专利名称：识别恶性肿瘤中n－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖的单克隆抗体和含有该抗体的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和人类医学领域，具体地涉及针对N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的单克隆抗体(Mab)的制备和选择，此单克隆抗体可用于诊断和治疗某些肿瘤疾病。
现有技术寡糖结构可见于糖蛋白和糖脂的组成部分，它们在正常和病变组织中都存在。
约100％恶性肿瘤中都有异常糖基化的描述。异常糖基化常见的变化是新抗原的表达，寡糖序列组成的变化，寡糖中唾液酸分子的增加或减少以及细胞表面分子密度的增加等(Hakomori S.H.等，Curr.Opin.inImmunol.1991，(3)646-653)。除了见于唾液酸转移酶机制的变化以外，还有活化的唾液酸N-乙酰化依赖性羟化酶的变化。
神经节苷脂是其结构中含有唾液酸的glycoesfingolipid，其特征在于存在于脊椎动物的大多数细胞中。这些分子见于正常组织中，在肿瘤中可有更高表达，具有不同的组成和形态(Hakomori，S.H.，1985，癌研究452405-2414；Miraldi，F.，1989，Seminars in Nuclear Medicine，XIX，282-294)。
针对糖类抗原的体液免疫反应一般是IgM同种型。与脂类结合的寡糖序列一般具有比糖蛋白更小的免疫原性。所以，使用糖脂作为免疫原需要其与转运蛋白的结合或整合到脂质体或细菌如结核杆菌或R595明尼苏达沙门氏菌中。
针对神经节苷脂的反应是非胸腺依赖性的。这已由Livingston等反复报道(Livingston，P.O.等，1982，美国国家科学院院报842911-2915；Livingston，P.O.等，1989，癌研究497045-7050)。不同物种的血清研究中，针对神经节苷脂的抗体的主要特征是其低亲和性、相当多的交叉反应和短寿命(Livingston，P.O.，1991，Immunology and Allergy Clinicsof North America，11401-423；Portoukalian，J.等，1991，Int.J.Cancer，49893-899)。
寡糖中N-乙醇酰化形式的表达普遍存在于所有脊椎动物物种的正常和病变组织中，除了鸡和人类只在胚胎和肿瘤组织中表达。这两个物种的正常组织只有N-乙酰化变体(Nishimakit等，1979，免疫学杂志，1222314；Higashi H.等，1985，癌研究，453796)。
一些人类肿瘤中寡糖组成的研究表明N-乙醇酰化形式存在于黑色素瘤肿瘤细胞的糖脂和糖蛋白中(Hirabayashi，Y等，1987，癌研究杂志，78，614-620；Saida T.等，1991 Arch.Dermatol.Res.282.(3)179-182；Kawashima I.等，1993，生物化学杂志(Tokio)(2)186-193；Kawachi S.等，1992，皮肤学杂志(11)827-830)，也出现在结肠肿瘤中，尤其在糖脂中(Miyoshi，I.等，1986，分子免疫学，23(6)631；Higashi H.等，1985，癌研究，453796-3802)。另外，已进行研究以证明神经节苷脂的N-乙醇酰化形式存在于肝肿瘤样品、畸胎瘤、淋巴瘤等组织中(Kawai T.等，1991 Cancer Res.(51)1242-1246)。尽管前例中糖脂的N-乙醇酰化变体的浓度小于总唾液酸的0.05％，Marquina及其合作者在乳腺肿瘤中发现约10％与脂类的唾液酸(Marquina，G.等，1996，癌研究565165)。
至今已经提供针对神经节苷脂N-乙醇酰化变体的单克隆抗体同种型抗体的制备，这些单克隆抗体一般识别一种以上神经节苷脂分子，例如人类单克隆抗体2-39M和32-27M(Furukawa K.，等，1998，J.BiologicalChemistry，26318507)和鼠抗体GMR8和GMR3(Ozawa H.等，1992，Biochem.Biophys.，2(294)427)。其他作者已报道了抗N-乙醇酰化神经节苷脂抗体的特定种类，总是IgM同种型的产生，其中是针对NGcGM2的单克隆抗体Y-2-HD1(Samai Y.等，1988，Bioch.Biophys.Act.，958，368)和针对相同分子的MK2-34(Miyake，M.等，1990，癌研究48，6154)。
