专利名称：4－半乳糖基－木糖在评估人体内肠乳糖酶缺乏的非侵入性诊断试验中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药学领域，可应用于医学领域中，其作为一种检测人体内肠乳糖酶缺乏的非侵入性诊断试验，应用于评估该酶的活性，另外也应用于其它任何需要评估体内酶水平的正常或病理状态。
现有技术首先在小肠的粘膜内发现了肠乳糖酶，该酶的活性中心暴露于肠的内腔，其为一种负责水解牛奶中的乳糖的酶。乳糖在肠中不能被直接吸收，因此需要先将其水解为半乳糖和葡萄糖，最终半乳糖和葡萄糖被吸收。肠乳糖酶缺乏将导致乳糖吸收不良和乳糖不耐受。如果缺乏该酶，则乳糖在小肠中不能被水解，这将延迟胃排空速度，延长肠通过时间，增大渗透压，延长流体在肠内腔的滞留时间，由此引起细菌在结肠中发酵，产生气体，如氢气、甲烷和二氧化碳，并生成短链脂肪酸。上述情况将造成消化作用减慢，并减少单糖的吸收。这将导致疼痛、胃痉挛、腹胀、听得见的肠鸣和腹泻。对于成年人上述临床表征被称作低乳糖酶症或乳糖不耐受，这是一种最常见的遗传疾病，几乎影响人类的大约一半的人口。对于新生儿，酶的先天性缺乏将抑制乳糖的正常利用，减少了能量供应，以及造成未水解二糖在肠道中的累积，这将引起严重的疾病，如强烈腹泻和脱水，这样的新生儿需要早期诊断，改变食物结构，服用不含乳糖的牛奶。此外，乳糖缺乏还对多数肠道疾病具有继发性影响，其中肠道疾病涉及到肠道粘膜不同程度的损坏，如乳糜泻、慢性肠道感染(Crohn’s疾病和溃疡性结肠炎)、痉挛性结肠综合症、肠切除、囊性纤维化、早产新生儿、化疗的实施、或者在某些老年人中作为附加疾病的上述疾病。因此，在胃肠病学和儿科学、病理学方法中非常关注乳糖酶活性的评估，其中在病理学方法中通常需要评估肠道粘膜的功能完整性或需要作是否缺乏该酶的区分性诊断。迄今为止，诊断肠道乳糖酶是否缺乏的方法基于如下方面-通过内窥检查术活检获取患者小肠内膜样品，对上述样品的乳糖酶直接进行评估(1)。
-口服过量的乳糖(1-2g/公斤体重)，评估由于乳糖酶缺乏所造成的代谢后果，如个体所表现出的乳糖酶缺乏症状(腹痛、腹胀、腹泻等)，并评估血浆中葡萄糖的量(2)、血浆(2)和尿(3)中半乳糖的量、和粪便(4)中碳水化合物的量。对服用过量乳糖后所呼出的气体进行评估，气体是在服用过量乳糖后结肠中未代谢乳糖进行发酵所产生的，如评估所呼出的气体中的氢气(5)、14CO2(6)、或13CO2(7)，或另外再评估13CO2/H2(8)的比例，其中所服用的乳糖分别含有14-C-乳糖或13C-乳糖。在服用过量包含13C-乳糖和2H-葡萄糖的乳糖后，评估血清中13C/2H-葡萄糖(9)的比例。
评估肠道乳糖酶的其它方法是应用某些特定的二糖，该二糖在结构上与乳糖类似，因而具有作为乳糖酶底物的功能。因此在服用后，其被肠道乳糖酶转化为特定的单糖，然后单糖被肠道内膜吸收，在个体的尿排泄物中可以检测到某个或某些单糖。因此，西班牙专利ES-P-478590和ES-P-482073记载了下述体内评估方法口服施用3-O-甲基乳糖，评估尿中的3-O-甲基-D葡萄糖。
另一方面，西班牙专利ES-P-9001680记载了二糖4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的制备方法，该二糖的分子式为 其被用于体内评估肠道乳糖酶的活性。上述二糖是口服施用，作为肠道乳糖酶的底物，其在肠道中水解为木糖和半乳糖，然后被吸收，其中木糖在尿中排泄，因此可以使用简单的比色法直接对其进行滴定。排泄的木糖的量与肠道乳糖酶的水平相关。
西班牙专利ES-P-9001680也记载了制备4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的方法，其包含从苯甲基β-b-吡喃木糖苷进行合成的过程，其中包含选择性保护反应、糖基化反应和去保护反应。
西班牙专利ES-P-9502185记载了制备二糖吡喃半乳糖基-木糖混合物的酶促反应方法，该混合物包含4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖及其异构体2-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖和3-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖。西班牙专利ES-P-9502185也记载了上述三种异构体的混合物在评估未断奶老鼠体内肠道乳糖酶活性方面的用途，研究结果表明，在动物生长期间，口服施用了上述混合物的动物，其尿中木糖的排泄量与其尸检肠道粘膜后所得到的肠道乳糖酶活性成比例关系。
西班牙专利ES-P-20010419记载了一钟制备4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的酶促反应方法，该方法包含D-木糖和β-D-吡喃木糖苷底物之间的酶促反应，和后续的分离、纯化4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的步骤。
