与芜菁抗根肿病基因连锁的分子标记及获得方法
【专利摘要】本发明公开了一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记及其获得方法。将抗根肿病芜菁亲本材料P1（‘077-03’）和感病亲本材料P2（‘077-04’）杂交得到F1群体并构建相应的BC1、F2、F3群体；明确该病害的病原是芸薹根肿菌；抗病性遗传分析结果表明其抗性受显性单基因控制；利用SSR分子标记技术和改良BSA法对芜菁F2群体进行根肿病抗性标记的筛选，获得与芜菁抗根肿病基因紧密连锁的分子标记BrSSR133，该SSR分子标记与抗性基因的遗传距离为5.02cm。研究结果为分离新的抗根肿病基因奠定了基础，本发明对芸薹种作物的育种实践和抗病理论研究均有重要意义。
【专利说明】与芜菁抗根肿病基因连锁的分子标记及获得方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记 及其获得方法。
【背景技术】
[0002] 十字花科作物根肿病也称"根癌"，是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的世界性土传病害。目前在世界范围内危害严重，我国绝大部分地区的十 字花科作物也正面临着根肿病的严重威胁。十字花科作物受根肿菌侵染后会导致产量显著 下降，甚至绝收。目前生产上一般采用化学药剂防治，但在症状表现后再使用药剂处理效果 并不明显，这给防治带来了很大困难。研究表明，根肿菌休眠孢子在土壤中的寿命长达8? 10年，严重影响十字花科作物的可持续性生产。因此，在生产上培育具有根肿病抗性的十字 花科作物新品种是最安全而又经济的方法。
[0003] 为解决上述影响我国十字花科作物可持续发展的重大问题，挖掘新的抗原，以往 育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些优良的抗根肿病 自交系，但在抗病转育过程中应用传统的方法筛选抗性植株时存在选育时间较长、操作程 序繁琐等缺点；另一方面抗性表现易受环境条件的影响，难以适应育种实践的需要。近年 来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助技术开展十字花科抗病育种显出巨大的潜 力。一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于十字花科抗病研究。 应用分子标记技术，不但可以免除传统育种中繁重的选择过程，以及跟踪、检测外源基因， 还能把多个抗根肿病基因聚合到同一优良品种中，使其获得持久、广泛的抗性。
[0004] 芸薹种是十字花科芸薹属中一个重要的基本种，它包含有AA(2n = 20)基因组，可 分为中国白菜亚种（大白菜、小白菜、菜心、紫菜薹、薹菜和乌塌菜等6个变种）、芜菁亚种和 日本水菜亚种等三个亚种，是一种重要的蔬菜和油料作物。前人的研究结果显示，芜菁是芸 薹种中唯一发现含有对根肿病抗性基因的变种，通过杂交与回交技术，可以将芜菁中的抗 性基因转移到同种的大白菜、小白菜、菜心和紫菜薹等变种中，从而为抗根肿病的新品种选 育提供创新种质。因此，寻找与根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记不仅可应用到分子辅 助育种中，提高芸薹种作物抗病育种效率，在农业上有重要的应用价值，而且还可以为进一 步克隆相关的抗病基因并分析其生物学功能奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的 分子标记及其获得方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分 子标记，所述分子标记（BrSSR133)的序列为SEQ ID N0. 3,其上游引物为SEQ ID N0. 1，下 游引物为SEQ ID NO. 2。
[0007] 本发明一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记BrSSR133的获得方法，包括 以下步骤：
[0008] 1)利用经过多代自交选育出的抗根肿病芜菁亲本材料'077-03'和感病亲本材料 '077-04'，将所述抗病亲本'077-03'和感病亲本'077-04'进行杂交得到Fi群体，并构建 相应的BCi、F 2、F3群体；
[0009] 2)根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原休眠孢子镜检，明确该病害的病 原是芸薹根肿菌；
[0010] 3)对群体进行人工接种鉴定，发现'077-03'的根肿病抗性是由一对显 性核基因控制；
[0011] 4)利用SSR分子标记技术，运用改良BSA法进行与芜菁根肿病抗性分子标记的筛 选；
[0012] 5)筛选出一个SSR分子标记BrSSR133,经单株验证分析，该分子标记与根肿病抗 性基因的遗传距离为5. 02cm。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：根肿病是目前影响十字花科生产的一 种严重病害。本发明利用SSR分子标记方法，结合改良的BSA法得到一个与芜菁根肿病抗 性相关的SSR分子标记，可直接用于芸薹种作物的抗根肿病分子标记的辅助选择育种。利 用该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，还可以有目的地聚合多 个抗根肿病基因，培育出具有稳定的多抗性的芸薹种作物品种。同时也可利用这个新根肿 病抗性基因的分子标记克隆抗根肿病基因，并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了 解芜菁抗根肿病的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在芸薹种作物育种实践及抗病 理论研究上均具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是芸薹根肿菌休眠孢子在600倍光学显微镜下的观察结果（标尺长为 50 μ m)。A图：从根瘤组织分离；B图：从土壤中分离图；
