十字花科蔬菜根肿病菌荧光定量pcr检测技术及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种根肿菌的荧光定量PCR检测技术及应用。用于快速准确地对十字花科蔬菜根肿病菌进行定量检测。该技术包括如下步骤：样本中DNA提取，特异性引物设计，应用以SYBRGreenI为基础的染料法荧光定量PCR检测技术对根肿菌的ITS区基因片段进行实时荧光定量PCR检测，构建标准曲线，计算待测样本中的ITS区基因片段拷贝数和根肿病菌的浓度。该检测技术操作简便、快速；特异性强、灵敏度高；检测灵敏度最高可达到24个拷贝数每个反应，并且可以同时进行大批量的样本分析。为病害的早期预测预报提供了良好的基础，因此，该方法适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。
【专利说明】十字花科蔬菜根肿病菌荧光定量PCR检测技术及应用
【技术领域】
[0001]本发明为一种十字花科蔬菜根肿病菌的荧光定量PCR检测技术及应用，专用于检测十字花科蔬菜根肿病菌，属于农作物病害诊断与防治【技术领域】。
【背景技术】
[0002]芸薹根肿菌feassicae)引起十字花科蔬菜的根肿病，主要寄生于芸苔属多种植株的根部。在全世界均有分布，近年来其危害范围从十字花科蔬菜扩展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100个种(变种)以上。根肿病每年造成的世界范围内的损失达到10-15%。感病植株被根肿菌侵染后形成根肿组织，植株矮小、易萎蔫(Voorips,1995) 0病原菌从腐烂的根肿组织中释放出来形成休眠孢子能够存活很多年(ffalIenhammar, 1996)。根肿菌休眠孢子萌发和侵染的最适土温为18~25°C,最适土壤持水量为70%，最适土壤酸碱度为5.4~6.5 (李宝聚，2008)。根肿菌休眠孢子在感病寄主根系分泌物的溶液中萌发率可以达到75% (肖崇刚，2002)。在芸薹属植株重复种植的过程中这些休眠孢子在土壤中逐渐积累，病害程度逐年加重(Robert等2009)。
[0003]在病害症状明显表现之前不容易预测和避免根肿病菌的侵染，甚至在农民认为没有根肿病侵染或田间无病菌 的情况下，根肿菌的休眠孢子已经悄无声息地从一个地方的土壤以及水中传播到另一个地方，由于上述种种原因导致十字花科蔬菜根肿病的防治十分困难，因此，发展有效且快速的十字花科根肿病菌检测技术，有效的避免该病的蔓延和传播，对于十字花科根肿病的防治具有十分重要的意义。
[0004]由于根肿病菌不能直接培养，它的常规土壤检测依赖于感病植株的生测实验，或者通过根部的症状直接评估，或者通过显微镜检测根肿菌侵染情况(Toxopeus等1975)。近来，荧光显微镜，免疫学和建立在DNA基础上的检测方法逐渐应用于检测土壤，水或植株样品中的根肿菌。这些检测方法不够快速，并且不能对植株、水以及土壤样品中的根肿菌进行定量，随着分子诊断技术在医学、畜牧学以及植物病理学的广泛应用，并且一方面从诊断单一靶标到双重以及多重PCR方向发展，另一方面从定性PCR向实时荧光定量PCR(RT1-PCR)方向发展，这为我们对植株、土壤以及水中根肿菌的快速检测提供了强有力的基础。
[0005]RT-PCR是通过PCR在指数扩增期间连续检测荧光信号的强弱来即时检测特异性产物的量，并据此评估目的基因的起始模板量。与常规PCR相比，具有操作简便、高效快速、敏感性强、可重复性好和特异性高的优点。SYBR Green I荧光定量PCR的工作原理是在常规PCR的体系中加入荧光染料SYBR Green I，SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。在PCR反应体系中加入过量的SYBRGreen I荧光染料，荧光染料能够特异性地掺入到DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的荧光染料分子不发射任何荧光信号。从而随着PCR反应的进行，保证荧光信号的增强与PCR产物增加完全同步，信号增强到某一阈值的循环次数(用循环阈值Ct表示)被记录下来，Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增的Ct值和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确计算出起始模板中某核酸的存在及数量。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服根肿菌传统检测方法的不足，提供一种根肿菌的荧光定量PCR快速检测的方法。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR检测技术在十字花科蔬菜根肿病流行监测预报，土壤带菌以及种子带菌检测方面的应用。
[0008]该检测技术，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。
[0009]本发明的目的通过以下技术方案实现:
该方法的实验步骤为:从待测样本提取DNA ;将加入标准品及待测样品的荧光定量反应液上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据标准曲线计算出待测样品的起始DNA浓度。
[0010]本发明的技术具体包括如下步骤:
1、取田间自然发病土壤、发病植株、十字花科蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；
2、特异性引物设计，为避免由于引物专化性较低，PCR反应中出现假阳性结果或对非目标真菌产生非特异性扩增，本发明在系统分析根肿病菌的ITS区、18SrRNA和5.8 SrRNA核酸序列系统发育的基础上，采用CLUSTAL，与根肿菌纲及土传病原菌的该区序列进行比较，寻找根肿病菌的特异性序列区域；选择根肿病菌特异性序列区域，设计实时突光 PCR 弓丨物，通过 Blast pogram (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比较所设计的引物序列与其它生物种没有显著同源性。引物对1，正义引物序列为:(5’ -TCTTGCGTGTCGCTGTATTC-3’)，反义引物序列为:(5’ -ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3’)，扩增片段大小为137bp (图1);引物对2，正义引物序列为:(CTCACAACGATGAAGAAC)，反义引物序列为:(5’-ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3’)，扩增片段大小为 140bp (图 2)。
[0011]Plasmodi ophora brassicae 18S rRNA、ITSl、5.8S rRNA 和 ITS2 部分序列 NCBI 登录号分别为(HM015883.1)和(EF195335.1)。
