脑卒中的miRNA分子标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体的设及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用，更 具体的设及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。
【背景技术】
[0002] 脑卒中是一个症候群，包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。众所周知，脑卒中一旦 发生，死亡率极高，而且存活后的残废率高达70%，且复发率极高。根据卫生部公布的统计 资料，目前中国约有600万脑卒中残存者，每年新发病例150万，而且发病逐渐年轻化。连续 几年来，屯、脑血管疾病的死亡构成居各类疾病的第一位，占死亡构成的40% W上。而其中单 独脑卒中一项的发病率和死亡率一直居第二位，占各类疾病死亡的20 % W上。脑卒中传统 的危险因素包括年龄、高血压、吸烟、饮酒、糖尿病、高血脂及冠屯、病史等，但运些传统危险 因素只能解释约50%的脑卒中发病，提示存在其它危险因素，如遗传危险因素。寻找脑卒中 的致病基因，从分子水平掲示脑卒中的发病机理，可为及早发现脑卒中的危险人群、预防脑 卒中的发生提供帮助。
[0003] miRNAs是内源性非编码的约20-25个核巧酸单链RNA分子。通过结合到相应mRNA3 '非翻译区，诱导mRNA降解或抑制其翻译。miRNAs被报道在多种病理和生理过程发挥关键作 用，包括细胞增殖，调亡，细胞分化，屯、血管疾病，神经障碍和癌症等。
[0004] 本发明通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整 合分析，选取后备miRNA进行分子生物学验证，RT-PCR结果显示，本发明提供的miR-4330和 脑卒中密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供mir-4330和/或其成熟miRNA在制备预防、诊断和/或治疗 脑卒中试剂中的应用。mir-4330的序列见序列表SEQ ID NO Umir-4330的成熟miRNA为 miR-4330其序列见序列表沈Q ID NO 2。
[0006] 进一步，预防、诊断脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法 和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫检 测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的祀基因的表达情况，优选采用nodhern杂交方 法、miRNA表达谱忍片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、检测脑卒中样本中mir-4330 和/或miR-4330的转录;采用化ISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的 祀基因的表达情况。
[0007] 优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物;所述 的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针;所述免疫检 测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
[000引进一步，检测外周血中mir-4330和/或miR-4330的转录或miR-4330调控的祀基因 的表达情况。
[0009] 进一步，所述的治疗脑卒中试剂包括抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/ 或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
[0010] 优选的，采用反义寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核巧酸的方法下调mi;r-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断 miR-4330的活性。
[0011] 本发明的目的还在于提供一种抑制脑卒中试剂，所述抑制脑卒中试剂包含：
[0012] (a)抑制剂和/或抑制剂组合物，所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330 和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性；
[OOU] (b)药剂学上能接受的载体。
[0014] 优选的，采用反义寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核巧酸的方法下调mi;r-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断 miR-4330的活性。
[0015] 本发明的目的还在于提供一种脑卒中诊断试剂，所述脑卒中诊断试剂能够检测脑 卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调 控的祀基因的表达情况。
[0016] 优选的，所述脑卒中诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫方法检测 脑卒中样本中miR-4330调控的祀基因的表达情况，优选采用nodhern杂交方法、miRNA表达 谱忍片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测脑卒中样本中 mir-4330和/或miR-4330的转录；采用化ISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR- 4330调控的祀基因的表达情况。
[0017] 更优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引 物;所述的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针;所述 免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
[001引定义；
[0019] 现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核巧酸 杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法， 不需要对样本RNA进行预扩增，包括nodhern杂交方法、miRNA表达谱忍片、核酶保护分析技 术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
[0020] (l)No;rthe;rn 杂交
[0021 ]又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基 本原理如下：首先在载体(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂 交，洗涂多余的杂交探针后进行信号检测；也可W在载体上先固定与祀miRNA序列互补的 DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素 标记、巧光标记和纳米金标记等。
[0022] (2)miRNA表达谱忍片
[0023] 原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计忍片上miRNA 基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因忍片具有高通量的优 点，可W-次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相忍片 (Xiquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi anal}fte suspension array,MSA)，是出的新 一代生物忍片技术。液相忍片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不 同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的 色彩编号，将运些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相忍片系统。该系统可W对同 一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，运种检测技术被称为 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极 快。
[0024] (3)核酶保护分析技术(RPA)
[00巧]miRNA的检测还可W采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混 合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受 保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。运种基于液相杂交的新方法简单 快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0026] (4)RAKE法
[0027] RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基 础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可W敏感 特异地检测miRNA,适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中 检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可W从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中 分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之口。
[00巧](5)原位杂交（in situ hybridization)
[0029] 原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的 方法，常标记方式包括地高辛、生物素、巧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交化ocked Nucleic Aci(KLNA)based in situ hyb;ridization(LNA-I甜））是当前应用较多的探针方 式。
[0030] (6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow c}ftomet;ry)
[0031] 是一种液相忍片技术，该方法将流式细胞检测与忍片技术有机地结合起来，兼有 通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
[0032] (7)实时巧光定量PCR技术(Realtime PCR，RT-PCR)
[0033] 巧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反 应混合体系中祀序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用 特定阔值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此 短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种 理想的m