然而，Watarai(Watarai，S.等，1995，生物化学杂志.117，1062)制备了针对i-活化的(i-active)N-乙醇酰化神经节苷脂的单克隆抗体SHS-1，Nakumara得到了针对(NGc-NGc)GD1c的单克隆抗体YK-3(Nakumara等，1995，J.of Biolog.Chemist.，8(270)3876)。最近Vázquez等(Vázquez，A.M.等，1995，杂交瘤，14，6，551)报道了单克隆抗体P3的制备，此抗体识别大多数含有唾液酸的N-乙醇酰化形式的神经节苷脂分子以及硫酸糖脂。
Nagai等已制备出针对神经节苷脂的单克隆抗体HMA1(Nagai Y.等，美国专利4,965,198)。它们从患有自身免疫疾病的小鼠得到针对神经节苷脂NGcGM2的特异单克隆抗体。但是他们报道了另外识别其它称为PyK、YH02、YH03、YH04、YH05、YH06和YH07的N-乙醇酰化神经节苷脂的这些抗体中的几个。
而且，Yamasaki，M.等在他们的美国专利4,942,131中报道了也在患有自身免疫疾病的小鼠中制备了针对4-O-乙酰基-NGcGM3神经节苷脂的单克隆抗体YH08、YH09、YH10和YH11。
使用这些分子作为内酯或从含有神经节苷脂的细胞系已获得针对神经节苷脂的单克隆抗体(美国专利5,308,614；5,240,833；5,389,.530和5,500,215)。
同样方法，已经获得了针对GD3、GD2和GM2神经节苷脂的人和鼠不同单克隆抗体，所有的都是N-乙酰化神经节苷脂而且大多数单克隆抗体是IgM和IgG3亚类(Pukel，C.S.等，1982，实验医学杂志，1151133-1147；Hirabayashi，Y.等，1985，J.Biol.Chem.，26013328-13333；专利申请WO 86/00909；Miyake，M.等，1988，癌研究，486154-6160；Kawashima，I.等，1992，分子免疫学，29，625-632；Kotani，M.等，1992，Biochimicaet Biophysica Acta，111797-103)。
使用针对神经节苷脂的单克隆抗体的被动免疫治疗已经用于一些肿瘤如黑色素瘤和成神经细胞瘤的临床实验。黑色素瘤的治疗是病变内或全身的，尽管结果看起来令人鼓舞，但很少患者表现部分或全部缓解(Houghton，A.N.等，1985，美国国家科学院院报，821242；Dippold，W.G.等，1988，J Cancer Clin.Oncol.，24865；Vadhan-Raj，S.等，1988，J.Clin.Oncol.，61636；Saleh M.N.等，1992，癌研究，524332-4347)。
这些抗体在补体或细胞介导的细胞毒性研究中显示出效果(Ravindramath M.H.等，1991，Inter.Rev.Immunol.，7，303)。
至今所有针对神经节苷脂得到的单克隆抗体都是IgM同种型，并且它们诱导的毒性是由补体介导的。
IgM一般具有较低的抗原亲和性，而且很难用IgM作为放射性标记的单克隆抗体来诊断和治疗。虽然IgM很好地固定补体且保证良好的细胞毒性，但大规模纯化比IgG同种型更复杂。
另外，有关针对乙醇酰化糖蛋白的单克隆抗体的报道很少，而且其中的大部分用于诊断目的。
Devine等描述了通过免疫组织化学研究的、识别在90％乳腺肿瘤中表达的N-乙醇酰粘蛋白(糖蛋白)的单克隆抗体3E1.2(Devine，P.L.等，1991，癌研究51(21)5826-36)。
已公开了一种命名为JAM3的单克隆抗体，它识别由于内阿米属侵袭产生的存在于孢囊表面的250KD蛋白的N-乙酰化和N-乙醇酰化形式(Avron，B.等，1987，Mol Biochem Parasitol.(3)257-266)。
发明内容