本发明的一个方面是公开根据西班牙专利ES-P-20010419记载的方法制备的4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖在评估人体内肠道乳糖酶活性是否缺乏的一种非侵入性诊断试验中的用途。同时本发明使用了一种不同于上述专利所记载的替代方法，即评估血液中木糖的含量，该方法对于诊断试验的实施具有实质性的优点。
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发明描述在前面所描述的当前用于诊断肠道乳糖酶是否缺乏的方法存在一些缺点，也就是可靠性不足并且使患者感到非常不舒服，除此之外还需要下文中所述的专门的仪器。通过内窥检查术利用活检方法对患者小肠粘膜样品进行乳糖酶直接评估的方法，除了是一种血腥的和侵入性的方法外，还需要X-射线控制器，但其结果仅表明肠道特定部位或区域的酶的活性。此外，因为内窥镜在进入时具有局限性，因此该方法通常不能获取酶最大量存在区域(中间空肠)的检测结果，并且该方法所获得的结果在不同样品间不具备可比性。因此，该方法不能提供个体酶总活性的信息。除此之外的其它方法均是非侵入性试验，包含口服过量乳糖(从25到50g)，随后评估乳糖酶缺乏对代谢所造成的影响，如检测所呼出的气体，其中该气体是大肠中的细菌对未水解乳糖进行代谢的结果。这些试验是非直接的，不能实现酶活性的体内直接测定，并且这些试验受到个体内源性气体产生能力的影响，如H2或CO2。此外，该产生能力对于不同的个体是有差别的，其受到不同因素的影响，如吸烟的习惯、饮食习惯、轻泻药物或口服抗生药物的使用，因此产生很大比例的假阳性结果和假阴性结果，因此说上述方法不十分可靠。另一方面，在服用过量乳糖的试验中需要摄入比生理平衡膳食高的多的糖，对于乳糖酶缺乏的个体，这会导致严重的胃肠问题，如腹痛、腹胀和腹泻。对于怀疑乳糖酶缺乏的未断奶的婴儿，服用过量的乳糖有可能是非常危险的，因为这会导致严重的腹泻，并具有潜在脱水的危险，所以很明显对于未断奶的婴儿需要使用其它类型的试验。服用过量乳糖的试验和其不同类型的试验，在实施时需要专门的仪器，如气相色谱或电化学检测仪，以测定所呼出的气体，这些仪器尽管在医院中很常见，但是在健康中心则一般不常见到。另外在服用过量1-14C-葡萄糖或13C-乳糖/2H-葡萄糖的情况下，还需要使用闪烁计数器或更加专门更加专业的仪器，如气相色谱或质谱，来检测14CO2、13CO2、13C/2H-葡萄糖的含量。口服施用3-O-甲基乳糖，随后评估尿中3-O-甲基-D-葡萄糖的方法，迄今为止在临床实践中还未见应用，一方面该方法使血液吸收了非生理性的化合物，如3-O-甲基-D-葡萄糖，而且还需要气相色谱或高效液相色谱来测定其含量。
发明目的本发明提供了一种体内评估肠道乳糖酶活性的技术，该技术是对该酶的一种非侵入性诊断试验，其将个体作为一个整体直接评估酶的总活性，从而克服了上述现有诊断试验所存在的不足。该技术不需要评估乳糖酶缺乏所产生的后果。不需要专门的仪器，并且对乳糖酶缺乏的患者不会造成明显不舒服的感觉，此外该技术除具有上述优点外，还具备可靠性高的优点，该优点将在下面加以描述。
在该方法中，对人体使用了4-半乳糖基-木糖，并结合使用了一种评估尿中木糖的替代技术，该方法包括向患者施用4-半乳糖基-木糖，之后评估血液中木糖的浓度。对于每位患者，仅需要抽取极少量的血液样品(2-3滴)，所以该方法尤其适用于儿童和新生儿，因为该方法对上述个体仅产生很少的不适感，并且该方法更加可靠。
发明简述本发明的目的是基于4-半乳糖基-木糖(4-O-β-吡喃半乳糖苷-D-木糖)。该化合物是乳糖的结构类似物，是乳糖酶的生理性底物，这样口服施用上述化合物后，该化合物即被肠道粘膜的酶水解。反应产物进入血液，其中之一即木糖出现在尿中，可以通过一种简单的比色方法对其进行滴定。可选择的，本发明公开了评估血液中木糖的方法，该方法仅需要几滴血液样品，并能够给出高灵敏度的木糖测定结果。该替代方法具有实质性的优点，特别是对于未断奶的婴儿和儿童，该方法不需要几小时的取尿时间，仅产生很小的不适感，并且可靠性更高。本发明显示，乳糖耐受的人体在摄入4-半乳糖基-木糖后，在其尿和血液中检测到木糖的存在，这是上述个体肠道乳糖酶活性表达的结果。同时本发明还显示，给患有肠道乳糖酶缺陷症(乳糖不耐受)的人体施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄以及木糖在血液中的浓度均有所减少。此外，本发明第一次证明使用4-半乳糖基-木糖并评估尿中木糖的含量能够可靠且简单地区分乳糖酶缺乏的个体和仅是对牛奶中的某些成分敏感的个体。与现有的诊断肠道乳糖酶是否缺乏的方法相比，本发明所公开的方法具有如下的优点高度可靠性，本发明方法是一种直接评估酶活性的方法，其仅评估尿或血浆中木糖的含量，而不需要评估乳糖酶缺乏对代谢造成的影响，如未水解的二糖在结肠中发酵而生成的H2或CO2。因此，在本部分第一段所描述的那些因素不会对由本发明方法所获得的结果带来任何影响，其中上述因素影响了内源性气体产生、并由此显著降低了服用过量乳糖后所呼出气体的检测结果可靠性，并经常产生假阳性和假阴性结果。
