专利名称：一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法
技术领域：
本发明为一种获得十字花科作物小孢子植株的方法，特别涉及小孢子培养单倍体、双单倍体植株的规模化生产。属于生物学领域。
背景技术：
小孢子培养是指直接从花蕾或花药中获得游离的、新鲜的小孢子群体而进行培养的方法。通过小孢子培养，在不进行人工染色体加倍的情况下，可以获得单倍体植株；这一获得单倍体植株的方法可用于诱变筛选、抗源创造、胚胎发生机理、遗传分析、基因定位等方面的研究。同时，小孢子培养也可以通过人工染色体加倍(或自然加倍)，获得基因型纯合的双单倍体；所以，利用这种小孢子培养方法，无需对杂交育种进行多代自交，只需利用这种双单倍体植株的种子在田间种植能产生性状稳定一致的纯系(DH系)，特别适用于难以稳定性状的纯合。同时，应用这一技术可使育种时间大为缩短，育种进程迅速加快。另外，利用小孢子培养获得的DH群体，还是遗传分析及分子标记遗传图谱研究的理想材料。因此，小孢子培养技术正受到从事遗传、育种、生理、病理等方面工作者的高度重视。
自从Liehter对甘蓝型油菜小孢子培养获得成功后，该技术经过十几年的发展和完善，小孢子再生胚的频率有了很大的提高。加拿大和西欧国家的科学家对影响小孢子胚胎发生的很多因素进行了较为详尽的研究。结果证明，小孢子供体植株的生理状态是影响其胚状体发生的重要因素之一。为使供体植株不受逆境冲击，提高小孢子培养效率，国外一般将供体植株种在光照时间、强度和温度、湿度均自动控制的现代化人工气候室中，供体植株受外界环境影响小，从而使小孢子发育较为一致，小孢子再生胚的数量稳定。同时，由小孢子胚状体生产的试管苗也是通过移栽到人工气候室或大型温室，具备了一年四季均能进行小孢子培养及植株再生能力，但小孢子植株的生产成本仍然较高。
在国内，对甘蓝型油菜小孢子培养研究起步较晚。直到1990年，钟维瑾等首次对大田甘蓝型油菜小孢子进行培养并获得单倍体植株。但是，该技术在育种中应用的规模和效率远比国外低，其原因是国内没有(或费用太高)能控温的一年四季均可种油菜的大型气候室和现代化设施，小孢子培养的难度较大。主要问题集中表现为三个方面1)小孢子胚状体诱导频率较低，受所配制组合亲本的基因型影响显著，某些材料甚至不能得到胚状体；2)胚状体(或胚)的成苗技术尚不成熟，胚状体直接成苗率不高(20％左右)，一般要经多次继代培养至6-7月份形成小植株；3)当小孢子植株形成时，我国主要冬油菜区正值夏季，小植株不能及时移栽于田间，仍需保存在培养室中继代培养4-5个月，不但需要耗费额外的人力、物力及财力，限制了试验规模，延缓了育种进程，而长期继代培养易发生体细胞变异。针对这一问题，虽开展了一些研究，如在培养基中加入多效唑延缓小苗生长，或低温保存胚状体或小苗，但均未取得良好的效果。因此，如何有效地解决这一问题，是小孢子培养技术在我国冬油菜遗传育种中有效应用的一个至关重要的技术问题。
本专利方法可高效率地获得小孢子胚；通过小孢子胚的成熟培养，可极大地提高其萌发与植株再生频率；通过本专利方法生产的小孢子胚还可在非严格要求的条件下萌发与再生，可大大节约小孢子植株的生产成本。因此，本专利方法特别适用于小孢子植株的规模化生产。
发明内容
本发明针对制约小孢子培养技术在我国相关领域规模化应用的主要问题——小孢子胚的萌发、植株再生的效率与生产成本，发明一种可以通过小孢子幼胚的进一步培养大大提高小孢子的萌发与植株再生效率，通过较为粗放的常规有菌(非无菌)条件下的小孢子萌发与植株再生，降低小孢子植株规模化生产成本的获得十字花科作物小孢子培养植株的方法。
本发明一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于使小孢子培养胚充分成熟，同时在非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与再生，获得小孢子培养植株，该方法包括以下内容、步骤和结果(1)小孢子的分离；(2)小孢子的培养；(3)小孢子幼胚的成熟培养；(4)小孢子成熟胚的萌发与再生方法；(5)成熟胚的再生频率为20％至100％。
步骤包括以下三个方面1)小孢子培养这个过程指的是分离的小孢子在染色体加倍或不加倍情况下，通过胚状体诱导培养产生幼胚的过程；这个过程在20天-30天。2)小孢子幼胚的成熟培养在获得幼胚后即在无菌条件下进行胚的萌发及植株再生，再在液体培养基中，在无光照或弱光照条件下，使小孢子胚进一步成熟，培养时间为20-50天；从小孢子分离开始计算，使小孢子培养总时间达到40-70天，这个过程能大大提高小孢子胚的萌发与植株再生频率。3)非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与再生在获得成熟胚后，在非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与植株再生，即该过程不是在人工合成的高压灭菌的培养基上完成，而是将成熟胚播(栽)于含水与营养成分的纸、沙土、腐殖土非无菌要求的基质上，在保持相对湿度大于40％、温度10-25℃、通过光照的人工或自然条件下，获得萌发胚及再生植株的方法。