本发明新颖性在于已获得对存在于神经节苷脂和糖蛋白中的N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列高度特异的单克隆抗体。另外，IgG同种型免疫球蛋白的特点使其更特异，因此具有与所识别分子更高的亲和性，有利于其生物活性。出乎意断的是，这种抗体在带有所述寡糖序列的细胞中表现直接诱导细胞死亡的能力。发明详述NGcGM3神经节苷脂的获得为获得NGcGM3神经节苷脂，采用Hakomori技术的改进(Hakomori，S.等，1974，酶学方法，32Part B，350)，使用诸如马红细胞的自然资源。NGcGM3神经节苷脂提取物的产量介于每升马红细胞180-300mg之间，根据Gazzotti方法通过高效液相色谱证明纯度90％以上(Gazzotti，G.等，1985，J.of Chromatography，348371-378)。免疫原的获得为获得免疫原，根据Dumontet等的方法(Dumontet，C.等，1994.Cancer Immunol Immunother.38311-318)，使NGcGM3神经节苷脂与人类极低密度脂蛋白(VLDL)疏水性结合。免疫方案为获得抗神经节苷脂IgG的单克隆抗体，使用以下免疫方法。用疫苗制品免疫小鼠或其它哺乳动物，每剂量含0.03-0.05mg与VLDL结合的NGcGM3神经节苷脂和佐剂，佐剂选自以下之一白蛋白、完全或不完全弗氏佐剂或Montanide ISA51。
免疫前和免疫后，从动物抽取血样以得到血清用于监测针对神经节苷脂作为抗原而在动物中产生的抗体。为此目的，可使用任何用于检测抗原-抗体(Ag-Ab)反应的已知免疫分析方法。
用2-8之间的各种剂量在7-14天不等的时间间隔免疫动物。通过皮下或肌肉途径用0.1-0.2ml之间的用量进行注射。其它可能的免疫途径是静脉内和腹膜内。接受此剂量范围的动物表现针对作为免疫原的神经节苷脂的特异反应。70-100％的免疫动物具有对NGcGM3神经节苷脂的特异IgG反应。单克隆抗体的获得为制备针对NGcGM3神经节苷脂的特异单克隆抗体，在获得产生抗体的细胞前三天，血清中有针对这种神经节苷脂的抗体效价的小鼠接受疫苗制品再次免疫。尽管其它细胞也可以使用，但优选脾细胞。
这些细胞与骨髓瘤细胞融合，提供具有“体内”和“体外”无限增殖能力的杂交细胞或杂交瘤。为此目的，可以使用任何已知的细胞融合方法。为测定杂交瘤产生的抗体，优先使用免疫酶学分析法。也可以使用其它免疫分析方法。本分析法的步骤是通过杂交瘤上清液识别神经节苷脂，用酶标的二抗使抗原-抗体反应可以观察到，酶标的二抗在充足条件下与由杂交瘤产生的抗体结合，同时得以检测。
杂交瘤一经选择至少经二次传代(例如通过有限稀释)。所得的单克隆抗体可在充足的培养基如本领域技术所述的任何培养基中体外产生，然后从所述的组织培养悬浮液纯化。这样，1-8％的分泌克隆是对N-乙醇酰GM3神经节苷脂特异的。
另一抗体制备方法包括，将杂交瘤注射到动物内(例如同源动物)。杂交瘤激发非实体肿瘤的形成，在宿主动物血流和腹膜渗出液中提供高浓度的所需抗体。单克隆抗体的纯化通过将0.2×106个产生单克隆抗体的杂交瘤细胞接种在前先用不完全弗氏佐剂作为促腹水生成剂处理的Balb/C小鼠腹膜中而得到腹水，然后从腹水纯化单克隆抗体。
将腹水在1.5M甘氨酸缓冲液、3M NaCl，PH8.9中稀释成0.5X。然后以60mL/小时(h)的速度上样到蛋白A-Sepharose基质上。单克隆抗体用0.14M柠檬酸缓冲液pH6洗脱。
纯化的单克隆抗体浓度用Lowry方法(Lowry，G.H.，1951，J.Biol.Chem.，193256)和鼠IgG1在280nm处的吸收系数测定。特异性用ELISA验证。
每毫升腹水得到2-5mg抗体，纯度百分率95％以上。这已通过低压液相色谱验证。特异性研究为测定所得单克隆抗体的特异性，使用N-乙酰化神经节苷脂(GM1，GM2，GM3，GM1，GD1a，GD1b，GD3和GT1b)和N-乙醇酰化神经节苷脂(GM3，GM2，GM1a，GM1b，GDc和GD3)，在酶联免疫分析板和薄层层析上进行所得单克隆抗体的免疫酶学研究。
为在高分辨薄层层析上研究糖脂，使用溶剂系统(氯仿∶甲醇∶0.25％氯化钾和2.5M氨)(5∶4∶1)(v∶v)。用地衣酚化学显色来显示条带。
平板是塑料的，并用多聚异丁基甲基丙烯酸酯溶液覆盖，室温下干燥过夜。用溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)PH7.4中的1％牛血清封闭约30分钟。然后，单克隆抗体在封闭液中温育。
