基于21个线粒体snp位点的法医学快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于法医学领域，具体设及一种基于21个线粒体SNP位点的法医学快速检 测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 法医DNA分析是应用现代DNA分析技术，分析DNA遗传标记在群体中的分布与传递 规律，确定分析样品的一致性与遗传关系，为侦查破案和司法审判提供证据的一口科学技 术。其分析对象主要设及人体各种体液(斑）、组织、毛发W及表皮脱落细胞等。法医DNA分析 的主要任务是个体识别与亲子鉴定。目前法医DNA分析中用于个体识别的试剂盒主要有两 类:一类基于短串联重复序列（shod tendem repeat，STR)分型技术；另一类基于SNP分析 技术。
[0003] STR广泛存在于人类基因组中，具有高度多态性。对于一个特定的个体，染色体上 某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次 数可能不同，运就构成了人群中运些重复序列的多态性。由于人类基因组中运种重复序列 非常多，通过对运种多态性的检测，就可W明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘 关系。联合应用16个STR位点，其个体识别率可达0.999。尽管STR分型技术具有很高的灵敏 性与可靠性，然而其在法医学领域中的应用仍然具有一定程度的局限性。一方面，在实际检 案工作中，生物性检材中的DNA分子经常由于潮湿、暴晒W及其他环境因素的影响而发生断 裂、损坏、部分丢失，从而无法进行有效的STR分型。为解决此问题发展出的小片段短串联重 复序列(miniSTR)分型技术所能分析的DNA片段长度范围也只能缩小到80~15化P，对于长 度更小的高度降解DNA片段，该技术仍具有一定局限性。另一方面，由于受到片段长度和巧 光染料种类的限制，在一个符合扩增体系中能够同时扩增的STR基因座数量多为4个，要达 到个体识别效能，必须进行多系统的复合扩增，运就使得该技术在微量检材的应用中受到 限制。
[0004] 单核巧酸多态性（Single Nucleotide化lymo巧Msm，SNP)被称为"第Ξ代DNA遗 传标记"，与被称为"第二代遗传标记"的STR相比具有截然不同的特点:分布密集、数量庞大 (在人类基因组中被认为有300万个W上的SNP遗传标记，运可能达到了人类基因组多态位 点数目的极限）、频率高、属二态性标记、存在相对稳定，因此被认为是应用前景最好的遗传 标记物。与上述基于STR分型技术的法医学检测试剂盒相比，基于SNP分析技术的试剂盒具 有W下优势:第一，SNP的PCR产物长度较短，更适用于高度降解的DNA检材;第二，SNP检测过 程更容易建立复合扩增体系，简化检测程序。微测序法(或称Snapshot)是SNP位点分析技术 中的常用检验方法。微测序包括Ξ个基本步骤:第一，PCR扩增包括SNP位点在内的区域，使 扩增产物大量增加;第二，利用SNP延伸引物W及四种巧光标记的ddNTPs混合物进行单碱基 延伸反应;第Ξ，利用遗传分析仪W及GeneScan或Genemapper ID软件对延伸产物进行检测 和分析。已建立的人线粒体SNP检测系统，往往通过增加 SNP位点的数目来提高其个体识别 效能与个体识别的覆盖范围，大约需要50~100个SNP位点才能获得相当于10~16个STR基 因座的识别能力和解决混合结果的能力。目前能够涵盖中国主要人群的检测系统中的SNP 数目通常在50 W上，由于其选择的SNP位点数目较多，多数分为两组或Ξ组检测，运不仅使 检测过程更加复杂，同时增加了检测成本W及对待检测样本的需求量。而SNP位点数目小于 30个的检测系统多数只针对某一特定民族无法实现对其他民族人群的普适性;并且其选择 的SNP位点集中于线粒体编码区或控制区之一，个体识别效能相对较低。例如，中国专利申 请201410145409.2公开了一种可W同时检测61个SNP位点的线粒体SNP巧光标记复合扩增 试剂盒。该试剂盒包含编码区位点54个，控制区位点7个，采用特异性引物对运61个SNP位点 进行检测。该试剂盒作为一个线粒体检测系统，分为Ξ管同时扩增，同时电泳。
