专利名称：检测活组织中幽门螺杆菌的组合物、试剂盒和方法
背景技术：
(a)发明领域本发明涉及引起肠胃失调的细菌源幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(下面称之为H.pylori)的检测，特别涉及一种将铵离子定量测定的酚盐方法用于常规脲酶的酶试验而产生的检测幽门螺杆菌用的组合物，和涉及使用该组合物的检测试剂盒和方法。
(b)相关技术的描述幽门螺杆菌是已知的一种引起包括胃癌和胃十二指肠溃疡的肠胃失调的细菌源，WHO已将幽门螺杆菌定为典型的致癌原。幽门螺杆菌的精确诊断，即准确检测，应当有助于治愈这种幽门螺杆菌引起的肠胃失调。迄今为止所使用的幽门螺杆菌检测方法可以主要分为两种类型，即不使用内窥镜的非侵袭性测试和使用内窥镜得到检测用活检组织的侵袭性测试。
非侵袭性测试包括血清学测试和13C或14C呼吸测试。测定幽门螺杆菌抗体的血清学测试的问题在于抗体的存在不一定就表示疾病的发展，因为疾病治愈后抗体水平的降低要6个月以上。13C或14C呼吸测试应用的原理是当摄食由13C或14C标记的脲时，如果幽门螺杆菌存在的话，则其转化为胃中标记的CO2，并且在呼出的空气中检测到。但是，该方法不经常使用，因为其涉及昂贵的仪器。
另一方面，比较通常使用的是侵袭性测试来检测幽门螺杆菌。使用内窥镜内窥期间采集的活检组织样品的侵袭性测试的检测方法包括组织学方法、PCR(聚合酶链反应)方法、培养法和脲酶测试。组织学是通过一般的组织检测证实幽门螺杆菌存在的方法；PCR方法是通过使用聚合酶链反应证实幽门螺杆菌存在的方法；培养法是直接培养来自活检组织的幽门螺杆菌的方法。但是，问题在于所有这些方法都较困难而且耗费大量时间，所以不能商业化应用。
脲酶的酶测试是容易在内窥镜室中使用的而且是最有效的方法，这是因为幽门螺杆菌产生的脲酶与其它微生物相比具有高得多的活性。也就是说，如果脲酶存在，则检测试剂盒中加入的脲被分解，并且产生的氨引起pH增加，使pH指示剂反应和变色。幽门螺杆菌检测方法就是测定脲酶的这一活性大小。目前使用脲酶酶测试的商售试剂盒是“CLOtest”(USPNo.4748113)，“Hpfast”(USP No.5439801)，和“Pyloritek”(USP No.5314804和5420016)。“CLOtest”中使用的组合物含有10-40g/l脲、1-5g/l杀细菌剂、有效量的pKa6.5-8.5指示剂(酚红)和余量的是水，pH为5.0-6.5。但是CLOtest的问题在于因为上述组合物和幽门螺杆菌产生的脲酶的反应速度慢，所以阳性比例随着各个读数者变化。因此，只有在大约24小时之后才可能诊断，并且在内窥镜检查日不能得到诊断结果，这很不方便，需要患者再次到医院。此外，多于24个小时之后，出现各种颜色使得精确诊断困难。Hpfast在原理上类似于CLOtest，但是不同之处在于加入了细胞壁去污剂并且用酚红、甲基红、和溴麝香草酚蓝的混合物作为指示剂。使用Hpfast，从pH6.2的深绿色测得幽门螺杆菌阳性和pH6.0的浅绿色测得幽门螺杆菌阴性。但是，深绿色和浅绿色的精确读数困难。Pyloritek使用了多层试验装置，不同于上面提到的CLOtest和Hpfast，其主要特征在于脲酶进行反应的部分和反应产物作为氨检测的部分是在不同的层上，并且各层的pH是不同的。尽管Pyloritek可以在一个小时内产生诊断结果，但是如果测定时间超过一小时，则假阳性比例增大。因此，如果在内窥镜检查期间不遵守精确的时间，则假阳性的可能性增加。