接着用PBS洗平板并在一小时内加入与过氧化物酶结合的抗鼠免疫球蛋白。再次洗平板并加入酶底物溶液直至可见到条带。最后，比较化学和免疫结果。结果，IgG只识别NGcGM3神经节苷脂。细胞毒性测定为测定所产生的抗体是直接或者通过其它细胞毒性形式导致细胞死亡，使每毫升107个含NGcGM3的P3X63鼠骨髓瘤细胞分别在4℃和37℃与0.01-1mg/mL的单克隆抗体一起温育30分钟。然后，用溴酚蓝方法进行细胞存活研究。因抗体作用而死亡的细胞数可使用安妥碘或其它存活标志来计数。
为研究补体介导的细胞毒性，使用每毫升107个细胞；以0.01-0.5mg/ml浓度加入单克隆抗体。以1/20到1/2稀释度加入含高浓度补体蛋白的兔血清并于37℃温育一小时。补体介导的细胞毒性通过上述的存活计数测定或使用Cr51释放方法，其中放射标记的P3X63黑色素瘤细胞死亡时将同位素释放到培养悬浮液中。
使用不同方法测定直接细胞毒性，表明相对于所研究的细胞总数死亡细胞值在50％-85％之间。单克隆抗体生物分布测定用放射性同位素如99mTc、Re186和Re188标记所制备的单克隆抗体可用于诊断和治疗。Schwarz和Steinstrasser(Schwarz A.和Steinstrasser A.1987，J.Nucl Med.28721)已描述了用放射性同位素标记单克隆抗体的方法，Mather和Ellison对其进行了改进(MatherS.J.和Ellison D.，1990，J.Nucl.Med.31692-697)。在Whatman 3MM纸上通过层析进行标记量控制，获得的标记百分率为98％和100％。
为测定单克隆抗体的可能用途，用P3X63肿瘤接种10只小鼠，另10只小鼠用作正常对照(无肿瘤接种)。经过肿瘤生长所需的时间后，将99mTc标记的14F7单克隆抗体通过静脉途径注射给20只小鼠。
以5只动物为一组(5只健康和5只患肿瘤)，在注射后4和24小时进行抗寡糖序列单克隆抗体生物分布的监测。宰杀动物并分别对主要器官和肿瘤称重，并在研究结束时分别对gamma射线释放进行定量。
单克隆抗体主要分布于健康动物的血液、肝脏和肾脏中，而患肿瘤的小鼠中，单克隆抗体定位于上述器官中，24小时时优先在肿瘤中。单克隆抗体对正常和胚胎组织的识别根据现有技术所述，放射标记的单克隆抗体可用于检测表达寡糖序列的肿瘤。
全身放射活性可用Gamma照相机进行研究。单克隆抗体注射后5分钟、1、3、5、24和48小时进行图象摄影。单克隆抗体只定位于肿瘤和外分泌器官中。
单克隆抗体也可直接或间接与其它治疗制剂如药物、放射性同位素、免疫调节物、凝集素和毒素结合。在生物反应调节剂(免疫调节剂)中，那些以某种方式可以增强本发明的单克隆抗体对肿瘤的催毁的免疫调节剂包括淋巴因子如肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、集落刺激因子、干扰素等。
进行免疫组织化学研究以用于诊断目的。组织标本在10％缓冲的福尔马林液中固定、脱水、透明并包埋在石蜡中。对苏木素-伊红染色的组织切片进行组织病理学研究。
用前述的抗生素蛋白链霉素过氧化物酶复合物方法(Hsu，S.M.和Raine，L.，1981，.J.Histochem Cytochem.291349-1353)对用于组织病理学研究的石蜡包埋块的连续切片进行免疫染色。
经过脱蜡和脱水的切片用3％过氧化氢甲醇溶液处理30分钟以消除内源过氧化物酶活性。组织切片与纯化的单克隆抗体一起温育。接着在室温下与生物素标记的抗鼠抗体和抗生素蛋白链霉素过氧化物酶复合物(Dakopatts)一起温育。
温育期间，用Tris-Hcl盐缓冲液冲洗切片，过氧化物酶反应用30％过氧化氢和3-3二氨基联苯胺显色。
用自来水冲洗切片，Mayer苏木素染色后用加拿大树脂和盖玻片封片。酶反应产生棕红色。
对人类乳腺、肺、皮肤、神经系统的肿瘤组织以及胚胎和正常成人组织进行研究。
新鲜的病变活体组织在手术后一小时内得到。将活体组织冷冻，然后切片，切片冷冻保存直至进行研究。
使用胚胎组织进行研究是因为已经反复报道了人类胚胎和肿瘤组织中神经节苷脂与癌胚抗原的联系以及这两些分子的相似性(Cahan，L.等，1982美国国家科学院院报，797629-7633)。
胚胎组织从12-18周的胚胎获得。
正常成人组织从意外死亡和/或脑性死亡个体，在死后一小时内取得。