所提供的信息直接代表着个体体内总乳糖酶活性。
高度灵敏度使用基于fluoroglucinol反应的比色分析方法对木糖进行滴定时，其检测下限是从0.1到0.05μg。
所需要的仪器很简单，在任何健康中心，即使是最小型的临床生化实验室，也是常见的，因为上述酶体内评估方法仅需要木糖滴定，其可以通过简单的比色试验来完成。
在实施该试验时，不会给乳糖酶缺乏患者带来任何胃肠不适，这是因为口服施用的4-半乳糖基-木糖的剂量非常小，对于成年人，剂量为0.25g时就能在尿中检测到一定量的木糖，剂量为3.0g时就能在血液中检测到一定量的木糖。因此可以预见对于儿童，需要施用的剂量会更低。降低二糖剂量的原因是本发明木糖评估所具有的高度灵敏度。还应该值得注意的是，肠道乳糖酶水解4-半乳糖基-木糖产生了两种生理性产物，半乳糖和木糖，这两种糖最终会被肠道粘膜吸收。
实施本发明方法不需要个体的积极配合，因此该方法对于未断奶的婴儿尤其适合。
本发明方法不需要给个体施用带有同位素标记的化合物。
附图1以发育期间未断奶大鼠为试验材料，口服施用4mg 4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情况(黑色圆圈)和肠道乳糖酶活性(白色圆圈)。
附图2以发育期间未断奶大鼠为试验材料，口服施用8mg 4-半乳糖基-木糖后，其血浆中的木糖水平(黑色圆圈)和肠道乳糖酶活性(白色圆圈)。
附图3以对牛奶摄入耐受的成年人志愿者为试验者(个体1，男性)，口服施用1g 4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情况。
附图4以两个对牛奶摄入耐受的成年人志愿者为受试者(个体1，男性；个体2，女性)，分别施用不同剂量的4-半乳糖基-木糖后，随着时间的推移，木糖在尿中的排泄情况。
附图5以人志愿者为受试者，将250mg的4-半乳糖基-木糖分别口服施用给三个男性牛奶耐受者(个体1(黑色圆圈，白色圆圈)、个体7(黑色三角，白色三角)和个体11(黑色方框，白色方框))和5个女性牛奶耐受者(个体2(黑色圆圈，白色圆圈)、个体3(黑色方框，白色方框)、个体6(黑色菱形，白色菱形)、个体8(黑色反三角，白色反三角)和个体9(黑色三角，白色三角))，随着时间的推移，木糖在尿中的排泄情况。
附图6将0.25g 4-半乳糖基-木糖口服施用给三位对牛奶不耐受的志愿者(个体12(男性)、个体5(女性)和个体10(女性))，随着时间的推移，木糖在尿中的排泄情况。
附图7在摄入0.28g的4-半乳糖基-木糖后，利用气相色谱分别对牛奶摄入耐受的个体1和牛奶不耐受的个体12进行分析，结果显示了木糖在尿中的排泄情况。
附图8以成年人志愿者为受试者，将3g 4-半乳糖基-木糖分别口服施用给对牛奶摄入具备正常耐受的个体1(白色圆圈)和个体2(黑色圆圈)，以及施用给低乳糖酶症的个体12(黑色方框)，结果显示了木糖在血浆中的水平。
发明详述本发明方法由在禁食至少8个小时后，给人体口服施用4-半乳糖基-木糖的水溶液。然后在特定的时间间隔后，评估排泄在尿中的木糖的量。该方法还可以通过评估血液中存在于血浆或血清中的木糖的量来实施，其中血液样品是在摄入二糖一段时间后抽取的。可以通过比色分析方法来滴定木糖，该分析方法是基于与fluoroglucinol的反应，并根据所使用的方案，选择基础尿液、基础血浆、或者基础血清作为对照。一旦摄入4-半乳糖基-木糖，其即被肠道乳糖酶水解，生成酶促反应产物，半乳糖和木糖，然后上述两种糖通过肠道粘膜吸收到血液中。之后，木糖排泄到尿中，因此在摄入二糖后，血液中和尿中木糖的量直接反应了体内乳糖酶的活性。
用于实施本发明的4-半乳糖基-木糖可以根据西班牙专利ES-P-20010419所记载的方法进行制备。
在口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量，以及在血液中的含量与肠道乳糖酶活性非常相关，对于未断奶大鼠的检测结果显示在附图1和2中，并在实施例1和2中加以了描述。
具备乳糖正常消化能力或乳糖耐受的成年人志愿者，也就是说那些具备正常水平的肠道乳糖酶活性，在摄入牛奶或任何其它奶产品后没有任何类型的胃肠不适或胃肠疾病的人，这些人在摄入4-半乳糖基-木糖8小时后，在其尿中检测到木糖的持续排泄，这是二糖被肠道乳糖酶水解的结果。上述结果表明4-半乳糖基-木糖是人肠道乳糖酶的一种体内底物，上述结果显示在附图3、4和5中，并在实施例3到11中加以了描述。
