一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记及其应用，特别设 及与芸臺根肿菌2号和7号生理小种抗性相关的InDel分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 十字花科植物根肿病是鞭毛菌亚口芸臺根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的一种±传真菌病害，是十字花科植物的重要根部病害。该病最早发现于 1737年英国地中海西岸和欧洲南部。目前，在欧洲、北美和亚洲的日本等地已成为一种主要 病害，给十字花科蔬菜生产造成了严重的威胁，现全世界均有分布，尤W溫带地区发生更为 严重。近年来，十字花科根肿病在我国的东北地区、西南地区、长江中上游地区W及山东青 岛等地迅速扩大，危害十分严重，严重制约着我国十字花科蔬菜产业的发展。
[0003] 我国自1955年首次发现根肿病W来，现已扩散至全国各地。据不完全统计，仅大白 菜在全国的发病面积已超过200万亩，且危害面积逐年增加。自从1931年报道了根肿菌存在 小种分化后，各国学者利用根肿菌对不同寄主的抗感反应，划分出不同的生理小种，目前在 国际上比较公认的有Williams和欧洲鉴别系统化CD)。2009年，沈向群等率先采用Williams 鉴别系统对采自迂宁、吉林、山东和四川等15个地区的根肿菌进行了鉴定，认为11个地区的 根肿菌主要W4号生理小种为主，同时发现2、7、10和11号生理小种各一个。国内关于采用欧 洲ECD鉴别系统的研究还未见报道，其原因主要是国内尚无完整的ECD鉴别寄主。根肿病虽 然可采用化学药剂和加强栽培管理等防治方法，但防治效果并不理想。选育和种植具有持 久抗性的品种，是防治大白菜根肿病最经济有效的措施。
[0004] 近年来迅速发展起来的分子标记辅助选择(Maker-assisted seleetion，MAS)技 术为分子育种提供了崭新的途径。运种技术的基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现 共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域W及全基因组筛选，从而减少连锁累寶， 获得期望的个体，达到提高育种效率的目的（Dudley J W et al.，1993;Melchinger et al.，1990)。迄今，共有8个抗根肿病基因定位于大白菜不同连锁群化irai et al. ,2004; Piao et al.，2004;Suwabe et al.，2006;Hayashida et al.，2008;Sakamoto et al.， 2008)DPiao等(2004)利用两个侧翼标记TCROl和TCR09,将对根肿病生理小种2、4和8表现抗 性的CRb基因定位于A03连锁群，标记间的遗传距离为2.9cM。2个侧翼标记同时应用可W显 著提高选择的准确性，并且共显性标记TCR01能够准确鉴定出纯合抗性植株（Piao等， 2007)。朴钟云等（2010)?具有抗根肿病基因 CRb的大白菜'CR化inki i DH'为抗源，通过 连续多代选择筛选出全部恢复' BJN3 '基因组的9株近等基因系。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴别大白菜是否为抗根肿病的大白菜。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记，该 分子标记在大白菜A03染色体上，由201个核巧酸组成，其核巧酸序列如SEQ ID No. 1的第 32-232位所不。
[0007]本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了特异引物对，由正向 引物和反向引物组成。
[000引上述正向引物为如下al)或曰2):
[0009] al)沈Q ID齡.2所示的单链0臟分子。
[0010] a2)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与al)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
[00川上述反向引物为如下bl)或b2):
[0012] bl)SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
[0013] b2)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
[0014] 其中，上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3'末端碱 基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
[0015] 本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了一种鉴别或辅助鉴 别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法。
[0016] 上述方法包括如下步骤：W待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，WSEQ ID No. 2所 示的单链DNA为正向引物，SEQ ID No.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测扩增产 物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别大白菜是否为抗根肿病大白 菜:如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为2(Ubp的条带，所述待鉴别大白菜为抗 根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜;如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小为 201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
[0017] 上述方法中，所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为2(Ubp的条带为所述待 鉴别大白菜的扩增产物中仅含有一条大小为2(Ubp的条带或所述待鉴别大白菜的扩增产物 中含有两条条带，所述两条条带中一条条带大小为2(Ubp，另一条条带大小为23化P。
[0018] 上述方法中，所述大小为201bp的条带为抗根肿病亲本大白菜带型；所述大小为 237bp的条带为感根肿病亲本大白菜带型。
[0019] 上述方法中，确定所述PCR扩增产物的大小是通过凝胶电泳实现的;所述凝胶电泳 为2-3%的琼脂糖凝胶电泳，具体为2%、2.5%或3%的琼脂糖凝胶电泳。
[0020] 本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了另一种鉴别或辅助 鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，为检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有 SEQ ID No.l的第32-232位所示的2(Ubp的DNA片段;如果待鉴别大白菜的基因组DNA中含有 SEQ ID No.l的第32-232位所示的2(Ubp的DNA片段，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜 或候选抗根肿病大白菜;如果待鉴别大白菜的基因组DNA中不含有SEQ ID No. 1的第32-232 位所示的2(Ubp的DM片段，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白 菜。
[0021] 上述方法中，所述检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有SEQ ID No. 1的第 32-232位所示的2(Ubp的DNA片段的方法包括：W待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，WSEQ IDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反向引物，进行PCR扩 增，检测得到的扩增产物的序列。
[0022] 上述方法中，检测所述得到的扩增产物的方法为测序。
[0023] 上述方法中，所述扩增为PCR扩增。
[0024] 在本发明实施例中，所述PCR扩增采用的PCR反应程序为:94°C预变性5min;94°C变 性 40s，56°C 退火 40s，72°C 延伸 40s，35 个循环;72°C 延伸 7min。
[0025] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法的用途，所述用途为下述1)-4) 中任意一种：
[0026] 1)在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；
[0027] 2)在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；
[0028] 3)大白菜育种中的应用；
[0029] 4)预测大白菜根肿病抗性中的应用。