在所研究的肿瘤中，具有不同发病机制的肺和中枢神经系统肿瘤及人正常组织的切片结果阴性。而黑色素瘤和乳腺肿瘤组织及消化系统(肝、胃、小肠、大肠)和泌尿系统的胚胎组织标本都是阳性。抗肿瘤效应为证明针对NGcGM3神经节苷脂的单克隆抗体的抗肿瘤效应，用所得的单克隆抗体治疗用带有目的神经节苷脂的肿瘤(P3X63骨髓瘤)接种的动物。接种剂量在每公斤体重0.01mg到200mg之间不等，一天或不同天内每天注射一次或多次。抗体可以通过非肠道注射(静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或皮内注射)给药。
通过Log Ram测试验证，在典型实验中，与对照组小鼠相比，经抗体治疗的小鼠有30％-80％的生存率。(Cox and Oakes(1984)Ahalysis ofsurvival Data edits.Chapman Hall)。单克隆抗体治疗组和对照组之间发现显著差异(＜0.05％)。
实施例实施例1用免疫制剂NGcGM3/VLDL/弗氏佐剂复合物免疫的小鼠对NGcGM3的特异IgG反应通过免疫酶学技术测定。
6-8周的雌性Balb/c小鼠第一次肌肉注射用0.2mg免疫制剂人NGcGM3/VLDL和完全弗氏佐剂(由SIGMA生产)的等量混合物，以后的肌肉注射用的是0.2mg人NGcGM3/VLDL和不完全弗氏佐剂(由SIGMA生产)的等量混合物。每个动物接受六次注射。前四次每周一次，后两次每两周一次。采血在第一次注射之前进行，以后每两周进行一次。
使用间接ELISA方法在POLYSORP板(Nunc商标)上测定动物血清的抗体水平，神经节苷脂按以下方法灭活神经节苷脂NAcGM3和NGcGM3分别溶于甲醇(4μg/ml)，每个孔内加入50μl。酶标板在37℃放置一个半小时以使甲醇蒸发。然后，加入100ml/孔含有2％牛血清白蛋白(BSA)的0.05M TRIS-HCL，PH7.8缓冲液并于室温下温育一小时。接着，用同样的缓冲液稀释50μl血清并在室温下温育过夜。
酶标板孔用200μl磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗4次，加入50ul具有足够效价的生物素标记的抗鼠免疫球蛋白抗体，37℃温育一小时。
用PBS冲洗后，加入50μl足够稀释的碱性磷酸酶抗生素蛋白链霉素。最后进行一次冲洗后，将100μl硝基苯磷酸盐底物溶解在二乙醇胺缓冲液pH9.8(1mg/ml)中。用ELISA检测仪测定405nm吸光度。
图1表示实验56天时1/80稀释的每一动物血清450nm处O.D.结果。针对NGcGM3和GM3的反应通过ELISA使用生物素标记的鼠抗IgG偶联物和来自JACKSON的碱性磷酸酶抗生物素蛋白链霉素来测定。
接受疫苗制剂免疫的动物中70％以上有大于0.5的405nm处的O.D.，所有免疫动物都表现针对NGcGM3的IgG反应，而未观察到针对NAcGM3的反应，尽管这两个分子差别很小。
图2表示接受最后一次免疫接种三个月后，针对NGcGM3神经节苷脂的持续特异抗体反应(IgG型)，而未表现针对NAcGM3的反应。实施例2针对NGcGM3的单克隆抗体的获得抗体用实施例1所述的步骤通过免疫Balb/C小鼠制备。
融合前三天，用NGcGM3/VLDL再次免疫动物，使用的是完全弗氏佐剂。随后，取得小鼠脾脏并将脾组织通过不锈钢筛或利用脾灌注来获得脾细胞悬浮液。按Kǒhler和Milstein所述的方法(自然，1975，No.256，495-497)并稍加改进进行细胞融合。
不分泌P3/X63 Ag86.5.3的细胞鼠骨髓瘤细胞与鼠脾细胞以1∶10比例融合，融合液的体积为0.5mL，其中在RPMI 1640培养基中含42％聚乙二醇(3000-3600 SIGMA)。
细胞融合后，在HAT选择培养液里(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶)，37℃，5％二氧化碳的湿热环境中进行培养。
细胞融合后10-15天，用实施例1所述的ELISA技术开始检测杂交瘤细胞系上清液中抗体的出现。
选出与目的神经节苷脂发生反应的抗体，并在辅佐细胞存在时通过限制稀释方法传代两次。
所选杂交瘤所产生的抗体的特异性使用间接ELISA技术用一组糖脂来测定。
针对NGcGM3神经节苷脂的特异克隆数为5.5％。所得克隆之一命名为14F7。实施例314F7单克隆抗体亚类的测定为了测定本发明单克隆抗体的免疫球蛋白亚类，使用实施例1所述的间接ELISA方法，其中酶标板用NGcGM3覆盖，但是将杂交瘤上清液或纯化的单克隆抗体替换为血清。
