一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用，包括：(1)用一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇与乳糖酸反应，得到聚乙二醇化乳糖酸；(2)用（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷修饰在锂皂石使其表面带有一定数量的氨基；（3)用聚乙二醇化乳糖酸修饰纳米粘土锂皂石，得到乳糖酸修饰的功能化锂阜石纳米复合材料；该材料可用于制备具有乳糖酸靶向功能的纳米载药体系。本发明不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对去唾液酸糖蛋白受体高表达的肝癌细胞具有特异性的靶向作用，因此合成的纳米载药复合材料可应用于_巴向输送抗癌药物。本发明的制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
【专利说明】一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其 制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米载药材料及其制备和应用领域，特别涉及一种聚乙二醇-乳糖酸 修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] -直以来，肿瘤都是危害人类生命的头号杀手，肿瘤具有死亡率高、难治疗以及恶 化迅速等特点。据世界卫生组织报告，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占 总死亡人数的12%。肿瘤已经成为困扰人类健康的一大难题。随着社会生产力的发展与社 会的进步，人类对于治愈恶性肿瘤的要求更加迫切；虽然治疗肿瘤的药物很多，但是许多药 物都或多或少存在缺陷，最明显的是药物作用周期短和药物不能特异性地作用于肿瘤细胞 这两个问题。因此，寻找一种能够使药物缓慢释放并且靶向作用于肿瘤细胞的药物输送系 统显得尤为重要。
[0003] 理想的药物载体应具有很好的生物相容性、生物可降解性、理化及生物稳定性和 较高的药物负载能力。近年来随着药物载体研究的不断发展，具有良好吸附性能、无毒、生 物相容性好的无机材料已经成为药物载体的研究热点。天然粘土矿物锂阜石（laponite, 简称LAP)就是其中之一。锂皂石是属于蒙皂石族的一种矿物，分散在水中能形成扁平状晶 体。锂皂石具有特殊空间夹层结构并且表面带有大量的负电荷，可以有效地包载药物，在疏 水性药物依曲康唑、抗肿瘤药物阿霉素等的负载与输送中体现了优势。
[0004] 但是，寻找合适的载体还远远不够，许多抗癌药物不能穿过细胞膜，即使药物载体 将药物载至肿瘤细胞表面，仍缺乏有效的内化机制。随着对肿瘤细胞研究的深入，研究者发 现肿瘤细胞具有一系列过量表达的受体，可将与受体相关的配体或抗体连接在药物或药物 载体表面，通过受体介导的内吞作用将所载药物靶向转运到特定的组织和肿瘤细胞，这个 方法的特异性和对肿瘤细胞的亲和性都非常高，大大提高了药物的靶向性和转运效率。
[0005] 去唾液酸糖蛋白受体（Asialo-glycoprotein receptors，ASGPR)是一种药物投递 系统的靶点。ASGPR在人肝癌细胞表面大量存在，并能够特异性识别含有半乳糖基寡糖或半 乳糖化的载体，并与之稳定结合利于细胞内吞。乳糖酸（LA, Lactobionic acid)在化学结 构上具有半乳糖的结构，修饰到纳米载体表面后能够通过LA上半乳糖残基与肝癌细胞表 面的ASGPR受体的相互作用实现靶向性输送。聚乙二醇（PEG)是一种具有良好生物相容性 的链状聚合物，修饰到纳米材料表面能够显著提高材料在水中的稳定性与生物相容性。查 阅相关文献可以发现，如果将靶向分子LA链接到PEG末端得到PEG-LA，然后再修饰到合适 的纳米载体表面，不仅可以利用PEG分子链的修饰提高材料的稳定性，降低毒性，还能够通 过LA增强药物在肿瘤部位的富集，提高治疗效果。
[0006] 因此，利用LAP的自身结构特点负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素，再通过表面修饰 PEG-LA的方式赋予载体靶向性，将有望提高阿霉素的抗肿瘤效果、降低毒副作用，具有重要 的理论意义和实用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和 应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关领域发展的需要。
[0008] 本发明所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征 在于：所述的氨基化锂皂石纳米颗粒为（3_氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂 石；聚乙二醇-乳糖酸的质量分数在49. 17-51. 09%左右，聚乙二醇与乳糖酸的摩尔比为 1 : 0· 68-1 : 0· 76。
