一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法
【专利摘要】本发明公开了一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，包括：选择引进的抗根肿病的大白菜和农艺性状优良的易感不结球白菜；进行蕾期的种间杂交，获得杂交一代F1的种子；以筛选的F1代连续回交4代，初步获得表现型稳定的抗根肿病的不结球白菜抗性新种质Q15?1。本发明通过种间杂交的方法，且对每个回交后代进行人工接种鉴定，筛选抗根肿病的抗性单株，最后获得新种质，本发明利用十字花科芸薹属的大白菜及其变种不结球白菜两者间的杂交优势，将抗根肿病大白菜的抗性基因通过蕾期的杂交和回交转育技术，转育到不结球白菜中，简单易行，排除了其他方式如转基因、基因工程技术等造成生物风险。
【专利说明】
一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农作物品种种质创新研制领域，尤其涉及一种不结球白菜抗根肿病的 种质资源获取的方法。
【背景技术】
[0002] 十字花科作物根肿病是由芸苔根肿菌(plasmodiophora brassicae Woron)浸染 引致的十字花科作物根部病害，此病菌是一种专性寄生菌，专门浸染十字花科作物。该病原 菌侵入植物根毛、皮层、形成层，产生含有植物生长激素的病菌分泌物，刺激薄壁细胞的异 常分裂增大，在增生部位膨大形成瘤状的肿根。肿根的出现一方面降低了根系吸收和供给 水份及养份的能力，造成地上部分失水、枯黄和死亡；另一方面使植物根系失去了外层的保 护作用，易被其它杂菌入侵而引起腐烂。
[0003] 根肿病可危害白菜、青菜、花椰菜、甘蓝、油菜等多种十字花科栽培及野生植物，一 旦发生，将造成严重的危害。在我国，该病主要发生在华东和华南的一些十字花科作物的主 要产区。十字花科作物根肿病传染性极强，能随种子、肥料、雨水、灌溉水、虫害、鼠害、农事 操作等多种途径传播，病原菌在土壤或种子上越冬，可在土壤中存活6年以上，病菌在9~23 °C均可发育，土壤含水量70 %~90 %最易发病，该病传播速度快，发病面积在短短的几年间 呈几十倍，甚至上百倍增加，危害十分严重。
[0004] 不结球白菜（Brassic campestris ssp.chinensis Makino)又名小白菜、青菜，属 十字花科芸薹属，因其品质柔嫩、风味独特、营养丰富等特点，在人民生活中占有重要的地 位，特别在上海、长江中下游及以南地区，不结球白菜是人们每日必食的、不可缺少的大众 化蔬菜。然而近年来，上海郊区，如青浦、松江、金山和浦东等地不结球白菜根肿病发病逐年 加重，严重的区域产量急剧下降，甚至回产，影响不结球白菜市场的正常供应，造成极大损 失。通常，不结球白菜发病后根组织异常的大量增生，在增生部位膨大形成瘤状的肿根，月中 根的出现损害了根系的生长和吸收能力，受侵染的植物生长发育迟缓，使植株萎蔫、黄化和 落叶，甚至整株死亡。青菜感病后将造成产量下降，品质降低，严重时软腐细菌和其他病原 菌乘虚而入，侵染受害部位，最终使植株枯萎死亡颗粒无收，给菜农造成极大的损失。
[0005] 不结球白菜和大白菜是同一个白菜亚种中不同变种，对青菜根肿病的研究可以借 鉴大白菜，目前已对大白菜根肿接种病的发病规律，生理小种、接种鉴定方法，选育转育及 分子生物上多次进行研究报道。谭、黄，况等研究了大白菜种间对根肿病的抗性鉴定及抗性 生理分析。由王、孙等对大白菜的抗根肿病的遗传进行初步研究，确认大白菜抗根肿病遗传 有一对显性基因控制。在育种方面，因为在结球白菜中没有抗源，吉川等（1977)将结球白菜 与抗病的芜菁杂交，用结球白菜对结球白菜和芜菁的杂交种进行4~5次回交，可以获得性 状优良，且具有抗性的结球白菜。利用该方法，日本、韩国等均相继获得抗根肿病大白菜品 种，国内，孙保亚等从国外引进的大白菜中分离出大白菜抗根肿病自交系48个。目前在青 岛、云南和沈阳等地区已经获得抗根肿病的大白菜材料，张等通过选育获得了大白菜抗根 肿病新品种CR589。不结球白菜抗根肿病的种质资源创新研究鲜有报道，更没有成型的抗根 肿病青菜栽培品种。因此，借助远缘杂交或是变种间的杂交，获得抗病种质资源的主要育种 方式，将为青菜抗根肿病育种工作提供新的种质资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，旨在解 决现有技术中缺少关于不结球白菜抗根肿病种质资源的创制的方法和没有成型的抗根肿 病青菜栽培品种的问题。
[0007] 本发明是这样实现的，一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，该方法 包括如下步骤：