乳糖耐受的成年人志愿者，施用4-半乳糖基-木糖的量分别为0.25g、0.5g、1g和3g时，发现木糖在尿中的排泄量随着摄入量的增加而增加。在对个体的研究中，发现摄入4-半乳糖基-木糖不会造成任何胃肠不适或胃肠疾病。这表明个体对木糖的排泄量与所施用的4-半乳糖基-木糖的剂量是相关的。当个体摄入4-半乳糖基-木糖的剂量为0.25g时，在其尿中就能检测到可靠的木糖含量结果，上述结果显示在附图4中，并在实施例4和5中加以了描述。
当给同一性别乳糖耐受的成年人志愿者施用相同剂量的4-半乳糖基-木糖时，不同个体排泄在尿中的木糖的含量均在同一范围内。这表明使用该方法所得到的结果是可靠的，在不同正常个体之间具备再现性，上述结果显示在附图5中，并在实施例4到11中加以了描述。
给乳糖不耐受的成年人志愿者，即肠道乳糖酶缺乏携带者，施用0.25g的半乳糖基-木糖，发现其尿中木糖的排泄量显著低于乳糖耐受志愿者的平均值，降低的程度代表着乳糖酶缺乏的程度。这是从两个乳糖酶不耐受的个体观察到的结果，其中之一在以前已被诊断为患有严重的低乳糖酶症，另一个个体自称从出生即对乳糖不耐受，上述结果分别显示在附图6A和6B中，并在实施例12和13中分别加以了描述。这两个乳糖不耐受的个体在摄入4-半乳糖基-木糖后，没有产生任何类型的胃肠不适或胃肠疾病。这表明，本发明方法适用于体内评估肠道乳糖酶活性，并且是一种有效的对人体乳糖酶是否缺乏进行非侵入性诊断的试验方法。该方法不会给乳糖酶缺乏的个体造成明显的不适感，而且仅需要施用0.25g剂量的4-半乳糖基-木糖，就能获得是否极度缺乏该酶的可靠的检测结果。
口服施用4-半乳糖基-木糖，随后评估尿中木糖的含量，上述过程能够将乳糖不耐受的患者，即肠道乳糖酶缺乏携带者，与对牛奶的摄入不耐受的患者区分开来，其中后者之所以对牛奶不耐受是因为他们对牛奶中的一些成分过敏，他们不是真正的乳糖酶缺乏携带者，其尿中木糖的排泄量在正常的范围内。上述结果显示在附图6C中，并在实施例14中加以了描述。附图6C显示了自称乳糖不耐受的成年志愿者在摄入0.25g的4-半乳糖基-木糖后，尿中木糖的排泄情况，该志愿者自称从小以来他摄入牛奶或奶产品后就发生过敏性皮肤反应，他的木糖排泄情况与乳糖耐受的女性志愿者的平均值没有显著的差别。该过敏性乳糖不耐受的成年女性志愿者在摄入4-半乳糖基-木糖后，没有产生任何过敏反应或任何类型的胃肠疾病。
给乳糖耐受的个体施用0.25g的4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情况，和对低乳糖酶症个体施用上述二糖后，木糖在尿中排泄降低的情况，显示在附图7中，并在实施例15中加以了描述，其中所使用的木糖评估技术不同于上述与fluoroglucinol的比色反应，这样的技术如气相色谱。另外上述附图7还显示出乳糖不耐受的低乳糖酶症个体在施用4-半乳糖基-木糖后，其尿中木糖的排泄量显著低于乳糖耐受的个体。
给乳糖耐受的成年人志愿者口服施用3g的4-半乳糖基-木糖后，使用fluoroglucinol的比色滴定法滴定血浆中的木糖，发现木糖含量在摄入二糖2小时后达到最大值。给被诊断为低乳糖酶症的乳糖不耐受成年人志愿者口服施用相同剂量的4-半乳糖基-木糖，其在摄入二糖2小时后所检测到的血浆中木糖的含量显著低于上述乳糖耐受的志愿者。上述试验对乳糖不耐受的上述个体没有造成任何胃肠不适或胃肠疾病。上述结果显示在附图8中，并在实施例16中加以了描述，并且该结果表明口服施用4-半乳糖基-木糖，之后评估血液中的木糖的含量，这样就能够对肠道乳糖酶活性进行体内评估，并且这是一种有效的对人体乳糖酶是否缺乏进行非侵入性诊断的试验方法。
为了考察乳糖耐受或乳糖不耐受的人志愿者口服施用4-半乳糖基-木糖后，其血液和尿中木糖含量随时间的推移而变化的情况，使用木糖fluoroglucinol比色滴定法，使用了成年个体的如下体液样品在摄入4-半乳糖基-木糖前的基础尿液，摄入上述化合物后3小时或4小时的总尿液，或其它样品，包括摄入4-半乳糖基-木糖前的基础血液样品，和另外一个施用上述化合物后2小时时所抽取的血液样品。对于上述血液样品，只需要0.2ml(2-3滴)就足够了。
另外，该试验方法非常适用于儿童和未断奶的婴儿，用于评估尿中以及血液中的木糖的含量。口服施用的4-半乳糖基-木糖的剂量可以降低一半，使用0.2ml(2-3滴)或接近该值的血液样品就足够了。
评估血液中木糖的含量具有实质上的优点，因为实施该方法只需要50μl的血清或血浆，因此对于每个血液样品只要2-3滴就足够了。一般来说，这尤其适用于未断奶的婴儿和儿童，对于他们来说，连续收集几个小时的总尿液是很困难的，不能确保收集到的尿液的量，而且还有可能在会阴部位造成皮肤反应。本发明评估方法具有更小的不适感，而且结果更加可靠。