[0009] 本发明所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒用于抗肿瘤 药物的负载，聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素盐酸盐的质量比为 4 : 1-2 : 1，在此条件下药物的负载效率为91. 3%。
[0010] 一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括：
[0011] (1)用少量的溶剂溶解一定量的乳糖酸（LA)，加入一定量的活化剂活化羧基3h， 然后在搅拌的情况下逐滴加入一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反应72h后，将 反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72h，冷冻干燥得到聚乙 二醇化乳糖酸（LA-PEG-C00H);
[0012] (2)配置一定浓度的LAP分散液，取一定量的（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷逐 滴加入到LAP分散液中，然后50°C水浴中静置16h，将反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐 缓冲液和蒸馏水中分别透析共72h，制得氨基化的锂皂石溶液（LM-NH 2)。
[0013] (3)取（1)中所得的LA-PEG-C00H配成一定浓度溶液，经活化剂活化过3h后，边搅 拌边逐滴加入步骤（2)所得一定浓度的LM-NH 2溶液中，反应72h后，将反应产物转移到透 析袋中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72h，最后得到纯化的聚乙二醇-乳糖酸修 饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-LA ;
[0014] 步骤⑴中所述的溶解乳糖酸和⑶中聚乙二醇-乳糖酸的溶剂为pH = 6的磷 酸盐缓冲液。
[0015] 所述步骤⑴中乳糖酸溶液浓度为6-8mg/mL。
[0016] 所述步骤（1)中的聚乙二醇PEG为NH2-PEG-C00H，分子量大小为2000。
[0017] 所述步骤⑴中得到的PEG-LA中PEG和LA的摩尔比为1 : 0. 68-1 : 0. 76。
[0018] 所述步骤⑴和步骤（3)中活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺 (EDC)和N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，步骤（1)中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为1 : 1 : 1， 步骤（3)中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为5 : 5 : 1-10 : 10 : 1。
[0019] 所述步骤（2)中锂皂石纳米颗粒的水溶液浓度为8-10mg/mL。锂皂石和硅烷偶联 剂的质量比2 : 1-3 : 1。
[0020] 所述步骤⑶中氨基化锂皂石与聚乙二醇-乳糖酸的用量摩尔比为 1 : 1.25-1 : 1.5。
[0021] 所述步骤（3)中所得到的LM-PEG-LA中，PEG-LA的质量分数在49. 17-51. 09 %。
[0022] 所述步骤⑴和步骤⑶中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min。
[0023] 所述步骤⑴中所述的透析袋截留分子量为1000。步骤（2)和步骤（3)中所述的 透析袋截留分子量为8000-14000。
[0024] -种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于：将阿 霉素（D0X)水溶液逐滴加入聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液，搅拌 12_24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素的聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米 颗粒 LM-PEG-LA/D0X。
[0025] 所述抗肿瘤药物阿霉素的浓度为l_2mg/mL，聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂 石纳米颗粒和阿霉素的质量比为4 : 1-2 : 1。
[0026] 药物包裹所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为12_24h搅拌速度为100-150r/min ;离 心的速率为5000r/min，离心的时间为lOmin。
[0027] 所得到的LM-PEG-LA/DOX中，LM-PEG-LA纳米颗粒对D0X的负载效率为9L 3%。