本发明可采用抗菌、抗除草剂、抗抗菌素微生物及化学试剂，在非无菌条件下对小孢子萌发及再生植株予以直接筛选的方法。其所指的十字花科作物是指根据经典生物分类方法，确认的甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜及白菜、芥菜、甘蓝、萝卜等十字花科作物。其所指的小孢子植株包括未进行人工染色体加倍的单倍体植株和进行人工染色体加倍或自然染色体加倍的双单倍体植株。
该方法包括有小孢幼胚的成熟培养步骤。该方法包括有非无菌条件下的小孢子胚的萌发与再生步骤。小孢子胚的萌发与再生所指的非无菌条件是指不利用常规高温灭的方法，对小孢子胚的萌发与再生所需的基质与器皿、容器等进行无菌处理。
工作原理普通的小孢子植株生产方法包括如下几个过程(1)分离从大田种植亲本材料小孢子；(2)分离的小孢子在液体NLN培养基中在无光照条件下培养，该过程一般为20天左右；(3)产生的幼胚转入B5固体培养基上进行胚的萌发与再生；(4)未成苗胚及再生植株的多代继代与生根培养，(3)、(4)两步的总时间一般为3-8个月；(5)小孢子苗的炼苗与移栽。
普通的小孢子植株生产方法除植株移栽步骤外，所有培养介质与器皿皆需要进行无菌化处理，并保持在可控的人工环境中进行。
本发明获得十字花科作物小孢子培养植株的方法是通过小孢子胚的成熟培养，即在上述第(2)步骤之后进行20-50天的液体培养，可极大地提高其萌发与植株再生频率；通过此成熟培养，生产的成熟胚可在非严格要求的条件下萌发与植株再生，具体过程简述如下(1)分离大田种植或盆栽亲本材料小孢子；(2)分离的小孢子在液体NLN培养基中在无光照条件下培养，该过程一般为20天左右；(3)产生的幼胚转入B5液体培养基上在无光或弱光照条件下培养20-50天；(4)产生的成熟胚用水清洗后直接播(栽)入无无菌处理介质上进行胚的萌发与植株再生；(5)小孢子苗的大田移栽或直接生长至收获种子。
本发明通过小孢子胚的成熟培养，大大改善了小孢子胚自身生活能力，提高了小孢子胚的萌发与植株再生频率，使之在较粗放的萌发、再生条件下仍具有较高植株再生能力，极大地节约了小孢子植株生产所需人力(成熟胚的栽培不需要训练有素的科技人员)、物力(成熟胚的栽培不需要专门化的仪器、设备与器具)、财力(节约普通胚的萌发与再生所需的化学试剂等)。
图1为使用本发明方法规模化小孢子胚培养的照片。
图2为图1所示规模化小孢子培养成熟胚55天的照片。
图3所示的是成熟胚的栽培。
图4为图3所示成熟胚栽培种植30天的照片。
具体实施例方式小孢子植株的生产需要栽培小孢子供体植株，从供体植株采取花蕾分离小孢子，对小孢子进行特殊的胚诱导培养及胚成熟培养，并在一定条件下使成熟的小孢子胚发育成小孢子植株。
1.小孢子的分离与普通的、已发表的小孢子培养程序相同。
2.小孢子胚的诱导与普通的、已发表的小孢子培养程序相同。
3.小孢子幼胚的成熟培养将第2步骤中获得的小孢子幼胚转入NLN或B5或MS基本介质，5-17％的蔗糖或添加0.01-10umol/L植物激素如NAA(萘乙酸)、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、GA3(赤霉素)、IAA(吲哚乙酸)、ABA(脱落酸)介质中光照或暗培养20-50天(17-23℃)。
4.成熟胚的播种与栽培将第3步骤中获得的成熟胚播撒或栽入含水及肥料(氮肥、磷肥、钾肥)的纸、砂土或腐殖土等介质上，于自然条件下萌发、再生；环境温度一般为10-25℃，相对湿度为40％以上，自然光照或人工光照。一般在30天左右成苗，成苗率为20-100％。
实施例1供体材料及栽培供体材料为各种甘芥、甘白、甘甘及大白菜杂交种后代共青110余份。分别于2006年9-10月份分批播于大田及温室花盆中，自然光照，三叶期后每周用0.5％的复合肥浇灌。分别于2006年12月、2007年1-3月收集花蕾。
小孢子的分离在实验期间内每天上午8.00-10.00及下午13.00-15.00采集3-4mm长的花蕾(每次20蕾/材料)，20％商品次氯酸钠溶液灭菌10-15分钟，无菌水清洗三次；用10-50ml玻璃注射器的内套压碎花蕾，添加0.5ml B5-13培养基及13％的蔗糖，pH值5.8，过滤灭菌。)进一步挤释放出小孢子；用直径为46um的筛网过滤并洗涤，离心分离处于单核晚期或双核初期的小孢子。
小孢子胚的诱导培养上述分离的小孢子用B5-13培养基洗涤三次，再用NLN-13及13％的蔗糖，pH值6.0，过滤灭菌。)培养基洗涤一次；添加4mlNLN-13、秋水仙碱300-500mg/L(如需要单倍体植株，则秋水仙碱可以省略)，活性炭0.5g/L，于31℃培养箱中暗培养24-54小时；用NLN-13介质清洗秋水仙碱，并稀释成6皿继续于31℃的培养箱中暗培养4-10天至小孢子分裂，并在显微镜下可观察到4-10个细胞的小细胞团；接着转移至25℃的培养箱中继续暗培养至鱼雷胚时期，总时间约20天左右。
小孢子幼胚的成熟培养将小孢子幼胚转入NLN-13、MS-13、B5-13及含有0.01-10umol/L植物激素如NAA、6-BA、GA3、IAA、ABA介质中光照或暗培养20-50天(17-23℃)至胚色为黄绿色、长度约10mm(见图1)。