发明实施例实施例1口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量和木糖在血液中的含量与肠道乳糖酶活性的相关性。该实施例对未断奶大鼠进行了比较研究，在动物生长期间，给它们口服施用4-半乳糖基-木糖，之后对其尿中木糖的排泄量与其尸检肠道粘膜后所得到的肠道乳糖酶的活性进行了比较，其中已知酶活性在生长期间具有生理性降低的特性。为了实施该试验，将两窝出生12天共20只的未断奶大鼠与各自的母鼠分离，禁食6小时。之后，通过腹部向膀胱施加压力收集每只大鼠的基础尿液，之后使用食管内探棒立即给每只大鼠施用4mg稀释在0.3ml蒸馏水中的4-半乳糖基-木糖。从此时开始，收集随后6小时内的尿液，并通过基于与fluoroglucinol反应的比色分析方法对排泄到尿液中的木糖进行滴定，并以基础尿液作为对照。收集完尿液后，立即将其中4只动物杀死，对其肠道粘膜的乳糖酶活性直接进行评估。切割动物的一段小肠，洗涤，用玻璃将粘膜刮下，并将收集到的粘膜匀浆。用分光光度计测定匀浆产物的乳糖酶活性。剩余的动物放回母鼠处，然后在15、18、21、26和35天时在类似条件下重复上述试验，到最后该组所有的动物均被杀死了。上述试验的结果显示在附图1中。从该图可以看到1)由于肠道乳糖酶的作用，所施用的4-半乳糖基-木糖被水解，在尿中检测到了木糖的存在；2)在动物生长期间，口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄速度与已知的肠道乳糖酶活性在生长期间的生理性降低相一致。木糖在尿中的排泄量与肠道乳糖酶的活性极其相关，两组参数之间的线性相关系数(r)为0.96，如附图1插图所示。以前的试验发现无论动物的年龄是多大，当所施用的4-半乳糖基-木糖的剂量从2到32mg时，木糖在尿中的排泄量总随着口服施用4-半乳糖基-木糖的量的增加而增加，其中二糖均稀释在0.3ml的水中。上述试验表明本发明方法能够用于评估体内肠道乳糖酶的活性。该方法可以用于诊断目的的酶活性的非侵入性评估，而且不出血。
实施例2口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量和木糖在血液中的含量与肠道乳糖酶活性的相关性。该实施例对未断奶大鼠进行了比较研究，在动物生长期间，给它们口服施用4-半乳糖基-木糖，之后分析了其血清中木糖的含量，并与其尸检肠道粘膜后所得到的肠道乳糖酶的活性进行了比较。为了实施该试验，将两窝出生12天共60只的未断奶大鼠从各自的母鼠处拿开，禁食6小时。之后，通过心脏穿刺的方法抽取每只大鼠的基础血液，之后使用食管探棒立即给每只大鼠施用8mg稀释在0.3ml蒸馏水中的4-半乳糖基-木糖。施用二糖3小时后，抽取另外一组血液样品。通过样品离心获得血浆或上清液部分，将基础血液的血浆作为对照，通过与fluoroglucinol反应的比色分析方法滴定其中的木糖。抽取血液后立即将其中4只动物杀死，并按照实施例1中所描述的方法对动物肠道粘膜的乳糖酶活性直接进行评估。剩余的动物放回母鼠处，然后在15、18、21、26和35天时在类似条件下重复上述试验，到最后该组所有的动物均被杀死了。上述试验的结果显示在附图2中。从该图可以看到1)由于肠道乳糖酶的作用，所施用的4-半乳糖基-木糖被水解，在血浆中检测到了木糖的存在；2)在动物生长期间，口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在血浆中出现速度与肠道乳糖酶活性在生长期间的生理性降低相一致，木糖在血浆中的出现与肠道乳糖酶的活性极其相关，两组参数之间的线性相关系数(r)为0.98，如附图2插图所示。在前的试验发现，木糖在血浆中的含量大约在口服施用4-半乳糖基-木糖后3小时达到最高水平，当二糖的剂量是在4和16mg之间时，木糖在血浆中的含量随着口服施用4-半乳糖基-木糖的量的增加而增加，而与动物的年龄无关，上述二糖均稀释在0.3ml的水中，此外，血清中木糖的含量与血浆的评估结果类似，其中血清是将血液样品室温下沉淀20分钟并随后进行离心而得到的。该试验表明，口服施用4-半乳糖基-木糖，并随后评估木糖在血浆或血清中的含量，同样能够用于评估体内肠道乳糖酶的活性。该方法可以用于诊断目的的酶活性的非侵入性评估。
下面描述一系列的本发明实施方式，这些实施方式是对不同的成年人志愿者实施的，这些志愿者均被书面告知了所要进行的研究，并得到了他们志愿参加该项试验的书面同意。
实施例34-半乳糖基-木糖是人肠道乳糖酶的一种体内底物。将1g 4-半乳糖基-木糖溶解在50ml的水中，口服施用给一位禁食8小时的成年男性志愿者(个体1)，其中该志愿者对牛奶和牛奶产品具有正常的耐受性，也就是具有乳糖耐受性。在摄入4-半乳糖基-木糖前收集该个体的基础尿液样品，并在摄入二糖后的8小时内，每小时收集一次尿液样品，每一样品均是每一时间间隔内排泄的总尿液。通过基于与fluoroglucinol反应的比色分析方法对所有的样品进行木糖滴定，并以基础尿液作为对照。该个体摄入4-半乳糖基-木糖后没有产生任何的胃肠不适或胃肠疾病。该试验的结果显示在附图3中，该图显示了每一样品的木糖含量(白色圆圈)，和随着时间的推移，木糖在尿液中累积达到的量(黑色圆圈)，累积量通过将每一样品的木糖含量与之前所有样品的木糖含量相加获得。从附图1可以看出1)在个体口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖被排泄到了尿中2)木糖在尿中的排泄量在施用该化合物2小时后达到最大值，并在尿中逐渐累积。该试验表明4-半乳糖基-木糖是人肠道乳糖酶的一种体内底物，并且表明，口服施用4-半乳糖基-木糖并随后评估木糖在尿液中的排泄量能够用于人肠道乳糖酶活性的体内评估，该方法能够用于诊断目的的非侵入性酶活性的评估。