[0028] 本发明采用硅烷偶联剂修饰LAP表面得到氨基化的纳米颗粒LM_NH2，再化学键合 PEG-LA得到了乳糖酸修饰的LM-PEG-LA。这一载体不仅可以通过乳糖酸的靶向作用被肿 瘤细胞主动摄取，同时引入的长链聚合物PEG可以延长载体在体内的循环时间，降低材料 毒性，提高材料稳定性，改善药物释放特性，并且可以有效减少乳糖酸与去唾液酸糖蛋白受 体结合时的空间位阻，提高LM-PEG-LA/DOX与去唾液酸糖蛋白受体表达的肿瘤细胞的亲和 力。本发明的LM-PEG-LA载体用于抗肿瘤药物负载，对去唾液酸糖蛋白受体高表达的肿瘤 细胞具有良好的靶向效果，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物、基因或诊断分子探针的 负载与祀向输送。
[0029] 本发明使用1Η核磁分析、红外分析等方法表征本发明制备的靶向修饰的锂皂石纳 米颗粒，紫外-可见光谱测试可以验证药物的成功负载。同时用ΜΤΤ细胞毒性法、流式细胞 术分析和激光共聚焦显微镜来检验本发明的LM-PEG-LA/DOX对表面去唾液酸糖蛋白受体 表达的人肝癌细胞（HepG2细胞）的毒性与靶向性。具体测试结果如下：
[0030] (1)核磁分析
[0031] 附图 1 中（a)，（b)和（c)分别为 PEG-LA、LM-mPEG 和 LM-PEG-LA 的1Η 核磁图谱。 图（a)中可以看出，在3. 5ppm处有较强的吸收峰为PEG中亚甲基的特征峰，在3.6-4. 3ppm 处的一系列弱峰为LA的特征峰，证明LA已经成功连接到PEG分子链上。通过积分可以算 出，连接上的PEG与LA的比值为1 : 0.72。在图（b)与（c)中出现了在3. 5ppm处的吸收 峰，说明PEG已经连接到LAP表面。与图（b)相比，图（c)在3. 8ppm处的峰为LA的特征峰， 证明PEG-LA已经成功修饰到了 LM-NH2表面。
[0032] (2)红外分析
[0033] 在附图2所示的红外测试结果中，1260CHT1处为Si-Ο键的伸缩振动，证明硅烷偶联 剂已成功修饰到LAP表面，制备得到了 LM-NH2。在PEG-LA的红外光谱中，2884,1466,1341， 1282和1242CHT 1分别为PEG中CH2拉伸振动和亚甲基醚键的弯曲振动，在1148和1105CHT1 有一个强的振动峰，为C-0-C的特征振动峰。在LM-PEG-LA中，在2880,1460和1097CHT1处 出现新的振动峰，为PEG分子链中-CH 2和C-0-C键的峰，证明PEG-LA已经接在了 LM-NH2上。
[0034] (3)紫外-可见光谱测试
[0035] 在附图3所示的紫外-可见光谱测试结果中，载药前LM-PEG-LA在200到800nm 波长范围内均没有明显的吸收峰。在负载D0X之后，LM-PEG-LA/DOX材料在480nm附近显 示出一个明显的吸收峰。根据文献报道，这个吸收峰为D0X的紫外特征吸收峰。因此，表 面修饰的锂皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿瘤药物D0X。通过紫外定量分析，在投料比为 LM-PEG-LA : DOX = 3 : 1 的条件下，LM-PEG-LA 的载药效率为 91. 3%。
[0036] (4)体外释放试验
[0037] 附图4为LM-PEG-LA/D0X的体外累积释放曲线。在100小时中，D0X在pH = 5. 4 的弱酸性环境中从LM-PEG-LA/D0X中累计释放比在pH = 7. 4的中性环境中累计释放量高。 这说明基于锂皂石的载药体系均具有pH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的 释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低，说明 这一体系可以有效减少D0X在体内循环过程中在正常组织处的释放，将药物集中在肿瘤组 织部位释放，减少了 D0X对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
[0038] (5) MTT细胞毒性试验
[0039] 为评价载体的生物相容性，选择人肝癌细胞Η印G2细胞作为模型，通过MTT比色法 测定Η印G2细胞与不同浓度的LM-PEG-LA和LM-mPEG纳米颗粒共培养后的细胞活力，如图 5 (a)。与PBS对照组相比，LM-PEG-LA和LM-mPEG在实验浓度0. 5到64 μ g/mL范围内对细 胞的存活率没有显著性差异（细胞存活率均在88%以上），表明材料具有良好的生物相容 性。为了验证载药纳米颗粒的抗肿瘤效果，通过MTT比色法测定了与不同浓度的单纯D0X， LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX共培养24h的Η印G2细胞的活力，如图5 (b)。在相同的药物 浓度条件下，经LM-PEG-LA/D0X处理的Η印G2的细胞活性明显低于经纯药D0X和LM-mPEG/ D0X处理的细胞活性。这一结果表明本发明所述的靶向材料LM-PEG-LA/D0X具有良好的生 物相容性，并且表现出优于非靶向材料和裸药的抗肿瘤效果。
[0040] (6)细胞吞噬实验