此外，上面提到的包括CLOtest和Pyloritek等的脲酶酶方法还能与例如人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、唾液球链菌(Streptococcus salivarius)、产气假杆菌(E.aerofacienes)、发酵乳细菌(L.fermentum)等这些杆菌所具有的少量低活性的脲酶发生反应，并且在长的鉴定时间情况下假阳性比例会增大。
发明概述本发明的目的是要解决上面提到的常规技术中的问题，通过提供幽门螺杆菌检测组合物、幽门螺杆菌试剂盒、和使用上述组合物快速和精确测定是否存在引起肠胃失调细菌源的幽门螺杆菌感染的方法。本发明还提供在一定时间过后的相同试验结果，并且其可以容易地在内窥镜室中使用。
为了实现上述本发明目的，本发明首先提供检测幽门螺杆菌的检测组合物，该组合物含有0.5-4vol％脲、0.05-0.2vol％KH2PO4、0.8-1.7vol％酚盐试剂溶液、0.002-0.005vol％具有pKa值是6.5-8.5的指示剂和平衡量的水。在上述的组成中，所述0.8-1.7vol％酚盐试剂溶液优选的组成为0.5-1vol％硫酸锰溶液、0.2-0.5vol％次氯酸盐试剂和0.1-0.2vol％酚盐试剂，并且上述指示剂优选是酚红。此外，所述组合物更优选含有0.5-2vol％胶凝剂。特别是所述组合物最优选含有2vol％脲、0.05vol％KH2PO4、1vol％硫酸锰溶液、0.5vol％次氯酸盐试剂、0.2vol％酚盐试剂、0.0025vol％酚红、1vol％琼脂和平衡量的水。并且所述组合物的pH优选为6.0-7.8。
其次，本发明得到了上述组合物并且提供了一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，该试剂盒包括活检组织取样试验装置、向所述成分中进一步加入10-20μl0.1N氢氧化钠溶液而产生的阳性对照、和由不放活检组织的成分制得的阴性对照。
第三，本发明提供一种从活检组织中检测幽门螺杆菌的方法，其检测步骤包括用所述组合物等活检组织反应，和观察所述组合物的颜色变化。
附图的简要说明插入说明书并且构成说明书的一部分的这些附图详细说明了本发明的实施方案，并且与说明书一起来解释本发明的原理
图1是本发明的检测试剂盒的透视图；图2是本发明的检测试剂盒的截面图；和图3是说明本发明的检测试剂盒的应用例的附图。
优选实施方案的详细描述在下面的详细描述中，通过简要说明本发明的发明人所设计的最佳方式只是表明和描述了本发明的优选实施方案。人们将会理解，本发明能作各种明显相关的改变，而所有的各种改变均不能脱离本发明的范围。因此，该附图和说明书被认为是举例说明发明的实质而不是限制。
下面，解释本发明的更详细的细节在检测幽门螺杆菌中，发明人试图显著地降低由读数的主观性所造成的假阳性比例，为此将脲酶测试从传统所用的方法改变为使用一种快速变化颜色的组合物，通过该测试结果同时进行阳性对照和阴性对照的比较就能迅速做出准确的测定。也就是说，因为使用脲酶测试的试剂盒检测由OH-离子引起的pH增加(该OH-是由水和简单分解脲而生成氨的反应所产生的)，为了提高pH变化的速度，发明人试图减少铵离子本身。为此，发明人使用了在铵离子定量测定中所使用的酚盐方法(“水和废水的检测的标准方法”(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater)第9版，1995，American Public Health Association，pp.4-80--4-82)。
通过脲酶的脲分解过程如下面的反应式表示[反应式1]
(脲)