[0008] 步骤一、引进抗根肿病的大白菜，并采用苗期人工接种鉴定方法筛选农艺性状优 良的易感不结球白菜纯合自交系；
[0009] 步骤二，在开花期，以易感不结球白菜为母本，抗根肿病的大白菜为父本，进行剥 蕾的种间杂交，获得杂交一代F1的种子；
[0010] 步骤三，通过人工接种方法进行F1代根肿病的抗性鉴定，并筛选抗根肿病植株；
[0011] 步骤四，以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感不结球白菜纯 合自交系为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株，通过人工接种方法进行根肿病的 人工接种鉴定；
[0012] 步骤五，从回交后代中筛选出的抗根肿病的植株再作为母本与易感不结球白菜进 行回交，连续回交4代，其中回交一代和回交二代通过人工低温春化处理后，进行加代获得， 且每代都进行根肿病的抗性鉴定，筛选抗根肿病单株，获得表现型初步稳定的抗根肿病的 不结球白菜抗性新种质Q15-1。
[0013] 进一步，所述步骤一中引进的抗根肿病大白菜编号为B13-1，农艺性状优良的易感 不结球白菜纯合自交系编号为Q13-1。
[0014] 进一步，所述步骤四中以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感 不结球白菜纯合自交系为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株Q15-1。
[0015] 进一步，步骤三和步骤四中抗性鉴定在温室大棚中进行人工接种鉴定，统计发病 率和病情指数。
[0016]本发明通过种间杂交的方法，将抗根肿病的大白菜和易感的不结球白菜进行种间 杂交，利用农艺性状优良的不结球白菜对杂交种进行连续4代的回交转育，且对每个回交后 代进行人工接种鉴定，筛选抗根肿病的抗性单株，最后达到获得表现型稳定的抗根肿病不 结球白菜新种质的目的。本发明利用的是十字花科芸薹属的大白菜及其变种不结球白菜两 者间的杂交优势，将抗根肿病大白菜的抗性基因通过蕾期的杂交和回交转育技术，转育到 不结球白菜中，简单易行，排除了其他方式如转基因、基因工程技术等造成生物风险。本发 明通过种间杂交回交转育技术，不仅为不结球白菜抗根肿病创制了新的抗病材料，将对不 结球白菜抗病育种实践及其理论研究也具有重要意义;本发明通过系统、广泛地收集、挖掘 白菜类作物抗根肿病的种质资源，并进行资源的有序整理、评价及有效利用;通过同一属不 同种的种间杂交技术，利用抗根肿病的抗性结球大白菜和感病不结球白菜，进行蕾期的有 性杂交，利用农艺性状优良的不结球白菜进行连续的转育，其中采用了低温春化处理进行 人工加代技术，缩短了新种质创制的年限;此外结合根肿病抗病性鉴定技术对杂交后代及 转育后代进行抗性鉴定，为筛选及定向系统选育抗根肿病不结球白菜新品种的目标，创制 出新种质将结球大白菜抗根肿病基因通过有性杂交技术导入感病不结球白菜生物体内；并 利用杂交、回交转育方法和抗根肿病的鉴定技术，重组和改良了感病不结球白菜的抗根肿 病基因，并极大地提高了其对根肿病的抗性，获得了一批有利用价值的、抗根肿病、园艺性 状优良的不结球白菜新种质；为充分发掘不结球白菜的抗根肿病基因，进一步研究不结球 白菜抗根肿病的生理生化机制、遗传规律及其分子生物学奠定了基础。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例提供的不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法流程图。
[0018] 图2是本发明实施例提供的抗根肿病不结球白菜种质的创制过程示意图。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0020] 种质资源的收集、利用和评价是进行育种研究的前提和基础，因此对十字花科根 肿病抗性材料的广泛收集和评价，是进一步研究不结球白菜根肿病特性及抗性育种的基 础，本发明将已获得引进的大白菜抗根肿病基因与农艺性状优良的易感不结球白菜杂交， 将抗根肿病基因导入性状优良但不抗根肿病的不结球白菜体内，采用杂交和连续回交育种 技术，抗病性鉴定技术等现代育种方法，选育获得既抗根肿病、园艺性状又优良的不结球白 菜新种质。
[0021] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0022] 如图1所示:一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，该不结球白菜抗根 肿病的种质资源获取的方法包括如下步骤：