[0041] !fepG2细胞经PBS、LM-PEG-LA/DOX和LM-mPEG/DOX处理后的共聚焦显微镜观察，如 图6。其中细胞核经染色显示蓝色荧光，D0X具有红色荧光。对比LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/ D0X处理的Η印G2细胞发现，乳糖酸修饰的材料具有更强的红色荧光，表明LM-PEG-LA/D0X 更容易被ASGPR高表达的HepG2细胞摄取。！fepG2细胞经PBS、LM-PEG-LA/DOX和LM-mPEG/ D0X处理后的流式细胞仪检测结果如图7所示。！fepG2细胞分别经LM-PEG-LA/D0X和 LM-mPEG/DOX处理后，乳糖酸修饰的材料更容易被ASGPR高表达的Η印G2细胞摄取，其荧光 强度值明显高于LM-mPEG/DOX处理后的Η印G2细胞。共聚焦显微镜观察图片和流式细胞仪 数据充分说明乳糖酸修饰的载体材料显著提高药物输送体系的特异性结合能力，促进癌细 胞对载药复合物的摄取，赋予了载药体系主动靶向肿瘤的特性。
[0042] 综上所述，本发明所述的LM-PEG-LA/D0X可以明显提高肿瘤细胞对D0X的摄取，改 善了 D0X的抗癌效果，具有良好的应用前景。
[0043] 有益效果
[0044] (1)本发明的LM-PEG-FA/D0X载药纳米颗粒具有良好的药物缓释效果与pH响应性 释放特性，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的 靶向治疗；
[0045] (2)本发明制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0046] 图 1 为（a) PEG-LA，（b) LM-mPEG 和（c) LM-PEG-LA 的1Η 核磁共振谱图；
[0047] 图 2 为 LM-NH2, LM-PEG-LA 和 PEG-LA 的红外光谱图；
[0048] 图 3 为 LM-PEG-LA，D0X 和 LM-PEG-LA/D0X 的紫外吸收光谱图；
[0049] 图4为在不同pH条件下D0X从LM-PEG-LA/DOX中释放的累积释放曲线；
[0050] 图5为MTT法测定的Η印G2细胞经不同浓度的LM-mPEG和LM-PEG-LA (a)，纯D0X， LM-mPEG/DOX 和 LM-PEG-LA/DOX (b)处理 24h 后的细胞活力（*p <0· 05, #p <0· 005, ***p < 0. 001)；
[0051] 图6为Η印G2细胞经PBS、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-LA/DOX处理4h后的细胞内荧 光分布，其中材料中D0X浓度2 μ g/mL，细胞核用Hoechst 33342染成蓝色；
[0052] 图7为流式细胞术测定的经PBS、LM_mPEG/D0X和LM-PEG-LA/DOX处理4h后，！fepG2 细胞对D0X的吞噬情况（纵坐标为细胞内吞D0X后的平均荧光强度，与吞噬量成正比，*p < 0· 05, **p < 0· 005, ***p < 0· 001)。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0054] 实施例1
[0055] (1)用20mL的pH = 6的缓冲溶液溶解32mg的乳糖酸（LA)(购于国药集团化学试 剂有限公司），加入lmL浓度为16. 9mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺 (EDC)搅拌0· 5h，然后加入lmL浓度为10. lmg/mL N-羟基丁二酰亚胺（NHS)活化3h，缓慢 加入含有2mL浓度为44. 20mg/mL的NH2-PEG-C00H(MW = 2000)溶液，反应72h后，将反应 产物用1000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析24h，然后再用蒸馏水透析48h，最后将纯化的 产物冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇固体产物（LA-PEG-C00H);
[0056] (2)取一定质量的LAP粉末分散于一定体积的超纯水中，制得浓度为10mg/mL的分 散液，取40 μ L (3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷边振荡边滴加入10mL LAP分散液中，然后 置于50°C水浴中16h，将反应产物用8000-14000透析袋在磷酸盐缓冲液中透析24h，然后再 用蒸馏水透析48h，制得氨基化的锂皂石（LM)溶液。
[0057] (3)称取2mg的PEG-LA粉末溶于lmL的pH = 6缓冲溶液中，向其中加入lmL浓度 为2. 2mg/mL的EDC，搅拌均勻，然后加入lmL浓度为L 32mg/mL的NHS溶液，磁力搅拌3小 时。将活化后的PEG-LA溶液缓慢加入lmL浓度为4mg/mL的氨基化锂皂石LM-NH 2水溶液 中，磁力搅拌反应3天。反应结束后，将反应液全部转移到截留分子量大小为8000-14000 的透析袋中，在磷酸盐缓冲液中透析24h，然后再用蒸馏水透析48h。透析结束后，将透析袋 内产品转移到15mL离心管，4°C保存。
[0058] 实施例2
[0059] 配置浓度为lmg/mL的D0X水溶液，取2mL D0X水溶液加入到取2mL浓度为3mg/ mL的LM-PEG-LA水溶液中，在避光的条件下磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将溶液转 移到15mL离心管中，在转速为5000rpm条件下离心（10min)，得到的沉淀用去离子水洗漆3 次，即可得到载药纳米颗粒LM-PEG-LA/DOX。