总反应本发明的这些成分由于上述脲分解过程的产物(即铵离子)转化为靛酚蓝使脲继续分解，因此能很快提高pH。为了实现上述目的而使用的酚盐方法是测定水溶液中氨浓度的非常有效的方法。酚盐方法使用的原理是在锰催化剂存在下氨与次氯酸盐碱反应，使酚变为靛酚蓝，这可以由如下反应式描述[反应式2]
即，为了快速提高pH，在常规脲酶酶测试所使用的成分中加入酚盐试剂溶液，并且通过上述脲酶将脲分解过程中产生的铵离子转化为靛酚蓝，从而本发明中这些成分能使反应速度提高得更快。
另外，成分中有NaOCl，其起着降低假阳性的作用，这是由于来自杆菌的脲酶提高浓度之后而引起的，因为其对弱的脲酶活性具有抑制作用。这也使测定结果在较长测定时间之后获得。
在本发明中，酚盐试剂溶液的加入量被调节在一定范围内，使得幽门螺杆菌脲酶活性不受到抑制并且pH指示剂的颜色变化不受影响。本发明成分和各成分可能的含量范围如下0.5-4vol％脲，0.05-0.2vol％KH2PO4，0.8-1.7vol％酚盐试剂溶液，0.002-0.005vol％pKa值为6.5-8.5的指示剂和平衡量的水。
上述组合物中，脲起着幽门螺杆菌产生的脲酶底物的作用，对于测定幽门螺杆菌产生的脲酶的活性，大约0.5-4vol％含量是合适的水平。起着缓冲液作用的KH2PO4含量应当是0.05-0.2vol％，即在低于0.05vol％时不能获得所需pH范围，并且在高于0.2vol％下有抑制pH变化的趋势。起着将铵离子转化为靛酚蓝并且抑制其它微生物的脲酶活性作用的酚盐试剂溶液含量应当是0.8-1.7vol％，即在低于0.8vol％下不足以起到减少铵离子而提高pH变化速度的作用和对其它微生物的脲酶活性的抑制作用，但高于1.7vol％时，pH提高得太高，并且其它微生物以及幽门螺杆菌的脲酶活性有被抑制的趋势。pKa值是6.5-8.5的指示剂起着对pH变化敏感的作用，在本发明中酚红是最合适的，对于精确测定，优选在0.002-0.005vol％之间。酚红具有在酸性溶液中表现出黄色和在碱性溶液中为紫红色的特征。
上述酚盐试剂溶液含有用作催化剂的硫酸锰溶液、用作与铵离子反应的反应物次氯酸盐试剂和酚盐试剂，其所需的具体组成为1vol％硫酸锰溶液，0.5vol％次氯酸盐试剂和0.2vol％酚盐试剂。此外，该组成中进一步需要含有0.5-2vol％胶凝剂，例如琼脂，因为这样其可以软凝胶形式方便地使用。优选将成分pH控制在6.0-7.8范围内，因为在该范围内有助于精确测定。
本发明组合物的具体组成和含量范围如下2vol％脲，0.05vol％KH2PO4，1vol％硫酸锰溶液，0.5vol％次氯酸盐试剂，0.2vol％酚盐试剂，0.0025vol％酚红，1vol％琼脂和平衡量的水。
另一方面，本发明中使用的酚盐试剂溶液的贮存溶液所需的成分和含量如下硫酸锰溶液；0.05vol％MnSO4.H2O，和平衡量的蒸馏水，次氯酸盐试剂；1vol％NaOCl，和平衡量的水，酚盐试剂；2.5vol％NaOH，8vol％苯酚，和平衡量的蒸馏水。
本发明将内窥镜获得的活检组织放置在由上述成分制备的凝胶上并观察颜色变化。由上述成分制备凝胶，并且通过向上述成分加入少量的可以表现出阳性结果的NaOH(即10-20μl 0.1N NaOH溶液)来制备阳性对照凝胶。通过比较其中根本没有加入NaOH的阴性对照凝胶的颜色可以测定是否存在幽门螺杆菌感染。因此，带有阳性和阴性对照一起放置，用指示阳性或阴性的颜色来观察结果并进行比较，该测定装置能减少由于读数者主观性所带来的错误测定结果。
本发明的检测试剂盒的透视图在图1中表示，侧面图在图2中表示。根据本发明的测定试剂盒的应用实施例也在图3中表示。参照上述图1-3，1是盖，2是容器，最好用丙烯酸材料制备的透明容器，3是本发明的检测组合物，4是测试装置，5是活组织检查样品区域，该区域需要进行不透光处理，使得从侧面看不到活检样品，6是阴性对照，7是阳性对照和8是活检样品。