生物素偶联的大鼠中产生的抗IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3单克隆抗体在温育缓冲液中稀释后加入酶标板，37℃温育一小时后，冲洗酶标板，加入在温育缓冲液中稀释的、由碱性磷酸酶偶联的抗生素蛋白链霉素。作为对照，使用了以前已鉴定的各个亚类的鼠单克隆抗体。
最后，加入底物溶液。如前所述进行吸光度的测定。图3表示14F7单克隆抗体属于IgG1亚类。实施例4使用免疫染色法，在高分辨率薄层层析上进行14F7单克隆抗体的特异性研究高分辨率薄层层析用于分离糖脂。使用的溶剂系统是氯仿∶甲醇∶0.25％氯化钾和2.5M氨(5∶4∶1)v∶v。用地衣酚化学显色来显示条带(Svennerholm L.1964，J.Lipid.Res.，5，145)。对于免疫染色，使用方法Kawashima Y.和col.1993(生物化学杂志，114，186)。
以前进行 薄层层析的平板是塑料的，通过在正己烷中的0.1％多聚异丁基甲基丙烯酸酯(PIBM)溶液中浸泡75秒进行覆盖。层析板在室温下干燥30分钟。将1％PIBM溶液置于层析板的边缘并于室温过夜。
使用溶于PBS pH7.2-7.4的1％牛血清白蛋白封闭非特异性反应。紧接其后，在封闭溶液中与0.01-0.02mg/ml浓度的14F7单克隆抗体一起温育。
用PBS冲洗板并与在封闭缓冲液中稀释的辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白抗体一起温育。
室温下搅拌温育一个小时后，再冲洗，加入在含有0.12％过氧化氢(H2O2)(Riedel de Haen)的柠檬酸-磷酸缓冲液80mM pH5中的0.4mg/ml邻苯二胺(C6H8N2)(Sigma)底物溶液。
反应表明只对NGcGM3神经节苷脂有特异性，对于其它N-乙醇酰化和N-乙酰化神经节苷脂则未观察到特异性，被认为是N-乙醇酰化神经节苷脂的是GM1a，GM1b，GM2。实施例514F7单克隆抗体对肿瘤和胚胎组织的识别组织切片用10％缓冲的福尔马林固定，脱水、透明、包埋在石蜡中。切片经HE染色进行组织病理学研究。
用前述的生物素-抗生素蛋白链霉素-过氧化物酶复合物方法，对用于组织病理学研究的石蜡包埋块连续切片进行免疫染色(Hsu，S.M.和Raine，L.，1981，.J.Histochem Cytochem.291349-1353)。
脱蜡和脱水的切片用3％过氧化氢甲醇溶液处理30分钟以消除内源过氧化物酶活性。室温下使组织切片与纯化的14F7单克隆抗体一起温育一小时。接着在室温与生物素标记的抗鼠抗体和抗生素蛋白链霉素-过氧化物酶复合物(Dakopatts)一起温育。
温育期间，用Tris-Hcl盐缓冲液冲洗切片。过氧化物酶反应在5mlTris缓冲液中用0.005ml 30％过氧化氢和3mg 3-3二氨基联苯胺显色。
用自来水冲洗切片，Mayer苏木素染色，加拿大树胶和盖玻片封片。酶反应产生棕红色。
正常成人的组织块从意外死亡和/或脑性死亡个体，在死后一小时内取得。新鲜的病变活体组织在手术后一小时内得到。胚胎组织是从12-18周的胚胎在人工流产后一小时内获得。所有的活体组织块用盐溶液冲洗，立即置于液氮中冷冻，后在-80℃中冻存。
冷冻组织块在25℃下，用恒冷切片机切出5微米连续切片。切片在空气中干燥后立即使用或裹在铝箔中于-20℃冻存。切片在4％戊二醛中固定20分钟。
图6表示正常成人组织中14F7单克隆抗体的免疫组织化学研究。单克隆抗体反应见于细胞膜而在细胞质区域未观察到。
图7表示病变组织的相同研究。所有研究的乳腺(33/33)和黑色素瘤(20/20)组织结果都是阳性。而不同发病机制的70例肺肿瘤和33例中枢神经系统的不同肿瘤结果是阴性。
图8表示14F7单克隆抗体识别消化系统和肾脏胚胎组织。实施例6用流式细胞仪研究细胞系中14F7单克隆抗体对NGcGM3神经节苷脂的识别所研究的细胞系是J.Muthing等描述的表达GM3和NGcGM3的鼠P3X63骨髓瘤(Muthing J.等，1994，生物化学杂志11664-73)和表达GM3的骨髓瘤B16。用含有8％胎牛血清的RPMI培养液培养细胞。用含有0.02％叠氮化钠和1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液pH7.4将细胞调节至10个细胞/毫升浓度。在每个试管内加入0.1mL细胞悬浮液，接着加入0.05ml 14F7单克隆抗体到磷酸盐缓冲液中至最终浓度0.1mg/ml，于4℃温育30分钟。然后用稀释这些细胞的溶液来冲洗细胞。