[0060] 实施例3
[0061] 将LM-PEG-LA/D0X分别用pH = 7· 4和pH = 5· 4的缓冲液配置成D0X浓度为lmg/ mL的溶液，取lmL上述溶液放入透析袋中，置于含有9mL的相同pH缓冲液中，放在37°C摇 床中振荡。开始的12h内每隔2h取一次样，以后每隔24h取一次样。每次取透析袋外液体 lmL,再向透析袋外加入对应的缓冲溶液lmL。测量取出的透析液在480nm处的吸光度值，计 算得到体外不同pH条件下D0X从LM-PEG-LA/D0X中释放的释放曲线。（图4)
[0062] 实施例4
[0063] 收集对数生长期Η印G2细胞，具体条件是：HepG2细胞采用DMEM培养基，培养基均 含10%胎牛血清，1%双抗。培养箱温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。取配制一定浓度的 PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用新鲜培养基配制浓度分别为0. 5、 1、2、4、8、16、32和64 μ g/mL的LM-PEG-LA和LM-mPEG纳米颗粒悬浮液。！fepG2细胞种植于 96孔板后分别与含有LM-PEG-LA和LM-mPEG纳米颗粒的新鲜培养基（浓度为0. 5、1、2、4、8、 16、32和64μ g/mL)在37°C下共培养24h。然后，向培养板孔中加入20μ L MTT(5mg/mL)，继 续在37°C下培养4h后，弃去培养液，并加入200 μ L DMS0,振荡15分钟使结晶体完全溶解 后，使用酶联免疫检测仪在570nm处测量各孔溶液的吸光值，并根据此值计算细胞的活力。 不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照组进行比较。（图5a)
[0064] 为了证明所合成的LM-PEG-LA/D0X复合物的抗肿瘤药效仅和其所负载的抗肿瘤 药物D0X相关，且具有靶向杀死细胞的能力。配制含不同的D0X浓度（0. 1，0.2,0.4,0.8， 1. 2,1. 6 和 2. 0 μ g/mL) LM-PEG-LA/D0X 和 LM-mPEG/DOX 的材料。！fepG2 细胞种植于 96 孔板 后分别与含有LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX纳米颗粒的新鲜培养基（含D0X浓度分别为 0. 1，0. 2,0. 4,0. 8,1. 2,1. 6和2. 0μ g/mL.)在37°C下共培养24h。然后，向培养板孔中加 入20yL MTT(5mg/mL)，继续在37°C下培养4h后，弃去培养液，并加入200yL DMS0,振荡 15分钟使结晶体完全溶解后，使用酶联免疫检测仪在570nm处测量各孔溶液的吸光值，并 根据此值计算细胞的活力。以缓冲液PBS为对照组进行比较不同浓度的材料对细胞增殖的 影响。（图5b)
[0065] 实施例5
[0066] 收集对数生长期Η印G2细胞，将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用新鲜DMEM 培养基浸泡12h，然后弃去培养基后每孔补充1. OmL新鲜培养基并接种5 X 104个Η印G2细 胞，过夜培养细胞，贴壁后弃去培养基，细胞再分别与含有PBS、材料LM-PEG-LA/D0X和对照 材料LM-mPEG/DOX (D0X浓度为2 μ g/mL)纳米颗粒的培养基在37°C下共培养4h，接着用PBS 清洗三次，然后依次用2.5%戊二醛（0.511^)固定15分钟、11〇吐68丨33343(0.81^)染色30 分钟，最后将盖玻片放置于载玻片上，通过油镜（63 X)观察细胞的形貌。（图6)
[0067] 用新鲜细胞培养液分别将LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX配制成D0X浓度为1和 2 μ g/mL的两种纳米颗粒溶液。HepG2细胞先以2X 105/孔的密度种植于12孔板，过夜培养 细胞贴壁后，先弃掉培养液，然后细胞再分别与LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX纳米颗粒的 培养基溶液在37°C下共培养4h，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS 清洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于lmL PBS中。通过流式细胞仪检 测细胞吞噬纳米颗粒后的平均荧光强度。（图7)
【权利要求】
1. 一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征在于：所述的 氨基化锂皂石纳米颗粒为（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石，纳米颗 粒中聚乙二醇-乳糖酸的质量分数在49. 17-51. 09%，聚乙二醇与乳糖酸的摩尔比为 1 : 0· 68-1 : 0· 76。
