专利名称：：防治十字花科根肿病的生物制剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属微生物
技术领域：
，主要涉及一种防治十字花科作物根肿病的生物制剂及其应用。
背景技术：
：根肿病最早发现于地中海西岸和欧洲南部，目前，在世界各国均有分布，造成至少10%的经济损失。根肿病亦广泛分布于我国的浙江、广东、广西、湖南、福建、江西、江苏、安徽、四川、云南、新疆、西藏、辽宁、山东、上海、北京以及重庆等省(市、自治区)，可以说基本上覆盖了我国的十字花科植物的主栽区。该病由低等、较原始的真菌---芸苔根肿菌(尸to,^o//wm^m/cae)(或被称为原生动物)引起，极难防治。该菌为专性寄生，主要危害十字花科植物的根部，能够产生吲哚乙酸和细胞分裂素等激素类物质，致使植物的根部组织膨大。根肿部一般为纺锤型、手指型和不规则型等。根肿初期表面光滑，后期常发生龟裂，易被其他微生物侵染而腐烂。通常苗期就可受害，严重时幼苗枯死。成株期受害，地上部分初期表现生长缓慢、矮小，基部叶片中午萎蔫，早晚恢复；后期基部叶片变黄，且萎蔫症状不能恢复，严重时全株枯死。由该病引起的十字花科作物损失占世界范围的十字花科作物总量的10%以上，在发病的区域引起损失一般在20-90%之间，病菌以厚垣孢子在病残体和土壤中休眠，借流水、土壤移动和秧苗扩散传播。厚垣孢子在无十字科作物的土壤中仍能存活10年以上，导致种植过十字花科作物的地块在短期内不能再种植同科作物。根肿病危害严重，但对其的防治效果不理想。目前，控制根肿病的措施主要有检疫、抗病品种、轮作、调节土壤的pH值和土壤化学消毒等。生产上栽培的十字花科作物的抗病性较差，有人鉴定了404份甘蓝，未找到抗病品种，有限的抗性基因主要来自欧洲的芜菁，而且病菌致病性存在分化，即有生理小种分化，致使同一抗病品种在一地抗病，在另一地抗性较差，而且即使抗病品种，其抗性也不像水稻对稻瘟病、小麦对锈病那样，呈现很高抗性。有报导诱发休眠孢子萌发的措施，减少田间孢子数量，可减轻下一茬目标作物根肿病发生程度。有报道称咖啡酸和云实精能促进休眠孢子萌发。种植多叶萝卜作为诱饵植物，能诱使休眠孢子萌发，可减少孢子量71-94%，但不能减轻大白菜根肿病发生程度。堆肥可杀死病残体中的病菌量，当温度升至54-73°C6-7天，可杀死病菌。轮作是非常有效的防治措施，特别是十字花科作物与非十字花科作物轮作，效果更明显。然而，根肿病菌还能侵染旱金莲，木瓜，白木犀草和甜菜等产生内源芥子酸的非十字花科植物，不产生典型的肿瘤，但能形成具有活力的厚垣孢子。这些结果表明轮作适用作物范围还是有限的，而且在已建成的蔬菜基地，特别是设施农业基地，轮作很难被完全采用。长期以来，调节土壤pH值被认为是最有效的措施之一。利用石灰及其他形式的钙盐在一定程度上可以调节土壤pH值，可有效减少休眠孢子的萌发，起到控制该病害的效果。钙盐处理既可以调节土壤的pH，又可以增加土壤中可交换Ca2+的浓度从而减轻病害的危害。有人在比较Ca(OH)2、CaC03和KOH对根肿病的防治效果时发现，KOH对根肿病的防治效果不及Ca(0H)2和CaCO:,，这充分说明根肿病的发生与土壤中钙的含量有着密切关系。但是长期使用石灰对土壤结构、生理生化性状都会造成不良影响。常用的化学防治主要采用两种方法，即化学熏蒸和化学药剂灌根，由于前者要求特殊设备和高投入，后者因施药麻烦、成本高不能大面积推广应用，且两者均对土壤生态系具有破坏作用和残留问题，致使化学防治亦不能在生产上发挥作用。如溴甲烷和威百亩等高效、广谱，但长期使用导致土壤退化和有益微生物的消亡；溴甲烷还导致大气臭氧层的破坏，联合国1997年规定2005年发达国家全面禁止其使用，至2015年，发展中国家禁用，同时威百亩等广谱熏蒸剂出于价格高的原因也不易被农民接受，目前也仅在温室等局部范围应用，还没有在大面积的田间使用。在浇灌的农药中，五氯硝基苯，苯菌灵和百菌清应用较多。据报道，每穴用300mL1000倍液的百菌清淋施，对直播大白菜的根肿病控制效果可以达到86.2%;对于移栽大白菜，控制效果可以达到71.7%，损失率控制在20%以下。然而，由于防治成本过高(每亩需要80元以上)及残留问题，在十字花科作物中还没有大量应用。一种德国产的化学肥料Perlka，其主要成分为石灰氮，也常被用来防治根肿病，但低浓度使用，防效不好，如高浓度使用，易产生药害。生物防治因对环境友好和易于使用而在其他作物病害上己部分地发挥作用。但用于根肿病这类特殊病害防治一直停滞不前。人们首先想到从土壤中分离具有抑菌活性的菌株。如从小麦、油菜、大白菜和象草地里生长的大白菜根中分离根殖真菌，663份样本中分离到了322个菌株，其中186个菌株来自小麦地里的大白菜根。