面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可W理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0化4] 实施例1NCBI GE0数据检索
[0055] 限制研究类型为 "expression prof i 1 ing by array"、"Non-coding RNA profiling by array"符合W下标准的数据集将纳入我们的研究中：
[0056] ①所选数据集必须为全基因组的mRNA转录组数据或miRNA表达数据；
[0057] ②运些数据来自于脑卒中病例组和对照组的血液样本(无药物刺激或被转染）；
[0058] ③本研究均考虑经标准化或者原始数据集；
[0059] 经筛选得到2套脑卒中高通量mRNA数据集和1套高通量miRNA数据集。
[0060] 通过转录组数据分析软件对miRNA及mRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得 至化值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA及mRNA。设定P<0.01，共筛选出 16个差异表达的miRNA，其中表达水平上调的miRNA13个，表达水平下调的miRNA 3个，其中 hsa-miR-4330上调表达明显，进入我们的研究范围。同时，在脑卒中病中hsa-miR-4330预测 祀基因有：ABCF2，LRPPRC，CDK6，WDR5，KLF12，ΚΤΠ 2，EARS2，6-Sep，C2CD2，SLC25A42， ST6GALNAC6，ILF3，IVD，MFGE8，ZNF589，PDE4D，TRMTl3，ANKRD16，細Q1，PRKX，ZNF250， MRPS26，SNXl，UROS，C21orf2，ZNFIO，N0L9，抓C3，C2orf44，CSRNP2，CASK，R醒T，TMEM261， SEC22C，CBFA2T2，SNX29，PRE化，S册PXD2A，RNFl44A，RIMS3，ZBTB5。
[0061] 实施例2样品的收集及总RNA提取
[0062] 46例脑卒中患者及31例健康人群对照均来自医院（2014年1月-2015年9月），抽取 他们的外周血，400化pm离屯、分离血浆加 TRIzoI试剂（1: 3)并保持在-80°C直至进行RNA提 取。所有受试者均签署了知情同意书。
[0063] 1RNA提取方法
[0064] 1)解冻含TRIzoI试剂的血浆，震荡后静止5分钟。
[0065] 2)加氯仿(Ξ氯甲烧0.2ml)，剧烈震荡30秒，静止15分钟。
[0066] 3)离屯、15分钟（12000邑，15分钟、4°〇。
[0067] 4)取上清，加异丙醇(0.5ml)剧烈震荡，静止10分钟。
[006引 5)离屯、10分钟（12000g，10分钟，4°C)，然后弃上清。
[0069] 6)加75 %去污乙醇1ml (无水乙醇用DEPC处理的去离子水配，无水乙醇:DEPC水= 3:1)。用震荡器震荡0.5分钟。
[0070] 7)离屯、5分钟(7500g，5分钟，4°C)弃上清，倒扣于卫生纸上片刻后正置5分钟。
[0071] 8)加加1 DEPC-出0手掌离屯、机瞬时离屯、，60°C水浴10分钟。
[0072] 9)测浓度，用RNA浓度测量仪器。
[0073] 2逆转录
[0074] 1)逆转录配制:每个EP管加去离子水水14ul，IUprimemiX 4ul，RNAl-3ul。
[0075] 2)70°C 水浴 10 分钟。
[0076] 3)冰上制冷2分钟。
[0077] 4)加入2 X tsmix 25ul，TS(逆转录酶)2.5ul，去离子水3.加1，离屯、摇匀，行RT逆转 录cDNA。
[0078] 实施例3Rea^time PCR检测脑卒中组和对照组miR-4330的表达 [00巧]巧光定量PCR
[0080] RT-PCR体系的配制：
[0081]
[0082] miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，WsnRNA U6作为内参。
[0083] PCR 程序：
[0084] 95°C10min;40个循环(95°C10s，60°C30s)。循环结束后利用烙解曲线检测产物特 异性:从60°C缓慢升溫至97°C，每°0采集5次巧光信号。
[0085] 统计学分析
[0086] 采用化iginProS.l软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，P<0.05(差异 显著)和P<0.01(差异非常显著）定为有统计学意义，分析脑卒中和正常对照样本中外周血 miR-4330表达水平，结果显示脑卒中组中miR-4330的表达明显高于正组织，前者是后者的 约1.4倍，具体见图1。
[0087] 实施例4 一种检测脑卒中的试剂盒
[0088] 巧光定量PCR
[0089] RT-PCR体系的配制：
[0090]
[0091] miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，WsnRNA U6作为内参。
[0092] 虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各 种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来 使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
[0093] 因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案;相反地， 本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
【主权项】
1. mir-4330和/或miR-4330在制备预防、诊断和/或治疗脑卒中试剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预防、诊断脑卒中试剂包括基于高通量测 序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或 miR-4330的转录或基于免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情 况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交 检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑 卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物;基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列 杂交的探针;免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测脑卒中样本为外周血。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，治疗脑卒中试剂包括抑制剂和/或抑制剂 组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海 绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或 miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。7. -种抑制脑卒中试剂，其特征在于，抑制脑卒中试剂包含： (a) 抑制剂和/或抑制剂组合物，所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或 miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性； (b) 药剂学上能接受的载体。8. 根据权利要求7所述的抑制脑卒中试剂，其特征在于，反义寡核苷酸、antagomiRs、 miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330 和 / 或miR-4330 的转录和 / 或阻断miR-4330 的活性。9. 一种脑卒中诊断试剂，其特征在于，脑卒中诊断试剂能够检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表 达情况。10. 根据权利要求9所述的脑卒中诊断试剂，其特征在于，所述脑卒中诊断试剂基于高 通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330 和/或miR-4330的转录或基于免疫方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情 况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交 检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑 卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
【专利摘要】本发明涉及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用，更具体的涉及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。发明通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析，选取后备miRNA进行分子生物学验证，RT-PCR结果显示，本发明提供的miR-4330和脑卒中密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
【IPC分类】A61P9/10, A61K31/7088, C12Q1/68, A61K48/00, A61K45/00
【公开号】CN105543389
【申请号】CN201610077599
【发明人】何文贞, 陈思洽, 陈显光, 李舜贤, 陈文杰
【申请人】汕头大学医学院第一附属医院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月3日