[0015] 图2是BrSSR133对两个亲本的验证结果图；
[0016] 图3是BrSSR133对抗（感）基因池的扩增结果图。1和2 :正交F2代抗病池；3和 4 :正交F2代感病池；
[0017] 图4是BrSSR133的F2代单株验证结果图；
[0018] 图5是BrSSR133的匕代单株验证结果图。
【具体实施方式】
[0019] 与芜菁抗根肿病分子标记BrSSR133的获得方法主要包括以下步骤：
[0020] 1.利用经过多代自交选育出的抗根肿病芜菁亲本材料Pi ( '077-03'）和感病亲本 材料P2( '077-04'），将所述抗病亲本'077-03'和感病亲本'077-04'进行杂交得到Fi群 体,并通过测交和自交途径构建相应的BQ、F 2和F3群体。
[0021] 2.根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原休眠孢子镜检，明确该病害的病 原是芸薹根肿菌。
[0022] 具体做法为：观察田间自然发病材料的病害症状，从病根和病土中分离病原的休 眠孢子，在600倍光学显微镜下观察休眠孢子的形态特征。图1所示：从病根和病土中分离 的休眠孢子的大小、形态特征与十字花科根肿菌相一致。
[0023] 根肿组织中根肿菌休眠孢子的分离：
[0024] (1)取根肿组织10g，在研钵中磨碎，加 50mL灭菌水，用4层纱布过滤。
[0025] (2)滤液移入5〇mL离心管，3100rpm离心Ιδη?η。
[0026] (3)弃上清液，沉淀溶于50mL灭菌水，移入50mL离心管，3100rpm离心15min。
[0027] (4)重复步骤（3) 2?3次。
[0028] (5)弃上清液，在步骤⑷得到的沉淀中加入5mL质量百分数为50%蔗糖溶液，混 勻后，移入50mL离心管，3100rpm离心lOmin。
[0029] (6)用移液枪把离心后的上清液小心移入50mL离心管，加入30mL灭菌水，3100rpm 离心lOmin。
[0030] (7)弃步骤（6)离心后的上清液，将得到的沉淀重溶于30mL灭菌水，移入50mL离 心管中，3100rpm离心lOmin，此步操作重复2?3次。
[0031] (8)最后沉淀溶于5mL灭菌水中备用。
[0032] 土壤中根肿菌休眠孢子的分离：
[0033] (1)取10g病土，溶于20mL质量百分数为0.05 % tween-80 (聚山梨酯）水溶液中， 置于摇床上摇2?3h。
[0034] (2)将步骤⑴得到的混合液用4层纱布过滤。
[0035] (3)滤液移入5〇mL离心管，3100rpm离心Ιδη?η。
[0036] (4)弃上清液，沉淀重溶于50mL灭菌水，移入50mL离心管，3100rpm离心15min。
[0037] (5)重复步骤（4) 2?3次。
[0038] (6)弃上清液，在步骤（5)得到的沉淀中加入5mL质量分数为50 %蔗糖溶液，混匀 后，移入50mL离心管，3100rpm离心lOmin。
[0039] (7)用移液枪把上清液小心移入50mL离心管，加入30mL灭菌水，3100rpm离心 10min〇
[0040] (8)弃上清液，沉淀重溶于30mL灭菌水，3100rpm离心lOmin，此步操作可重复2? 3次。
[0041] (9)最后沉淀溶于5mL灭菌水中备用。
[0042] 3.对BQ、F2、F3群体进行人工接种鉴定，发现Pi ( '077-03'）的根肿病抗性是由 一对显性核基因控制的。
[0043] 具体做法为：对？^^、正交匕和反交匕、正交F2和反交F2、正交F 3和反交匕^心这 六个世代的种子进行根肿病抗性试验，在适宜的环境下进行培养，播种6周后记录每个世 代的感病情况，根据病情严重度划分为四个标准，并计算发病率、病情指数、发病指数（表 1)，将数据进行卡方检验，表2的检验结果显示？" '077-03'）的根肿病抗性是由一对显性 核基因控制的。
[0044] 表1根肿病抗性试验结果
[0045]
【权利要求】
1. 一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为 序列为 SEQ ID NO. 3。
2. 根据权利要求1所述的一种与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记，其特征在于， 所述分子标记的上游引物为SEQ ID NO. 1，下游引物为SEQ ID NO. 2。
3. -种权利要求1所述的与芜菁抗根肿病基因相连锁的分子标记的获得方法，其特征 在于，主要包括以下步骤： (1) 利用经过多代自交选育出的抗根肿病芜菁亲本材料'077-03'和感病亲本材料 '077-04'，将所述抗病亲本'077-03'和感病亲本'077-04'进行杂交得到Fi群体，并构建 相应的BCi、F 2、F3群体； (2) 根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原休眠孢子镜检，明确该病害的病原是 芸薹根肿菌； (3) 对BQ、Fp匕群体进行人工接种鉴定，发现'077-03'的根肿病抗性是由一对显性 核基因控制； (4) 利用SSR分子标记技术，运用改良BSA法进行与芜菁根肿病抗性分子标记的筛选； (5) 筛选出一个SSR分子标记经单株验证分析，该分子标记与根肿病抗性基 因的遗传距离为5. 02 cm。
【文档编号】C12N15/10GK104152443SQ201410338727
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】余小林, 王芳展, 刘亚培, 刘振宁 申请人:浙江大学