它们分属18个属，2个有隔菌群，有色和淡色有隔菌约占50%。在消毒土壤中，16个菌株可以完全抑制根肿病菌，其中有两个根内生菌(//他racom',c/"eto^/m)在自然土中也能高效抑制根肿病，用它们来处理种子，植株亦很健康，而且有一个菌株还能促进植株生长。但这些菌株还没有在大田自然土中有效地应用。有人报道利用P/wmaJCM9972可以抑制根肿病休眠孢子的萌发并有效控制根肿病的发生，其主要抑菌物质为顶环氧菌素(N-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]-3-氯-4-(三氟甲基)-2,6-二硝基苯胺)，且250ug.mL-l顶环氧菌素能够完全抑制休眠孢子的萌发。在田间试验中，产生几丁质酶的放线菌泣w/;tom;;c^取AC-3与有机肥按2%的比例混合对根肿病的防治效果明显好于单用有机肥的效果，且与有机肥混用时根肿病危害程度可以减轻50%。综上所述，迄今为止，世界上尚未见到利用微生物生防制剂成功用于大田防治十字花科根肿病的报导。
发明内容本发明的目的正是为了克服上述现有技术的不足，提供一种高效、无毒、安全、无残留，对环境友好，使用简便的防治十字花科根肿病的生物制剂。本发明采用的细菌是枯草芽孢杆菌(5acz7/^^6"fo)XF-l菌株，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日2008年l月24日，保藏登记入册的编号CGMCCNO.2357。本发明的生产菌株枯草芽孢杆菌(5a"7/^犯^/to)XF-1，分离自云南省昆明市官渡区大板桥镇大白菜根际土，经形态学、培养性状、常规生理生化和Biolog全自动鉴定系统测定，该菌株为枯草芽孢杆菌的一个新菌株(Sad//^)XF-1。该菌株具有以下特征(1)在LB培养基上培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在显微镜下观察菌体短杆状，大小0.70.8X2.02.4ixm;产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊稍膨大，周生鞭毛、具运动性。(2)该菌株定殖能力强，抑菌能力强，具有杀菌、防病和增产作用。该菌还能在十字花科根际土中定殖。(3)该菌株具有以下生理生化特征革兰氏染色阳性，好氧生长；能利用糖原、蔗糖、D-乳糖、D-果糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-甘露醇、柠檬酸盐，水解明胶、淀粉、酪素，不能水解纤维素，不能水解酪氨酸，具过氧化氢酶，氧化酶活性，V.P.试验阳性，5"U下不能生长，10°C-55"C可生长。本发明是这样实现的枯草芽孢杆菌(^d/to^^'to)XF-l菌株的试管培养，摇床扩大培养，发酵培养制备为生物制剂，然后运用于十字花科作物的根际土壤中，测定其对十字花科根肿病的防治效果和十字花科作物产量。本发明生防菌株枯草芽孢杆菌(&cv7/mXF-1的培养方法(以下为重量百分比)(1)、固体培养接种于固体培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%琼脂)中，于3(TC培养箱中培养2天。(2)、液体培养把生防菌接种于装有液体培养基(黄豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%,MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOHO.1°/。，花生油0.2%，消泡剂0.01%,pH6.8-7.0。)有500ml三角瓶中，每瓶装200ml，在3(TC温度下，转速150-200rpm的摇床上培养48h，即可作为制剂。也可将上述培养液接至发酵罐中进行发酵生产，获得液体制剂。发酵罐中的生产条件罐温发酵罐中温度控制在3(TC37。C,通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。罐压发酵罐的罐压控制在0.5/平方厘米，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。搅拌发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。抽样检査和培养条件调节每隔2小时自取样管取样1次，测定pH值，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染，观察菌体是否产生芽孢等，等镜检菌体芽孢数占整个菌体的5%以上时，减少通风量和降低培养温度至25'C左右，其他条件不变，继续发酵和抽样检查，待芽孢数占整个菌体的90%以上时，停止发酵和放罐。