实施例4和5乳糖耐受的成年人志愿者，木糖在尿液中的排泄量随摄入4-半乳糖基-木糖的量而变化。在与实施例1描述的相同的条件下，将0.25g、0.5g和3g的4-半乳糖基-木糖分别施用给一位乳糖耐受的成年男性志愿者(个体1，实施例4)和一位乳糖耐受的成年女性志愿者(个体2，实施例5)，并使用与fluoroglucinol反应的比色方法滴定两位志愿者在摄入二糖后、不同的时间内排泄到尿液中的木糖的量。对于同一志愿者，两次摄入4-半乳糖基-木糖之间的时间间隔是大约1周。在所使用的剂量下，4-半乳糖基-木糖的摄入没有给上述两位个体带来任何胃肠不适或胃肠疾病。该试验的结果显示在附图4A(个体1，实施例4)和附图4B(个体2，实施例5)中，其中显示了在每一施用剂量下，在摄入4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿液中累积的量。附图4A包括了来自附图3的同一个体在摄入1g二糖后所获得的数据，这样可以与其它的施用剂量相比较。从附图4A和4B可以看出1)个体1(附图4A)以及个体2(附图4B)在摄入4-半乳糖基-木糖后，在不同的时间内木糖在尿液中的排泄量随着施用量的增加而增加；当4-半乳糖基-木糖的剂量为0.25g时，在上述两个个体的尿液中就能很容易地检测到木糖的存在。这些试验表明1)当口服施用二糖的剂量为0.25g、0.5g、1g和3g时，乳糖耐受的成年人志愿者，其尿液中木糖的排泄量随着摄入二糖剂量的增加而增加，上述所使用的剂量在实施该试验的过程中，均没有导致任何胃肠不适或胃肠疾病；和2)当4-半乳糖基-木糖的剂量为0.25g时，就足以在摄入二糖后从尿液中得到非常可靠的木糖检测结果。
实施例6到11当给相同性别、乳糖耐受的不同成年人志愿者施用相同剂量的4-半乳糖基-木糖时，不同个体排泄到尿液中木糖的比例均在相同的范围内。实施过程如下在与实施例1描述的相同条件下，将0.25g的4-半乳糖基-木糖施用给8位乳糖耐受的成年志愿者，其中3位男性(个体1，实施例4；个体7，实施例6；个体11，实施例7)和5位女性(个体2，实施例5；个体3，实施例8；个体6，实施例9；个体8，实施例10；个体9，实施例11)，同样使用与fluoroglucinol反应的比色方法滴定个体在摄入二糖后、不同时间内排泄到尿液中的木糖的量。在所使用的剂量下，4-半乳糖基-木糖的摄入没有给这些个体带来任何胃肠不适或胃肠疾病。这些试验的结果显示在附图5A、5B、5C、和5D中，该图显示了每一样品的木糖含量(白色符号)，和随着时间的推移，木糖在尿液中累积达到的量(黑色符号)，累积量通过将每一样品的木糖含量与之前所有样品的木糖含量相加获得。5A显示了每位男性个体的数据(个体1、3和6)。5B显示了每位女性个体的数据(个体2、3、6、8和9)。5C和5D分别显示了男性个体和女性个体的平均值±相应的标准偏差。附图5A包括了个体1在摄入0.25g的4-半乳糖基-木糖后所得出的数据(附图4A)；附图5B包括了个体2在摄入0.25g的4-半乳糖基-木糖后所得出的数据(附图4B)，这样可以将他们与相同条件下试验的其余个体相比较。从附图5可以看出1)不同的个体尿液中木糖的累积量在相同的范围内，男性的平均标准偏差不超过37％，女性的平均标准偏差不超过8％；和2)在摄入二糖后2小时和3小时之间，木糖的排泄量达到最大值。这些试验表明该方法所得出的结果对于两组个体具有可靠的再现性。
实施例12和13给乳糖不耐受的人志愿者施用4-半乳糖基-木糖，随后评估尿液中的木糖排泄量，从而检测出肠道乳糖酶是否缺乏。实施过程如下将0.25g的4-半乳糖基-木糖施用给两位带有乳糖不耐受症状的志愿者，然后使用与fluoroglucinol反应的比色方法滴定两位个体在摄入二糖后、不同时间内排泄到尿液中的木糖的量。其中一位(个体12，实施例12)是一位64岁的老年男性患者，自从8岁以来，对牛奶摄入表现出严重的不耐受症状，在以前曾经通过肠道活检以及乳糖过量测试被诊断为低乳糖酶症。因此，他具有严重的肠道乳糖酶缺乏症。另外一个个体(个体5，实施例13)是一位30岁的女性，自称从出生就有乳糖不耐受症状。在那时有必要对她停止母乳喂养，给她食用不含乳糖的牛奶。假定她具有遗传性肠道乳糖酶缺乏症。在所使用的剂量下，4-半乳糖基-木糖的摄入没有给这两位个体带来任何胃肠不适或胃肠疾病。