以下描述了本发明所要求的实施例和对照例。但是，下面描述的实施例只是本发明许多实施例中的一部分，本发明并不限制于下面描述的实施例。制备幽门螺杆菌检测组合物首先制备下面描述的贮备溶液的组合物20vol％脲，2vol％KH2PO4，0.01vol％酚红，和2vol％琼脂。
在向50mg MnSO4.H2O加蒸馏水制备100ml硫酸锰溶液的同时，通过向10ml 10％NaOCl加蒸馏水制备100ml次氯酸盐试剂，并且用浓的次氯酸将pH调节到6.8。向2.5gNaOH和8ml苯酚加入蒸馏水制备100ml酚盐试剂。上述琼脂溶液高压灭菌处理(121℃，1.5大气压)15分钟后，将其单独置放，直到在55℃水罐中使用，制备下述2×试剂。
将上述10ml脲贮备溶液，2.5ml KH2PO4贮备溶液，25ml酚红贮备溶液，1ml硫酸锰溶液，0.5ml次氯酸盐试剂和0.2ml酚盐试剂并加入蒸馏水制备50ml混合物。通过0.2μm过滤器过滤上述制备的2×试剂的杆菌后，混合相同量2％琼脂溶液。其结果是，各成分的终浓度如下(此时最终pH是7.5)2％脲，0.05％KH2PO4，0.0005％硫酸锰，0.005％NaOCl，0.2％酚盐试剂(0.005％NaOH，0.016％苯酚)，0.0025％酚红和1％琼脂。制备幽门螺杆菌检测试剂盒将自实施例1制备的组合物注射到装有从内窥镜获得的活检组织测定装置多孔板的一个孔中，向另一个孔注入制备的组合物并向上述组合物进一步加入10μl 0.1N NaOH而制备阳性对照，将上述组合物注射到另一个孔中而制备阴性对照，从而制备幽门螺杆菌检测试剂盒。上述检测试剂盒称之为“PET(Pylori Easy Test)试剂盒”。获得患者活检组织后，同时在该活检组织上使用CLOtest和实施例2的PET，并且比较每小时的阳性比例，结果描述于下面的表1。每小时阳性比例
※7读数难以测定。
结果，PET可确定在一个小时内总阳性76.9％和3小时之后100％。另一方面，CLOtest只证实阳性的17.6-30％和只有在24小时之后为100％。但是，24小时之后出现不能被明确区分的难以辨别的颜色，并且根据观察者的不同阳性比例从38.4％(10/26)至65.3％(17/26)变化。因此可见在本发明使用PET的情况下快速测定是可能的。
此后，我们观察了PET结果与PCR方法的一致性程度。这里，PCR方法使用了26kDa蛋白质基因的扩增方法，这已知是幽门螺杆菌测定中最独特和敏感的方法(Ho，S.等，1991，用于人和动物中幽门螺杆菌测定的直接聚合酶链反应(Direct Polymerase Chain Reaction Test for detection ofH.Pyori in Human and Animal)，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)，29pp2543-2549)。结果在下面的表2中描述与PCR方法一致性比
面的表2中看出，使用发明PET时，所有26份活检组织与PCR方法的结果相一致，并且一致性比例范围对于CLOtest是61.5-80.7％之间。因此，我们可以看到，判断本发明PET比CLOtest更精确是可能的。内窥镜检查获得的活检组织在-20℃冷冻1星期，然后根据试验例1中相同的方法进行PET和CLOtest的试验，比较结果在表3和表4中表示。每小时的阳性比例
表4]与PCR的一致性
杆菌的脲酶活性降低到一定程度的活检组织的精确测定是可能的，这一点是值得注意的。