[0012]3、实时荧光定量PCR反应体系为:荧光定量PCR反应体系总体积为25μ1，其中SYBR Premix Ex Taq (内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I )12.5μ1，浓度为10Mmol/L的正义引物PBF2 (PBF3)和反义引物PBR2 (PBR3)各0.5μ1，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2μ1，ddH20补齐至25μ1 ；
4、PCR反应程序为:PCR采用两步法，950C3min,接着进行40个循环，每个循环包括950C IOs,60 0C 30s ;PCR完成后，按0.1°C s—1升温速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证；
5、插入ITS区的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计Α260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；
6、取步骤I)中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH20，阳性对照采用质粒基因组DNA ;反应结束后，将DNA样本的循环阈值(Ct)与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓度。
[0013] 十字花科蔬菜根肿病菌实时荧光定量PCR检测技术可以生成试剂盒包括标准阳性DNA模板、荧光定量反应液。
[0014]标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T (购自天根公司)载体制备而成。标准品的制备过程为:采用引物ITSl和ITS4扩增根肿病菌的ITS区，PCR产物电泳后切下含有目标片段的凝胶，目标片段用凝胶试剂盒回收纯化后与PGM-T载体16°C过夜连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。转化产物涂平板培养，挑去白斑，采用引物为GZ10/GZ11和PBF2/PBR2以及PBF3/PBF3进行PCR鉴定。阳性克隆通过序列分析进一步鉴定结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为阳性的克隆，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，采用质粒小提试剂盒(购自天根公司)制备质粒DNA。DNA经紫外分光光度计A260定量，经10 倍梯度稀释为 104ng-104fg/ μ L 和 216ng_216fg/ μ L，保存于 _20°C。
[0015]荧光定量反应液由正义引物PBF2、反义引物PBR2、荧光染料SYBR Premix Ex Taq内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 组成。
[0016]荧光定量反应液由正义引物PBF3、反义引物PBR3、荧光染料SYBR Premix Ex Taq内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 组成。
[0017]本发明提供的根肿病菌荧光定量PCR检测技术，针对根肿病菌基因组ITS区特异的靶序列设计引物，通过优化反应体系(引物浓度、扩增程序等)的优化，采用定量检测系统(包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad),可用于各种来源的根肿病菌的定量检测。弓丨物对I的检测限点为1.04fg质粒DNA/μ I相当于24个细胞，引物对2的检测限点为2.16fg质粒DNA/μ I相当于45个细胞。
[0018]本发明与现有技术相比具有以下优点和效果:
I)特异性好、鉴定快速
引物包括根肿菌的特异性序列，检测特异性高。环境中，特别是十字花科蔬菜的根际微生物种类繁多，根肿菌为严格的专性寄生菌，不能离体培养，因此，不能采用传统的分离培养的方法检测，本发明克服了这一不足之处，并且检测快速。
[0019]2)准确定量、灵敏度高
与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量，目标DNA在KMng-KMfg/yL浓度范围内，都有良好的线性关系；同时检测具有重复性好的特点。
[0020]3)实用性好、应用范围广
可以定量检测植物植株、土壤、种子以及水中的根肿菌，结合十字花科蔬菜根肿病的田间发病阈值，可以为病害的早期预测预报提供有力参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是引物对PBF2/PBR2特异性检测PCR扩增结果。1，2的模板为白菜肿根基因组DNA，3-10的模板分别为马铃薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢镰刀菌DNA、辣椒疫霉菌DNA、瓜果腐霉菌DNA、立枯丝核菌DNA、半裸镰刀菌DNA、串珠镰刀菌DNA，M为150bp DNAladder (Takara 公司)。[0022]图2是引物对PBF3/PBR3特异性检测PCR扩增结果。I的模板为白菜肿根基因组DNA，2-9的模板分别为马铃薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢镰刀菌DNA、辣椒疫霉菌DNA、瓜果腐霉菌DNA、立枯丝核菌DNA、半裸镰刀菌DNA、串珠镰刀菌DNA，M为150bp DNAladder (Takara 公司)。
[0023]图3实施例2荧光定量PCR扩增的标准曲线，纵轴为Ct，横轴为Log CO ;标准误为
0.995。
[0024]图4实施例2荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线，纵轴为Delta Rn ；横轴为Cycle Number,曲线1，2，3，4，5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为
1.04ng, 104pg, 10.4pg, 1.04pg, 104fg, 10.4fg。
[0025]图5实施例3荧光定量PCR的扩增曲线，纵轴为Delta Rn ;横轴为Cycle Number,曲线1，2，3，4，5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为1.04ng, 104pg,10.4pg，1.04pg，104fg, 10.4fg ；7 和 8 是待测样品。
[0026]图6实施例4荧光定量PCR扩增的标准曲线，纵轴为Ct，横轴为Log CO ;标准误为
0.999。
[0027]图7实施例4荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线，纵轴为Delta Rn ;横轴为Cycle Number,曲线1，2，3，4，5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为