这些试验结果显示在附图6A(个体12，实施例12)和6B(个体5，实施例13)中，该图显示了两个个体在不同时间内尿液中累积的木糖的量(黑色符号)，对于每一个体，图中还包括了曲线部分，该曲线来自附图5C和5D，表示了与他/她性别相对应的乳糖耐受志愿者的平均值，其目的是为了便于比较。从附图6可以看出1)12号个体尿液中木糖的排泄量远远低于乳糖耐受志愿者的木糖排泄量平均值，该个体在摄入二糖后8小时内排泄到尿液中木糖的总量为1.33mg，而乳糖耐受的男性志愿者在相同的时间内，木糖排泄量的平均值为35.7±2.0mg，通过比较表明木糖排泄量降低了96％，该结果与先前诊断为严重肠道乳糖酶缺乏症的诊断结果相一致；2)5号个体尿液中木糖的排泄量远远低于乳糖耐受志愿者的木糖排泄量平均值。该个体在摄入二糖后8小时内排泄到尿液中木糖的总量为4.08mg，而乳糖耐受的女性志愿者在相同的时间内，木糖排泄量的平均值为23.5±2.0mg，通过比较表明木糖排泄量降低了83％，这表明该个体也具有遗传性重度肠道乳糖酶缺乏症，因为该个体从出生就表现出乳糖不耐受。上述试验表明本发明方法能够用于体内评估肠道乳糖酶活性，和用于非侵入性诊断人体是否缺乏该酶。该方法没有对乳糖酶缺乏的个体造成明显的不适感，4-半乳糖基-木糖的剂量为0.25g时，就能很可靠地检测出成年个体是否严重缺乏该酶。
实施例14给乳糖不耐受的人志愿者施用4-半乳糖基-木糖，随后评估尿液中木糖的排泄量，该方法能够将肠道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受患者和仅对牛奶摄入不耐受的患者区分开来，后者之所以对牛奶不耐受，是因为他们对牛奶中的某些成分过敏，并不是因为缺乏所述乳糖酶。实施过程如下给一位25岁的女性志愿者(个体13)施用0.25g的4-半乳糖基-木糖，随后使用与fluoroglucinol反应的比色方法滴定其在不同时间内排泄到尿液中的木糖的量，其中该个体从12岁起就表现出乳糖不耐受的症状，并且她自称摄入牛奶后就会发生急性皮肤过敏。使用上述剂量的4-半乳糖基-木糖没有给该个体造成任何胃肠不适或胃肠疾病。上述试验结果显示在附图6C中，该图显示了该受试者在不同时间内尿液中累积的木糖的量(黑色符号)。该图还包括了曲线部分，该曲线来自附图5D，表示了与他/她性别相对应的乳糖耐受志愿者的平均值，其目的是为了便于比较。从附图6C可以看出实际上该个体对木糖的排泄很正常，摄入二糖8小时内所排泄的木糖的总量与乳糖耐受的女性平均值相同。因此，考虑到该患者的临床自述，得出该个体不是缺乏该酶的问题，而是对牛奶中的某些成分过敏。该试验表明本发明方法能够将肠道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受患者和仅对牛奶摄入不耐受的患者区分开来，后者之所以对牛奶不耐受，是因为他们对牛奶中的某些成分过敏，并不是真正缺乏所述乳糖酶。
实施例15和16使用不同于与fluoroglucinol比色反应的木糖评估方法，观察乳糖耐受的受试者在施用0.25g的4-半乳糖基-木糖后，其尿液中木糖的排泄情况，以及乳糖不耐受的低乳糖酶症个体在施用上述二糖后，其尿液中木糖排泄量降低的情况。实施过程如下将0.25g的4-半乳糖基-木糖施用给一位乳糖耐受的志愿者[个体1(在实施例3中曾做过研究对象)，实施例15]，和一位患有严重肠道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受志愿者[个体12(在实施例12中曾做过研究对象)，实施例16]，然后使用气相色谱仪评估摄入二糖3小时内收集到的总尿液中的木糖的量，其中所使用的色谱仪有一个火焰电离检测器和一个12米长的玻璃螺旋柱，柱的内径是0.2mm，厚度是0.3μm。使用气相色谱检测尿液中的木糖需要将木糖转变为三甲基甲硅烷基衍生物的形式。因此首先将尿液样品冻干，然后溶解在20μl含吡啶的1mM苄基-β-D-吡喃木糖苷溶液中，其中的苄基-β-D-吡喃木糖苷是内参照物。然后另外加入20μl的N-三甲基甲硅烷基咪唑，其作为一种sililating试剂。用超声波将上述混合物处理一分钟，然后在60℃加热30分钟。然后将1-2μl的样品注入气相色谱仪。喷射器和检测器的温度是250℃，柱子的温度梯度如下180℃，2分钟，然后每分钟升高5℃，直至达到250℃。在该温度下保持15分钟。计算相应色谱图的峰面积，从而得出每个样品的木糖浓度。上述试验的结果显示在附图7中，其分别显示了乳糖耐受个体和乳糖不耐受个体的基础尿液样品的色谱结果和在摄入二糖3小时内收集到的尿液样品的色谱结果。木糖和内标准物的峰滞留时间均以分钟表示。附图7表明低乳糖酶症的个体12在摄入4-半乳糖基-木糖后，在3小时内排泄到尿液中的木糖的量同样远远低于乳糖耐受的个体1所排泄的量，这可以从色谱图中木糖所对应的峰面积看出。对于乳糖不耐受的低乳糖酶症个体12，使用该方法所检测到的结果是，在3小时内排泄到尿液中木糖的总量是2.1mg，而对于乳糖耐受的个体1，所检测到的结果是，在3小时内排泄到尿液中木糖的总量是25.2mg，相比之下总量降低了92％，这与该低乳糖酶症个体严重缺乏肠道乳糖酶相一致，而且所降低的水平与附图6A所示的同一个体在相同时间内使用比色滴定方法所检测到的降低结果类似。该试验表明本发明方法能够对人体进行肠道乳糖酶缺乏的非侵入性诊断，与用于评估木糖排泄量的方法无关。