[0023] S101:引进抗根肿病的大白菜，并采用苗期人工接种鉴定方法筛选农艺性状优良 的易感不结球白菜纯合自交系；
[0024] S102:在开花期，以易感不结球白菜为母本，抗根肿病的大白菜为父本，进行剥蕾 的种间杂交，获得杂交一代F1的种子；
[0025] S103:通过人工接种方法进行F1代根肿病的抗性鉴定，并筛选抗根肿病植株；
[0026] S104:以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感不结球白菜纯合 自交系为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株，通过人工接种方法进行根肿病的人 工接种鉴定；
[0027] S105:从回交后代中筛选出的抗根肿病的植株再作为母本与易感不结球白菜进行 回交，连续回交4代，其中回交一代和回交二代通过人工低温春化处理后，进行加代获得，且 每代都进行根肿病的抗性鉴定，筛选抗根肿病单株，初步获得表现型稳定的抗根肿病的不 结球白菜抗性新种质Q15-1。
[0028]所述S101中引进的抗根肿病大白菜编号为B13-1，农艺性状优良的易感不结球白 菜纯合自交系编号为Q13-1。
[0029]所述S104中以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感不结球白菜 纯合自交系为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株Q15-1。
[0030] S103和S104中抗性鉴定在温室大棚中进行人工接种鉴定，统计发病率和病情指 数。
[0031] 下面结合实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0032] 1材料和方法
[0033] 1.1材料
[0034] 大白菜B13-1是引自韩国圣尼斯种子公司的西由铁根，具有抗根肿病特性的结球 白菜。
[0035]不结球白菜Q13-1由上海市农业科学院园艺所多年选育的材料，是自交6-10代选 育获得的高代自交系，综合性状优良，对TuMV、霜霉病和黑斑病具有较强的抗性，而对根肿 病则表现为易感。
[0036] 1.2抗病性鉴定
[0037]抗根肿病大白菜、易感不结球白菜种质材料及杂交种、回交种在不同世代转育期 间进行抗病性鉴定。根肿病人工接种方法采用根肿病菌菌土法，即以新鲜根肿块和基质的 重量比2:5混合拌匀，置入77孔的泡沫穴盘，穴盘底下带有可盛水的凹凸型的塑料盘。鉴定 试验在防虫温室进行，每份材料50株，播种于菌土中，3次重复，以抗根肿病大白菜材料灿光 (CK)作对照，进行统计分析。于播种后40d调查病情指数。田间鉴定，在上海青浦弘阳农场进 行。利用田间自然病源，对种质材料进行鉴定调查，随机排列，3次重复，每小区随机调查100 株，进行统计分析。
[0038] 1.3数据统计
[0039] 根肿病病情分级尚无统一标准，将病情严重度分为4个等级：
[0040] 〇级一未发病；
[0041 ] 1级一须根肿大，或主根轻微肿大但不明显；
[0042] 3级一主根明显肿大，肿瘤大小达茎基部横切面积的2~3倍；
[0043] 5级一主根明显肿大，肿瘤大小达茎基部横切面积的4倍以上，或主、须呈现多个明 显肿瘤。
[0044] 调查结果按式(1)~(2)计算株发病率和病情指数。
[0045] 病株率=(发病株数/总株数）X 100%............(1)
[0046] 病情指数=I：(发病级代表值X各级病株数）X 100/
[0047](调查总株数X最高级发病代表值)..................（2)
[0048] 2结果与分析
[0049] 2.1种质的创制过程
[0050] 种质创制以种间杂交、回交转育的方法进行，即选择引进的抗根肿病的大白菜 B13-1和农艺性状优良的易感不结球白菜Q13-1;在抽薹开花期，以易感不结球白菜为母本， 抗根肿病的大白菜为父本，进行蕾期的种间杂交，获得杂交一代F1的种子;F1代通过根肿病 的抗性鉴定，筛选抗根肿病植株；以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，以农艺性状优良的 Q13-1为父本，进行回交;通过回交获得BC13-1，进行根肿病的接种鉴定，筛选出的抗根肿病 的植株再作为母本与不结球白菜进行回交，连续回交4代，其中2代通过人工加代获得，每代 都进行根肿病的抗性鉴定，初步获得表现型稳定的抗根肿病的不结球白菜抗性新种质Q15- 1(见图2)
[0051] 2.2大白菜与不结球白菜杂交种的根肿病接种鉴定结果