本发明提供能快速精确地测定出是否存在幽门螺杆菌(引起肠胃失调的细菌源)感染的幽门螺杆菌检测组合物，即使在时间已过去之后仍然可以获得相同的结果，并且该组合物容易在内窥镜室中使用。本发明提供幽门螺杆菌检测试剂盒和使用幽门螺杆菌检测组合物的方法。为了检查PET的幽门螺杆菌特性，对内窥镜检查获得的活检组织中分离的幽门螺杆菌杆菌和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)杆菌检查了脲酶分解能力。
检查方法包括首先培养幽门螺杆菌杆菌和人葡萄球菌杆菌，并且在灭菌蒸馏水中稀释，这样得到合适数目的杆菌，然后根据试验例1中描述的相同的方法进行PET和CLOtest，并且比较。结果在表5中描述。幽门螺杆菌杆菌和人葡萄球菌杆菌的特性比较
从上述表5中注意到，如果使用本发明的PET，则能检测出明显不同的特性，即幽门螺杆菌的脲酶活性表现出快速反应和其它杆菌的脲酶活性表现出慢的反应。
以上已经详细描述了本发明优选的实施方案，但应该清楚地理解，这里所指出的对于本领域技术人员是很清楚的基本发明概念的很多变化和/或修改将落在权利要求书中所定义的本发明的构思和范围内。
权利要求
1.用于检测幽门螺杆菌的组合物，包括a)0.5-4vol％脲，b)0.05-0.2vol％KH2PO4，c)0.8-1.7vol％酚盐试剂溶液，d)0.002-0.005vol％具有pKa值为6.5-8.5的指示剂，和e)平衡量的水。
2.权利要求1的组合物，其中所述检测幽门螺杆菌的组合物中的0.8-1.7vol％酚盐试剂溶液包括a)0.5-1vol％硫酸锰溶液，b)0.2-0.5vol％次氯酸盐试剂，和c)0.1-0.2vol％酚盐试剂。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物是检测幽门螺杆菌的组合物，其中指示剂是酚红。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物是进一步含有0.5-2vol％胶凝剂的检测幽门螺杆菌的组合物。
5.权利要求4的组合物，其中所述组合物是检测幽门螺杆菌的组合物，包括；a)2vol％脲，b)0.05vol％KH2PO4，c)1vol％硫酸锰溶液，d)0.5vol％次氯酸盐试剂，e)0.2vol％酚盐试剂溶，f)0.0025vol％酚红，g)1vol％琼脂，和h)平衡量的水。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物是pH为6.0-7.8的幽门螺杆菌检测组合物。
7.检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括a)由放置活检组织的权利要求4的组合物制成的测定装置；b)在权利要求4的组合物中进一步加入10-20μl0.1N NaOH溶液而制得的阳性对照；和c)由没有放置活检组织的权利要求4的组合物制得的阴性对照。
8.检测活检组织中幽门螺杆菌的方法，包括下面的步骤a)使活检组织与权利要求1的所述组合物反应；和b)观察与组合物反应的所述活检组织的颜色变化。
全文摘要
本发明公开了用于检测幽门螺杆菌的组合物,包括0.5—4vol%脲、0.05—0.2vol%KH
文档编号C12Q1/10GK1266461SQ99800633
公开日2000年9月13日 申请日期1999年4月2日 优先权日1998年4月3日
发明者李钟和, 李学成, 卢姙奂, 金晸泽, 河泳七, 崔泰富 申请人:李钟和, 李学成, 卢姙奂, 金晸泽, 河泳七, 崔泰富