物染色体复制而不分开，从而使染 色体加倍。与秋水仙碱相比，戊炔草胺的染色体加倍效果相当，应用浓度低，并具有无毒的 特性。
图1为采用本发明培育方法的胚状体发生情况示意照片。图2为采用本发明培育方法的胚状体成苗情况示意照片。
具体实施例方式实施例1本发明的甜辣椒双单倍体培育方法的具体步骤如下(1)选择长势良好、无病虫害植株作为供体植株，严格按镜检结果选取小孢子发育 处于单核靠边期至双核早期的花蕾，4°C低温预处理花蕾1-3天；(2)取合适大小的花蕾，剥去花萼后，用75% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8_10% (ν/ν)的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作台上将花药完好无损的剥离，以每60mm直径培养皿12_18枚花药的密 度接种于N4-3固液双层培养基上，N4-3培养基的配方为固体层NTH培养基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和 琼脂粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；液体层NTH培养基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比；所述固体层经121°C高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；(4)花药先在观_351条件下黑暗培养1-10天，再转移到25_28°C条件下继续黑暗培养；(5)培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，将子叶型胚状体转移到不加激素 的MS基本培养基上，培育壮苗；待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过流式细胞仪或保 卫细胞叶绿体计数法鉴定植株倍性。二倍体植株的准确鉴定以田间植株的坐果与结籽情况为准，小孢子途径得到的DH 株以后代不发生性状分离为判断标准。其中，所述NTH培养基的配方如下所示
权利要求
1.一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其特征在于，步骤如下(1)选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的甜辣椒供体植株的花蕾，4°c低温预 处理花蕾1-3天；(2)取花瓣不短于花萼的花蕾，剥去花萼后，先用75%(ν/ν)的酒精浸泡30s，再用 8-10% (ν/ν)的次氯酸钠振荡消毒10-20min，然后用无菌水清洗3次，每次3-5min;(3)将花药完整地剥离，以每60mm直径培养皿接种12-18枚花药的密度接种于N4-3固 液双层培养基上，其中，所述N4-3固液双层培养基的配方为固体层NTH培养基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂 粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；液体层=NTH 培养基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比； 所述固体层经121°C高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌；(4)花药先在条件下黑暗培养1-10天，再转移到2548°C条件下继续黑暗培养；(5)培养4-7周时间，待胚状体发生时，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗。
2.如权利要求1所述的获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其特征在于，所述NTH培养基 的配方为硝酸铵825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸 二氢钾680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠 0. 25mg/L，无水硫酸铜0. 025mg/L，六水氯化钴0. 03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐 酸吡哆醇0. 5mg/L，盐酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，叶酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
3.一种用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其特征在于，为固液双层培养基，其配 方为固体层NTH培养基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%琼脂粉，其中蔗糖、活性炭和琼脂 粉的含量分别是它们相对于所述NTH培养基的重量百分比；液体层=NTH 培养基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相对于NTH培养基的重量百分比； 所述固体层经121°C高压灭菌；所述液体层抽滤灭菌。
4.如权利要求3所述的用于培育甜辣椒双单倍体植株的培养基，其特征在于，所述NTH 培养基的配方为硝酸铵825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸 二氢钾680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠 0. 25mg/L，无水硫酸铜0. 025mg/L，六水氯化钴0. 03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐 酸吡哆醇0. 5mg/L，盐酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，叶酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
全文摘要
本发明提供一种获得甜辣椒双单倍体植株的方法，其步骤如下(1)选取小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的供体植株的花蕾，4℃预处理1-3天；(2)剥去花萼后，先用酒精浸泡，再用次氯酸钠振荡消毒，然后用无菌水清洗；(3)将花药剥离，以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3固液双层培养基上；(4)花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；(5)培养4-7周时间，待大量胚状体发生时，将子叶型胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗。经过本发明培育方法，胚状体发生率突破了基因型的限制，甜辣椒的培养效率得到了大幅度提高，同时DH株比率也得到了提高。
文档编号A01H4/00GK102047843SQ201010508370
公开日2011年5月11日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者张宇, 张晓芬, 耿三省, 陈斌 申请人:北京市农林科学院