[000引目前利用微测序法（S化Pshot)建立起的线粒体SNP检测系统，通常需要针对每个 SNP位点设计Ξ条引物，两条用来扩增目的片段，W实现目的片段的富集，第Ξ条则是真正 用于检测的单碱基延伸引物。需要η个SNP位点的检测系统中引物的数量通常为化条，运就 使得多数检测系统的引物高达100多条，直接或间接地增加了试剂盒的成本，也相应的增加 了检验成本。例如，中国专利申请201010265870.3公开了一种用于个体识别的44个SNPs位 点多色巧光复合检测试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR缓冲液， 核酸外切酶I，邮碱性憐酸酶，延伸引物和SNAPshot反应混合液;PCR引物和延伸引物由44个 SNP基因位点的引物，分别针对包含44个SNP位点的DNA片段。其中PCR引物和延伸引物的数 量总计高达132条。为解决上述问题，发明人提供了一种线粒体DNA单核巧酸多态性(SNPs) 微测序检测方法，该检测方法设及21个线粒体SNP位点，运21个SNP位点在包括汉族、藏族W 及瑶族在内的中国主要人群中具有相对较高的多态性，适用于中国主要人群。在该检测方 法中，只需要6对引物就能实现对21个SNP位点片段的富集，并且分两组检测所有SNP位点 (荆玉婷.线粒体DNA单核巧酸多态性（SNPs)微测序检测方法的研究[D].山西医科大学， 2007)。尽管该检测方法减少了SNP位点和引物的数量，然而在实际操作中，完成上述检测方 法的全部流程仍需6~8小时。众所周知，法医物证检验能够提供案件侦破的重要线索和证 据，快速及时地获得可靠的检验结果往往在一些重大案件侦破工作中发挥重要作用。因此， 尽可能的缩短检测时间在一定程度上对案件的及时侦破具有重要影响。
[0006] 综上所述，选择一组适宜的线粒体SNP遗传标记，W尽可能少的位点数量获得相对 较高的个体识别效能和相对较广的覆盖范围，能够使得法医学的个体识别检测更加高效和 经济。在此基础上，尽可能地简化检测系统的操作流程和缩短操作时间，为案件地及时侦破 提供有力支撑是SNP检测技术在法医学检验实际应用中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 术语；
[0008] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。
[0009] 本发明中的术语"dNTPs"指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核巧酸的混合 物;本发明中的术语"dd出炉指双蒸水。
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于21个线粒体SNP位点的法医学快速检测 试剂盒，简化检测步骤，缩短检测时间，实现在1.5~2小时之间，通过单管反应获得有效的 个体识别检测结果。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是:一种基于21个线粒体SNP位点的 法医学快速检测试剂盒，该试剂盒包括:(1)富集引物混合物;间单碱基延伸引物混合物;间 扩增试剂:dNTPs、快速化q聚合酶;(4)核酸纯化柱;间SNaPshot反应混合液;做化-Di甲酯胺； (7)GeneScan?Size S化ndards-120LIZ;脚阳性对照：DNA9947A; (9)阴性对照：dd出0。
[0012] 所述的21个线粒体SNP位点及其多态性情况如表1所示：
[0013] 表1 21个线粒体SNP位点及其多态性
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[0016] 其中，del表示碱基缺失，heter表示异质性。00231、00190、00473、00489和00581为 汉族人群中控制区突变位点；00150、00152和00199为瑶族人群中控制区突变位点；16223、 16362、16234、16183、16261 和 16327 为藏族人群中控制区突变位点；08414、08701、08584、 10398和10400为汉族人群中编码区突变位点；00195和16207是存在异质性的突变位点。所 述的21个SNP位点在W上各民