接着以低速离心沉淀这些培养细胞。然后加入抗鼠(IgG+IgM)生物素标记物(Jackson)，于4℃温育30分钟后冲洗。最后加入0.002mg荧光抗生素蛋白链霉素(FITC)(Jackson)并按如前述的相同条件温育。用磷酸缓冲液进行最后冲洗。
最后一次离心后去除上清液，将细胞重新悬浮于0.6ml最后冲洗溶液中。
80％的P3X63黑色素瘤细胞为14F7单克隆抗体染色阳性(图9)。实施例714F7单克隆抗体直接细胞毒性的研究。
P3X63鼠骨髓瘤细胞系按实施例6所述与14F7单克隆抗体一起温育。冲洗后，将0.01ml溶于磷酸盐缓冲液的安妥碘加入细胞中，用流式细胞仪测定细胞的存活率。
结果表明78％的细胞死亡(图10)。实施例8健康和患有P3X63骨髓瘤的Balb/C小鼠中99mTc标记的14F7单克隆抗体的生物分布研究。
20只20-22g重量的雌性Balb/C小鼠接受99mTc标记的14F7单克隆抗体静脉注射(10例健康小鼠和10例患P3X63骨髓瘤小鼠通过腹膜内途径接种)。标记浓度关系为0.03mg 14F7单克隆抗体/60uCi 99mTc注射后4-24小时，对每组五只动物进行不同器官内放射活性测定。动物处死后按Sartorius计量法称重各个器官。开始实验后约25小时可用WALLAC gamma计数器(model WIZARD 1470)一次性测定所有试管的放射性。
标记方法已由Schwarz和Steistrasser(1987)描述，经过1990年Muther和Ellison的修改。
标记的14F7单克隆抗体经健康小鼠的肾脏和肝脏排出(图11)。
患有P3X63骨髓瘤的小鼠在4小时和24小时表现单克隆抗体结合(每克组织含12％的总注入放射性)(每克组织含35％的总注入放射性)。单克隆抗体主要经肾脏排泄(图12)。实施例914F7单克隆抗体在患有P3X63腹水性骨髓瘤的BALB/C小鼠中的抗肿瘤效应。
20-22克重量的雌性Balb/c小鼠，每两天静脉注射6剂量溶于磷酸盐缓冲液的14F7单克隆抗体(一组用0.1mg，第二组用0.2mg)。实验前三天，用不完全弗氏佐剂刺激腹膜以利于肿瘤的检测。实验开始时用1000个鼠P3X63骨髓瘤细胞通过腹膜内途径接种，同时开始用14F7单克隆抗体的被动治疗，尽管它是通过静脉内途径接种的。用于比较的良好预期对照是第三组(最佳治疗)，在所有实验期间每周静脉注射一次环磷酰胺，剂量为每公斤体重20毫克。用pH7.4磷酸盐缓冲液静脉注射作为空白对照。
图13表示前述4组的生存结果。用14F7单克隆抗体(0.1和0.2mg)和20mg/kg的环磷酰胺治疗的动物未见肿瘤。
生存结果表明14F7单克隆抗体治疗组较好。尽管对照组没有存活的动物，实验第30天时第一组(0.1mg单克隆抗体)和环磷酰胺治疗组仍然有6例存活，第二组(0.2mg单克隆抗体)有7例存活。治疗的第60天，第一组的2例和环磷酰胺治疗组的2例存活，而第二组仍然有5例存活。实施例10无胸腺小鼠中实体P3X63骨髓瘤的肿瘤生长抑制10只来自远系杂交NMRI、重量为20-22克的雌性无胸腺小鼠，于实验开始时用106个P3X63骨髓瘤细胞系的细胞经皮下免疫接种。将动物分为两组，每组5例。
一组用纯化的14F7单克隆抗体于腹膜内注射开始实验，2天一次，一次0.15mg(6次剂量)。而另一组用磷酸盐缓冲液，以同样的途径、剂量和时间间隔进行实验作为对照。
图14表示用14F7单克隆抗体的小鼠中肿瘤生长的抑制，相对于对照组，观察到两组间显著差异。
附图简述图1表示用NGcGM3/VLDL/完全弗氏佐剂免疫制剂免疫小鼠，在实验56天时得到的针对NGcGM3而非针对GM3的血清抗体水平。
图2通过ELISA测定，在小鼠接受4次0.2mg NGcGM3/VLDL/完全弗氏佐剂后3个月，小鼠血清中针对NGcGM3神经节苷脂的抗体反应同种型。
图3通过ELISA测定14F7单克隆抗体的亚类。
图4使用薄层层析通过免疫染色识别在14F7单克隆抗体的特异性研究中使用的N-乙醇酰和N-乙酰化神经节苷脂。
图5用14F7单克隆抗体在薄层层析上通过免疫染色识别NGcGM3神经节苷脂。