放罐时，镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。培养周期发酵罐的培养周期约为36-48小时。液体发酵制剂经平板计数测定含菌量，含菌量达200亿CFU/ml，供田间防治根肿病之用。本发明生物制剂防治十字花科作物根肿病田间防效试验和增产试验1.制备生物制剂按前述枯草芽孢杆菌(5a"7/^^^"fc)XF-1菌株培养方法制备试验用制剂。2.生防菌XF-1液体制剂对十字花科作物大白菜(品种83-4)、白菜(品种上海青)和甘蓝型油菜(品种花油3号)的根肿病ffl间防效试验和增产试验。2.1供试药剂及处理A.生防菌XF-1液体制剂100倍稀释液采用浇根法，在播种时每株大白菜浇100毫升，每株白菜和每株甘蓝型油菜各浇50毫升；间隔10天后，再浇l次；再间隔15天浇第三次；甘蓝型油菜再间隔20天浇第四次，每株甘蓝型油菜再浇50毫升。B.生防菌XF-l液体制剂200倍稀释液采用浇根法，在播种时每株大白菜浇100毫升，每株白菜和每株甘蓝型油菜各浇50毫升；间隔10天后，再浇l次；再间隔15天浇第三次；甘蓝型油菜再间隔20天浇第四次，每株甘蓝型油菜再浇50C.生防菌XF-l液体制剂500倍稀释液采用浇根法，在播种时每株大白菜浇100毫升，每株白菜和每株甘蓝型油菜各浇50毫升；间隔10天后，再浇l次；再间隔15天浇第三次；甘蓝型油菜再间隔20天浇第四次，每株甘蓝型油菜再浇50D.对照杀菌剂75%百菌清可湿性粉500倍稀释液采用浇根法，在播种时每株大白菜浇100毫升，每株白菜和每株甘蓝型油菜各浇50毫升；间隔10天后，再浇l次；再间隔15天浇第三次；甘蓝型油菜再间隔20天浇第四次，每株甘蓝型油菜再浇50毫升。E.空白对照施用清水，采用浇根法，在播种时每株大白菜浇100毫升，每株白菜和每株甘蓝型油菜各浇50毫升；间隔10天后，再浇l次；再间隔15天浇第三次；甘蓝型油菜再间隔20天浇第四次，每株甘蓝型油菜再浇50毫升。2.2试验方法供试作物有大白菜、白菜和甘蓝型油菜，试验地点在云南省昆明市盘龙区大板桥镇复兴新村。除施药设置不同水平外，其他m间管理同常规生产。试验设5个处理，3次重复，共15个小区。小区面积20平方米，随机排列。四周高保护行，收获时每小区分开测产。2.3调査方法在白菜和白菜收获期调查病情和测定地上部生物学产量。在甘蓝型油菜收获期调查病情和测定经济学产量(油菜种子)。大白菜、白菜和甘蓝型油菜根肿病调査均以根部肿瘤的大小为依据，采用5个级别方法进行调査0级无任何肿瘤；l级主根肿大，其直径小于二倍茎基；3级主根肿大，其直径为茎基的2-3倍；5级主根肿大，其直径为茎基的3-4倍；7级主根肿大，其直径为茎基的4倍以上。死亡植株按7级计算。E(各级病穗数X相对级数值)病情指数=-----------------------------xioo调査总穗数X7防治效果计算采用与对照相比较，计算公式如下对照病情指数_处理病情指数防治效果(％)=-----------------------------X100对照病情指数3.试验结果3.1生防菌XF-1液体制剂防治大白菜根肿病的田间药效和增产试验效果表1.生防菌XF-1液体制剂防治大白根肿病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表1和表2可以看出，生防菌株XF-1液体制剂对大白菜根肿病有很好的防治效果和挽回产量的作用，其中以稀释100倍的效果最好，在收获期的防治效果仍达84.8%，灌根200倍和500倍的防治效果分别达79.2%和68.6%,明显高于常用化学农药75%百菌清可湿性粉500倍稀释液的防治效果；生防菌株XF-1液体制剂可增加大白菜产量160.3%-190.8%，明显高于75%百菌清可湿性粉500倍处理的79.4%，即产量是不用药剂空白对照的2.6-2.9倍，是75%百菌清可湿性粉500倍处理的1.5-1.6倍。3.2生防菌XF-1液体制剂防治白菜根肿病的田间药效和增产试验效果表3.生防菌XF-1液体制剂防治白菜根肿病效果病情指数总株平均病株率平均病指防治效果(%)处理重复I重复II重复III数(株)CK74.172.173.145010073.1稀释100倍10.211.410.845012.410.883.9稀释200倍13.314.513.545022.513.879.8稀释500倍21.624.323.545028.923.167.075%百菌清500倍34.335.637.94505535.949.5表4.