[0052] 以抗性大白菜和感病不结球白菜种间杂交得到的F1及其双亲的室内和田间鉴定 结果如下，对照和大白菜B13-1在室内和田间的抗根肿病鉴定为抗病，对青浦地区的根肿病 生理小种表现为高抗。而不结球白菜Q13-1，在室内和田间的鉴定结果发病率和病情指数达 到53.06%和65.31 %及25.31和36.32,表现为感病。而通过种间杂交获得的杂交种F1在室 内和田间鉴定的发病率和病情指数均较低，变现为抗病。
[0053] 表1大白菜与不结球白菜及其杂交种的根肿病抗性鉴定结果
[0055] 2.2大白菜与不结球白菜回交种的根肿病接种鉴定结果
[0056]从2013年至2015年间，通过人工加代，获得了回交4代种子，根据根肿病抗性鉴定 结果，由表2可知，抗性大白菜和不结球白菜的回交后代在室内和田间鉴定中，对照和大白 菜B13-1在室内和田间的抗根肿病鉴定为抗病，对青浦地区的根肿病生理小种表现为高抗。 不结球白菜Q13-1，在室内和田间的鉴定结果发病率和病情指数达到63.43 %和55.35 %及 39.61和28.93 3(：14-1为回交1代，8(：14-2和队15-1为人工春化加代的回交2代和回交3代， 其室内和田间鉴定结果均表现为抗病.而各回交后代的发病率均低于10%，且发病指数小 于10,表现为抗病。
[0057]表2大白菜与不结球白菜及其回交后代的根肿病抗性鉴定结果
[0059]本发明通过系统、广泛地收集、挖掘白菜类作物抗根肿病的种质资源，并进行资源 的有序整理、评价及有效利用。通过同一属不同种的种间杂交技术，利用抗根肿病的抗性结 球大白菜和感病不结球白菜，进行蕾期的有性杂交，利用农艺性状优良的不结球白菜进行 连续的转育，其中采用了低温春化处理进行人工加代技术，缩短了新种质创制的年限。此外 结合根肿病抗病性鉴定技术对杂交后代及转育后代进行抗性鉴定，为筛选及定向系统选育 抗根肿病不结球白菜新品种的目标，创制出新种质将结球大白菜抗根肿病基因通过有性杂 交技术导入感病不结球白菜生物体内。并利用杂交、回交转育方法和抗根肿病的鉴定技术， 重组和改良了感病不结球白菜的抗根肿病基因，并极大地提高了其对根肿病的抗性，获得 了一批有利用价值的、抗根肿病、园艺性状优良的不结球白菜新种质。为充分发掘不结球白 菜的抗根肿病基因，进一步研究不结球白菜抗根肿病的生理生化机制、遗传规律及其分子 生物学奠定了基础。
[0060]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，其特征在于，该不结球白菜抗根 肿病的种质资源获取的方法包括如下步骤： 步骤一、引进抗根肿病的大白菜，并采用苗期人工接种鉴定方法筛选农艺性状优良的 易感不结球白菜纯合自交系； 步骤二，在开花期，以易感不结球白菜为母本，抗根肿病的大白菜为父本，进行剥蕾的 种间杂交，获得杂交一代F1的种子； 步骤三，通过人工接种方法进行F1代根肿病的抗性鉴定，并筛选抗根肿病植株； 步骤四，以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感不结球白菜纯合自 交系为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株，通过人工接种方法进行根肿病的人工 接种鉴定； 步骤五，从回交后代中筛选出的抗根肿病的植株再作为母本与易感不结球白菜进行回 交，连续回交4代，其中回交一代和回交二代通过人工低温春化处理后，进行加代获得，且每 代都进行根肿病的抗性鉴定，筛选抗根肿病单株，初步获得表现型稳定的抗根肿病的不结 球白菜抗性新种质Q15-1。2. 如权利要求1所述的不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，其特征在于，所述 步骤一中引进的抗根肿病大白菜编号为B13-1，农艺性状优良的易感不结球白菜纯合自交 系编号为Q13-1。3. 如权利要求1所述的不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，其特征在于，所述 步骤四中以筛选的F1代抗根肿病植株为母本，农艺性状优良的易感不结球白菜纯合自交系 为父本，进行回交;通过回交获得抗根肿病植株Q15-1。4. 如权利要求1所述的不结球白菜抗根肿病的种质资源获取的方法，其特征在于，所述 步骤三、步骤四和步骤五中抗性鉴定在温室大棚中进行人工接种鉴定，统计发病率和病情 指数。
【文档编号】A01H1/04GK105850717SQ201610248555
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】朱红芳, 朱玉英, 李晓锋, 翟文
【申请人】上海市农业科学院