图6在免疫组织化学研究中14F7单克隆抗体不识别正常成人组织。
图7在免疫组织化学研究中14F7单克隆抗体识别一些人类恶性和良性肿瘤。
图8在免疫组织化学研究中14F7单克隆抗体识别正常人胚胎组织。
图9通过流式细胞仪，14F7单克隆抗体识别表达NGcGM3神经节苷脂的P3X63骨髓瘤细胞系。
图10通过流式细胞仪的安妥碘技术，用P3X63骨髓瘤细胞系研究14F7单克隆抗体的非补体依赖性细胞毒性效应。
图1199mTc标记的14F7单克隆抗体的生物分布。相对于所研究的正常Balb/c小鼠，其每克器官重量中gamma放射性的百分率。
图1299mTc标记的14F7单克隆抗体的生物分布。相对于所研究的患有P3X63骨髓瘤的Balb/c小鼠，其每克器官重量中gamma放射性的百分率。
图13各组Balb/c小鼠中14F7单克隆抗体被动治疗的抗肿瘤效应，这些小鼠经P3X63鼠腹水骨髓瘤接种，用所述的抗体0.1和0.2mg治疗，与使用20mg/kg环磷酰胺治疗和PBS处理的对照组进行比较。
图14远系杂交无胸腺小鼠NMRI中鼠P3X63实体骨髓瘤的体内肿瘤生长抑制。
权利要求
1.针对NGcGM3神经节苷脂产生、特异识别神经节苷脂和糖蛋白中N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的单克隆抗体，是IgG1亚类并具有对带有上述序列的肿瘤细胞的细胞溶解活性。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述对带有N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的肿瘤细胞的细胞溶解活性可以是直接或补体介导的。
3.根据权利要求1和2所述的单克隆抗体，命名为14F7，从相同名字的杂交瘤获得，并于1998年10月19日以临时注册号98101901保藏于英国的欧洲动物细胞保藏中心ECACC。
4.产生权利要求3的单克隆抗体的杂交瘤，于1998年10月19日以临时注册号98101901保藏于英国的欧洲动物细胞保存中心ECACC。
5.一种药物组合物，含有一定数量的权利要求1-3的单克隆抗体，另外含有稀释剂或适当赋形剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗体可以与治疗性试剂如药物、放射性同位素、免疫调节剂、植物凝集素和毒素结合。
7.根据权利要求5和6所述的药物组合物，用于治疗恶性肿瘤。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，用于治疗乳腺、肾脏、消化系统肿瘤和人类黑色素瘤。
9.含有权利要求1到3的单克隆抗体的试剂，与标记物如酶、生色基团、Chimio-发光物和放射性核苷酸结合。
10.根据权利要求9所述的试剂，用于检测肿瘤细胞。
11.根据权利要求10所述的试剂，用于检测人类黑色素瘤、乳腺、肾脏和消化系统如肝脏、结肠、胃和直肠的肿瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及免疫学和人类医学领域,具体地涉及制备和选择针对恶性肿瘤中N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列的单克隆抗体/单克隆抗体。本发明的一个目的是提供一种IgGl亚类的单克隆抗体,其特征在于高度特异性地识别乳腺恶性肿瘤组织,黑色素瘤,肝脏、胃、结肠、直肠和肾脏肿瘤中存在的N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列。它还具有对带有N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列的肿瘤细胞的细胞溶解作用,因此可用于诊断和治疗某些肿瘤疾病。本发明的另一个目的是提供产生所提及的单克隆抗体的杂交瘤和含有单克隆抗体的药物组合物,用于治疗肿瘤疾病。
文档编号C12P21/08GK1256696SQ99800261
公开日2000年6月14日 申请日期1999年2月5日 优先权日1998年2月5日
发明者A·卡尔比雷茨, Z·马所拉赫尔拉, L·E·菲纳德茨默里那, A·M·瓦茨科斯洛比茨, A·穆雷特斯伊拉, R·比雷茨洛德里格茨 申请人:分子免疫中心