小孢子成熟胚的萌发与植株再生待胚发育完全成熟后播撒或移栽入含水及肥料(氮肥、磷肥、钾肥)的纸、砂土或腐殖土等介质上，于自然条件下萌发、再生；环境温度一般为10-25℃，相对湿度为40％以上，自然光照或人工光照。一般在30天左右成苗，成苗率为20-100％(见图2)。
本专利提供了一种高效率地获得小孢子植株的方法。特别地，本发明通过插入小孢子胚的成熟培养过程，可极大地提高其萌发与植株再生频率；同时，通过本专利方法生产的小孢子胚还可在非严格要求的条件下萌发与再生，可大大节约小孢子植株的生产成本。极大地降低小孢子植株的生产成本，特别适合小孢子植株的规模化生产。因此，本发明方法特别适用于小孢子植株的规模化生产。
培养基MS、B5、NLN培养基配方(mg/L)
权利要求
1.一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于使小孢子培养胚充分成熟，同时在非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与再生，获得小孢子培养植株，该方法包括以下内容、步骤和结果(1)小孢子的分离；(2)小孢子的培养；(3)小孢子幼胚的成熟培养；(4)小孢子成熟胚的萌发与再生方法；(5)成熟胚的再生频率为20％至100％。
2.根据权利要求1所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于步骤包括以下三个方面(1)小孢子培养这个过程指的是分离的小孢子在染色体加倍或不加倍情况下，通过胚状体诱导培养产生幼胚的过程；这个过程在20天-30天。(2)小孢子幼胚的成熟培养在获得幼胚后即在无菌条件下进行胚的萌发及植株再生，再在液体培养基中，在无光照或弱光照条件下，使小孢子胚进一步成熟，培养时间为20-50天；从小孢子分离开始计算，使小孢子培养总时间达到40-70天，这个过程能大大提高小孢子胚的萌发与植株再生频率。(3)非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与再生在获得成熟胚后，在非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与植株再生，即该过程不是在人工合成的高压灭菌的培养基上完成，而是将成熟胚播(栽)于含水与营养成分的纸、沙土、腐殖土非无菌要求的基质上，在保持相对湿度大于40％、温度10-25℃、通过光照的人工或自然条件下，获得萌发胚及再生植株的方法。
3.根据权利要求1和2所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于可采用抗菌、抗除草剂、抗抗菌素微生物及化学试剂，在非无菌条件下对小孢子萌发及再生植株予以直接筛选的方法。
4.根据权利要求1和2所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其所指的十字花科作物是指根据经典生物分类方法，确认的甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜及白菜、芥菜、甘蓝、萝卜等十字花科作物。
5.根据权利要求1和2所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其所指的小孢子植株包括未进行人工染色体加倍的单倍体植株和进行人工染色体加倍或自然染色体加倍的双单倍体植株。
6.根据权利要求1和2所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子培养植株的方法，其特征在于该方法包括有小孢幼胚的成熟培养步骤。
7.根据权利要求1和2所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子培养植株的方法，其特征在于该方法包括有非无菌条件下的小孢子胚的萌发与再生步骤。
8.根据权利要求1和7所述的一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于小孢子胚的萌发与再生所指的非无菌条件是指不利用常规高温灭的方法，对小孢子胚的萌发与再生所需的基质与器皿、容器等进行无菌处理。
全文摘要
本发明涉及一种规模化获得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于使小孢子培养胚充分成熟，同时在非无菌条件下进行小孢子胚的萌发与再生，从而获得小孢子培养植株。该方法包括以下内容、步骤及结果(1)小孢子的分离；(2)小孢子的培养；(3)小孢子幼胚的成熟培养；(4)小孢子成熟胚的萌发与再生方法；(5)成熟胚的再生频率为20％至100％。
文档编号A01H4/00GK101049081SQ20071006586
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者王敬乔, 陈苇, 刘丽, 董云松, 李根泽 申请人:云南省农业科学院经济作物研究所