生防菌XF-1液体制剂防治白菜根肿病的增产效果处理小区产量(kg)重复I重复IIIII折合亩产j(kg)亩增产(kg)增产率(%)CK稀释100倍稀释200倍稀释500倍75%百菌清500倍24.163.059.449.533.621.163.958.850.633.922.9757.763.12112.01354.3178.759.11970.31212.6160.050.71676.3918.6121.233.31120.0362.347.8从表3和表4可以看出，生防菌株XF-1液体制剂对白菜根肿病有很好的防治效果和挽回产量的作用，其中以稀释100倍的效果最好，在收获期的防治效果仍达83.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分别达79.8%和67.0%，明显高于常用化学农药75%百菌清可湿性粉500倍稀释液的防治效果；生防菌株XF-1液体制剂可增加大白菜产量121.2%-178.7%，明显高于75%百菌清可湿性粉500倍处理的47.8%,即产量是不用药剂空白对照的2.2-2.8倍，是75%百菌清可湿性粉500倍处理的1.5-1.9倍。3.3生防菌XF-1液体制剂防治油菜根肿病的田间药效和增产试验效果表5.生防菌XF-l液体制剂防治甘蓝型油菜根肿病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6.生防菌XF-1液体制剂防治甘蓝型油菜根肿病的增产效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表5和表6可以看出，生防菌株XF-1液体制剂对甘蓝型油菜根肿病有很好的防治效果和挽回产量的作用，其中以稀释IOO倍的效果最好，在收获期的防治效果仍达84.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分别达81.86%和74.3%，明显高于常用化学农药75%百菌清可湿性粉500倍稀释液的防治效果；生防菌株XF-1液体制剂可增加甘蓝型油菜产量105.2%-144.7%，明显高于75%百菌清可湿性粉500倍处理的44.6%，即产量是不用药剂空白对照的2.1-2.4倍，是75%百菌清可湿性粉500倍处理的1.4-1.7倍。在大白菜、白菜和甘蓝型油菜的应用结果表明，以生防菌株XF-1为基础的生防制剂具有很好的控制根肿病的效果和增产作用，己具备了生产上大量推广应用的基本条件。本发明的制剂已在云南省昆明市盘龙区大板桥镇进行了田间小区防效试验，证明该生防制剂防治效果显著、稳定，可以有效地解决长期困扰农民的十字花科根肿病的防治难题，对大白菜、白菜和甘蓝型油菜油菜根肿病的防治效果达68.6-84.8%。具体实施例方式本生防制剂可以与其他的杀真菌农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的枯草芽孢杆菌(&"7/1^^&//&)XF-l无副作用。本发明的细菌生防制剂一般在作物播种期、播种后10天、播种后25天及此后的每隔15天左右再次施用。方法是将菌液用清水稀释100-500倍液，浇灌于植株的根部。本发明具有对十字花科根肿病防治效果显著，适用于十字花科作物的生长前期和中期，其有成本低、使用简便、有效期较长等特点。下面用实施实例來进一歩详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例一将枯草芽孢杆菌(Ba"7/Mw6"fc)XF-1转到试管斜面培养基上，试管斜面培养的配方为1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl，1.5%琼脂，pH7.0。在30。C的培养箱中培养2天，获得试管种。液体发酵培养基配方黄豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡剂0.01%，pH6.8-7.0;将试管种接种到500ral三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，在30'C下，转速为150rpm的摇床上培养48h，所得培养液即为本发明的生物制剂。