2.16ng, 216pg, 21.6pg, 2.16pg, 216fg, 21.6fg。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实例，进一步阐述发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。应用实例中DNA提取采用的是试剂盒，实际应用中也可以采用改良CTAB等方法。
[0029]实施例1:根肿病菌的特异性引物检测
采用十字花科蔬菜作物根际微生物中常见的土传病原菌为材料，对根肿病菌引物对PBF2/PBR2和PBF3/PBR3进行特异性检测。白菜肿根于_20°C冰箱中保存。其它土传病原真菌菌株用PDA或H)液体培养基培养。所有菌株先在固体培养基上活化，然后转入液体培养基培养，I周后收集菌丝或菌体提取DNA。DNA的提取采用改良的CTAB提取法。
[0030]以芸薹根肿菌及其它土传病害的病原菌真菌基因组DNA为模板，利用引物PBF2/PBR2进行普通PCR扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下:总反应体积25 μ L, 10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP (10 μ mol/L) 0.5 μ L，引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L，模板DNA 2.0μ L, TapDNA聚合酶(λ 5 μ L，最后以ddH20补足至25 μ L。PCR反应程序为:94°C预变性3min ;94°C变性30s，60。。退火lmin，72°C延伸1.5min，共38个循环；72°C延伸7 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测(图1)。
[0031]利用引物PBF3/PBR3进行普通PCR扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下:总反应体积 25μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP (10 μ mol/L) 0.5 μ L，引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L，模板 DNA2.0 μ L，TapDNA 聚合酶 0.5 μ L，最后以 ddH20 补足至 25μ L。PCR 反应程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，57。。退火 lmin，72°C延伸 1.5min，共35个循环；72°C延伸7 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测(图2)。
[0032]表1引物特异性检测菌株
【权利要求】
1.一种十字花科蔬菜根肿病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤: 取田间自然发病土壤、发病植株、十字花科蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本； 特异性引物设计，在系统分析根肿病菌的ITS区、18SrRNA和5.8rRNA核酸序列系统发育的基础上，采用CLUSTAL，与根肿菌纲及土传病原菌的该区序列进行比较，寻找根肿病菌的特异性序列区域，设计特异性引物对I (PBF2/PBR2)，引物对2 (PBF3/PBR3)，所述的引物对为:
弓 I物对 I 正向引物 5’ -CTTGCGTGTCGCTGTATTC-3’ 反向引物 5’-ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3’ ； 引物对 2 正向引物 5’ -CTCACAACGATGAAGAAC-3’
反向引物 5’ -ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3’ 3)实时荧光定量PCR反应体系为:荧光定量PCR反应体系总体积为25μ1，其中SYBRPremix Ex Taq(内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture, Mg2+和 SYBR Green I )12.5μ1，浓度为10Mmol/L的正义引物PBF2 (PBF3)和反义引物PBR2 (PBR3)各0.5μ1，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2μ1，ddH20补齐至25μ1 ； 4)PCR反应程序为:PCR采用两步法，950C 3min，接着进行40个循环，每个循环包括950C IOs,60 0C 30s ;PCR完成后，按0.1°C s—1升温速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证； 5)插入ITS区的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计Α260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线； 6)取步骤I)中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH20，阳性对照采用根肿菌菌株基因组DNA ;反应结束后，将DNA样本的循环阈值(Ct)与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓度。
2.权利要求书I所述的检测十字花科蔬菜根肿病的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化的试剂盒，试剂盒包括:正义引物PBF2、反义引物PBR2 (正义引物PBF3、反义引物PBR3)、荧光染料 SYBR Premix Ex Taq 内含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture, Mg2+和SYBR Green 1、以及由插入ITS区的pMD_20载体转化大肠杆菌DH5 α增殖后提取的质粒DNA, DNA经紫外分光光度计Α260定量并10倍梯度稀释。
3 .该技术可以应用于对农田环境中，包括对土壤中越冬菌量和十字花科蔬菜植株上根肿病菌进行实时监测，以及检测十字花科蔬菜种子带菌和田间灌溉水中的根肿病菌。
【文档编号】C12Q1/68GK103966307SQ201310044418
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】谢学文, 李金萍, 李宝聚, 石延霞, 柴阿丽 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所