2. -种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括： (1) 用溶剂溶解乳糖酸LA，加入活化剂活化羧基2-4h，然后在搅拌的情况下逐滴加入 一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反应70-74h后，透析，冷冻干燥得到聚乙二醇 化乳糖酸LA-PEG-COOH ; (2) 配置LAP分散液，取（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷逐滴加入到LAP分散液中， 然后50°C水浴中静置14-18h，透析，制得氨基化的锂皂石溶液LM-NH 2 ; (3) 取（1)中所得的LA-PEG-COOH配成溶液，经活化剂活化过3h后，边搅拌边逐滴加入 步骤（2)所得LM-NH2溶液中，反应70-74h后，透析，最后得到纯化的聚乙二醇-乳糖酸修 饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-LA。
3. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)中所述的溶解乳糖酸和（3)中聚乙二醇-乳糖酸的溶剂为pH =6的磷酸盐缓冲液。
4. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)中乳糖酸溶液浓度为6-8mg/mL。
5. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制 备方法，其特征在于：步骤（1)和步骤（3)中活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳 酰二亚胺（EDC)和N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，步骤（1)中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为 1 : 1 : 1，步骤（3)中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比5 : 5 : 1-10 : 10 : 1。
6. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（2)中锂皂石纳米颗粒的水溶液浓度为8-10mg/mL，锂皂石和硅烷 偶联剂的质量比2 : 1-3 : 1。
7. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒 的制备方法，其特征在于：步骤（3)中氨基化锂皂石与聚乙二醇-乳糖酸的摩尔比为 1 : 1.25-1 : 1.5。
8. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)和步骤（3)中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-1501·/ min〇
9. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)中透析工艺为将反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐缓冲液和 蒸馏水中分别透析共72h ;所述的透析袋截留分子量为1000,步骤（2)和步骤（3)中所述的 透析袋截留分子量为8000-14000。
10. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应 用，其特征在于：将阿霉素水（D0X)溶液逐滴加入聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳 米颗粒水溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素的聚乙二醇-乳糖酸修饰 的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-LA/DOX。
11. 根据权利要求10所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应 用，其特征在于：所述阿霉素的浓度为l-2mg/mL，聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳 米颗粒和阿霉素的质量比为4 : 1-2 : 1。
12. 根据权利要求10所述的一种聚乙二醇-乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应 用，其特征在于：所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为12_24h，搅拌速度为100-150r/min ;离 心的速率为5000r/min，离心的时间为lOmin。
【文档编号】A61K47/04GK104208703SQ201410437407
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】史向阳, 郭睿, 陈光祥 申请人:东华大学