实施例二首先将获得试管种(同实施例一)，将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为黄豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%,蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(Iffl4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%，消泡剂0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，转速为180rpm的摇床上培养48h，所得培养液即为本发明的生物制剂。实施例三首先将获得试管种(同实施例一)，将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为黄豆粉2.0%,玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%,花生油0.2%，消泡剂0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，转速为200rpm的摇床上培养48h，所得培养液转接至发酵罐中进行发酵生产，获得发酵液即为本发明的生物制剂。发酵罐中的生产条件罐温发酵罐中温度控制在3(TC37"C,通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。罐压发酵罐的罐压控制在0.5/平方厘米，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。搅拌发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。抽样检査和培养条件调节每隔2小时自取样管取样1次，测定pH值，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染，观察菌体是否产生芽孢等，等镜检菌体芽孢数占整个菌体的5%以上时，减少通风量和降低培养温度至25'C左右，其他条件不变，继续发酵和抽样检査，待芽孢数占整个菌体的90%以上时，停止发酵和放罐。放罐时，镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。培养周期发酵罐的培养周期约为36-48小时。权利要求1、一种防治十字花科根肿病的生物制剂，其特征在于该制剂的生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)XF-1，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2008年1月24日，保藏号CGMCCNO.2357。2、权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Sac!7/^幼6"fc)XF-1，菌株的培养方法，其特征在于所述菌株是经过常规的液体和固体发酵培养获得的，其液体和固体发酵培养基配方如下(1)液体发酵培养基配方黄豆粉2.0%，玉米粉1.0%,葡萄糖0.3%，蛋白胨O.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡剂0.01%,pH6.8-7.0;(2)固体发酵培养基配方1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%琼脂pH6.8—7.0。3、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(&"7/^^^)XF-l菌株在防治十字花科根肿病中的应用。全文摘要本发明涉及一种防治十字花科根肿病的生物制剂及其应用，属生物农药
技术领域：
。其生产菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillussubtilis)XF-1菌株，保藏号CGMCCNO.2357。该菌株有以下特征(1)在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面干皱；在显微镜下观察菌体短杆状，有芽孢，周鞭、能运动，大小0.7～0.8×2.0～2.4μm。(2)革兰氏阳性，好氧；利用糖原、蔗糖、柠檬酸盐，水解明胶、淀粉、酪素，不利用纤维素和酪氨酸，过氧化氢酶阳性。(3)有杀菌、防病和增产作用。本发明是这样实现的解淀粉芽孢杆菌XF-1菌株的试管和摇床培养以及发酵培养液制备为生物制剂，然后施用于十字花科作物根际土壤中，有很好的防治和增产效果，易于工厂生产。文档编号C12N1/20GK101416641SQ200810058919公开日2009年4月29日申请日期2008年9月12日优先权日2008年9月12日发明者何月秋,熊国如,范成明申请人:云南农业大学