实施例17-19口服施用4-半乳糖基-木糖，然后评估血液中木糖的含量，同样能够非侵入性诊断肠道乳糖酶是否缺乏。实施过程如下将3g 4-半乳糖基-木糖施用给两位乳糖耐受的志愿者[个体1，实施例17，个体2，实施例18(这两位在实施例3到6中曾做过研究对象)]，和一位乳糖不耐受的低乳糖酶症个体12[实施例19(该个体在实施例12和15中曾作为研究对象)]。使用fluoroglucinol比色滴定方法，分别对摄入二糖前的个体血液样品和摄入二糖后6小时内每间隔大约1小时时的血液样品进行滴定，检测上述血液样品血浆中的木糖的量，对于低乳糖酶症个体所检测的样品是基础血液样品，和摄入二糖4-半乳糖基-木糖后2小时的血液样品。3g 4-半乳糖基-木糖的摄入量没有给乳糖不耐受的个体12或乳糖耐受的两位个体造成任何胃肠不适或胃肠疾病。上述试验结果显示在附图8中，从该图可以看出1)乳糖耐受的个体1和2在口服施用4-半乳糖基-木糖后，在其血浆中检测到了木糖，这是该二糖被肠道乳糖酶水解的结果；2)上述两位个体，其血浆中木糖的含量在摄入4-半乳糖基-木糖大约2小时后达到最大值，然后逐渐降低，直至在6小时后检测不到，这是因为木糖进入了尿液中；3)对于乳糖不耐受的个体12，检测其摄入4-半乳糖基-木糖后2小时的血液样品血浆部分的木糖含量，检测结果为0.48μg/100μl血浆，而个体1在相似时间内检测到的木糖含量是1.72μg/100ml血浆，个体2检测到的结果是1.95μg/100ml血浆，通过比较发现乳糖不耐受的低乳糖酶症个体，其血浆中木糖的含量分别降低了72％和75％。综合考虑乳糖不耐受个体在摄入4-半乳糖基-木糖后2小时检测到的木糖的量为0.48μg/100μl血浆，以及滴定的灵敏度(木糖与fluoroglucinol反应的检测下限从0.1到0.05μ)，所以血清或血浆的体积为最小50μl时，就能获得可靠的检测结果，这只相当于0.2ml的血液(2到3滴)。上述试验表明口服施用4-半乳糖基-木糖，之后评估木糖在血液中的含量能够用于评估体内肠道乳糖酶活性，该方法是一种有效的非侵入性诊断个体是否缺乏该酶的试验方法。
权利要求
1. 4-半乳糖基-木糖用于评估尿液中木糖的存在从而作为肠道乳糖酶缺陷的诊断性试验用于体内评估该酶的用途，该方法包括给禁食至少8小时的个体口服施用4-半乳糖基-木糖水溶液，然后评估尿液中木糖的含量。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于尿液中木糖的含量是根据如下测定值之间的差异计算的，其中之一是摄入4-半乳糖基-木糖后收集到的总尿液的测定值，另一个是在个体摄入上述化合物前收集到的基础尿液的测定值。
3.根据权利要求1的用途，其特征在于所述个体是人。
4. 4-半乳糖基-木糖用于评估尿液中木糖的存在从而作为肠道乳糖酶缺陷的诊断性试验用于体内评估该酶的用途，该方法包括给禁食至少8小时的个体口服施用4-半乳糖基-木糖水溶液，然后评估血液中木糖的含量。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于摄入4-半乳糖基-木糖后，血液中木糖的含量可以在血浆或血清中评估。
6.根据权利要求4的用途，其特征在于血液中木糖的含量是根据如下测定值之间的差异计算出的，其中之一是摄入4-半乳糖基-木糖后从个体抽取到的血液样品流体部分的测定值，另一个是在个体摄入上述化合物前抽取到的基础血液的测定值。
7.根据权利要求4的用途，其特征在于所述个体是人。
8.根据权利要求1和4的用途，其特征在于上述用途在用于人个体时，能够将肠道乳糖酶缺乏症携带者与那些对牛奶中的某些成分过敏、而不是缺乏该酶的个体区分开来。
全文摘要
本发明涉及下述方法在人体中的用途，该方法中使用了4－半乳糖基－木糖，并且该方法涉及一种评估尿中木糖的替代技术。该方法包括在对患者口服施用4－半乳糖基－木糖后，检测患者血液中木糖的浓度，该方法尤其适用于新生儿。该发明还涉及通过一种非侵入性试验，诊断所述酶是否缺乏的方法，来评估体内肠乳糖活性的技术，该技术包括直接评估个体中的酶的总活性，而不需要评估由酶的缺乏所造成的影响。本发明所述方法并不需要专门的设备，其并不会导致乳糖酶缺陷患者任何明显的不适并值得信赖，因此克服了现有诊断技术的不便利性。
文档编号G01N33/487GK1705752SQ200380101420
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月16日
发明者J·J·阿拉冈雷耶斯, A·发兰德兹马沃落拉斯阿法雷兹 申请人:康斯乔最高科学研究公司, 马德里奥托诺马大学