专利名称：用于聚(乙二醇)修饰的肽的间隔臂部分的制作方法
相关申请的交叉参考本申请根据35U.S.C§119(e)要求2003年5月12日提交的共同待决的美国临时专利申请序号60/469,996的优先权。将该优先权申请的内容完整并入本公开作为参考。
1.发明领域本发明涉及将水溶性聚合物，例如，聚(乙二醇)(PEG)共价连接到肽的新方法和基于肽的化合物。此外，本发明涉及包含此类化合物的新的治疗组合物。
2.发明背景近年来，随着蛋白质研究的发展，已经发现了具有多种作用的许多肽。随着基因重组技术和肽的有机合成方法的发展，已经可能大量得到这些生理学活性肽和它们的结构上类似的化合物。许多具有特定活性的这些肽非常适宜用作药物。
这些肽的实例包括结合红细胞生成素(EPO)受体(EPO-R)的肽。EPO是具有165个氨基酸的糖蛋白激素，具有24、38、83和126位氨基酸上的四个糖基化位点，其分子量为约34,000。EPO刺激有丝分裂和红细胞前体细胞的分化，从而确保产生红细胞。EPO在血红细胞形成过程中是必需的，该激素潜在可用于诊断和治疗特征是低或者缺陷血红细胞产生的血液疾病。已经发现了与EPO-R相互作用的许多肽(见，例如，Wrighton等人的美国专利号5,773,569；和Wrighton等人的美国专利号5,830,851；Smith-Swintosky等人的WO01/91780)。
然而，肽的清除通常非常快，当施用于循环系统时尤其如此。因此，希望提高这些肽的耐久性。此外，当肽从不同物种的动物得到，通过肽蛋白质工程化设计，和/或具有与受试者的肽不同的结构时，由于抗体的产生，存在导致严重症状的危险。因此，希望还提高此类肽的抗原性。为了使用这些肽作为药物，必须提高抗原性和耐久性。
用诸如聚(乙二醇)的大分子化合物对肽化学修饰已经表明可有效提高多种肽的抗原性和耐久性。从而，聚(乙二醇)和聚(乙二醇)衍生物已经广泛用作肽修饰的大分子试剂。
聚(乙二醇)的最常见的形式具有下面的结构HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH上面的聚合物α-、ω-二羟基聚(乙二醇)可以以简单形式表示为HO-PEG-OH，其中可以理解-PEG-符号代表下面的结构单位-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-不被任何具体理论或者作用机理所限制，认为长的链样PEG分子或者部分当在水性介质中时被高度水合并且处于快速运动中。认为该快速运动导致PEG占据(sweep out)大体积并且防止其他分子的接近和干扰。结果，当连接到另一化学实体(如肽)时，PEG聚合物链可以保护此类化学实体免于免疫应答和其他清除机制。结果，PEG化通过优化药物动力学、增加生物利用率，和减小免疫原性和给药频率提高了药物功效和安全性。
例如，PEG的一些活性衍生物已经连接到肽、蛋白质和酶，得到了有益结果。PEG在有机溶剂中是可溶的。连接到酶的PEG可以导致PEG-酶缀合物，其在有机溶剂中是可溶和有活性的。PEG连接到蛋白质与未经修饰的蛋白质相比可以减小PEG-蛋白质缀合物的免疫原性和肾脏清除速率，这导致缀合物的血液循环寿命显著增加。
例如，已经报导PEG共价连接到治疗性蛋白质延长了它们的体内半寿期，和/或减小了它们的免疫原性和抗原性，所述治疗性蛋白质为例如白介素(Knauf，M.J.等人，J.Biol.Chem.1988，263，15，064；Tsutsumi，Y.等人，J.Controlled Release 1995，33，447)、干扰素(Kita，Y.等人，Drug Des.Delivery1990，6，157)、过氧化氢酶(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.1977，252，3，582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp，C.O.等人，Anal.Biochem.1983，131，25)，和腺苷脱氨酶(Chen，R.等人，Biochim.Biophy.Acta1981，660，293)。
此外，连接到表面的PEG可以减小蛋白质和细胞对表面的吸附并改变表面的电性质。类似地，连接到脂质体的PEG可以导致这些颗粒的血液循环寿命的极大增加，从而可能增加它们用于药物递送的实用性(J.M.Harris，编者，″Biomedical and Biotechnical Applications of PolyethyleneGlycol Chemistry，″Plenum，New York，1992)。
PEG和连接的大分子之间氨基酸或肽臂的存在已经表现出一些优点，这是由于使用适宜的氨基酸或肽可能导入的性质的变化性。在这些氨基酸或肽臂中，正亮氨酸(Nle)用于分析目的；14C或者氚标记的Gly用于药物动力学研究；Lys用于分枝；Met-Nle或者Met-βAla用于通过BrCN处理除去PEG(Veronese，F.M.Biomaterials，2001，22，405)。
在PEG和连接的大分子之间具有氨基酸臂的另一种已知类型的PEG衍生物的特征是通过三功能间隔臂的两种功能连接在一起的两个线性PEG链，而第三种功能用于结合蛋白质。赖氨酸是三功能氨基酸间隔臂，两条PEG链连接到其α和ε氨基，而羧基被活化为羟基琥珀酰亚胺基酯用于蛋白质结合。在抗体和减小免疫原性方法中，该PEG衍生物具有在缀合期间降低酶的失活的优点并且其“伞状”结构可有效保护蛋白质防止蛋白质水解(Veronese，F.M.Biomaterials，2001，22，405)。
当部分活化基团掺入最终PEG肽或者PEG脂质体加合物时，PEG-连接体-肽或者PEG-连接体-脂质体有时形成不希望的副产物。Frances等人(Int.J.Hematol.1998，68，1)公开此类连接体具有几种类型的不利作用(1)这些连接体不一定是免疫学惰性的并且有实验证据表明这些基团造成PEG蛋白质的免疫原性/抗原性；(2)一些连接体部分含有可被酶促或化学切割的不稳定键；(3)通常从相对毒性活化的PEG衍生的连接体部分可以导致调节问题；(4)某些连接基团如三嗪环可以导致交联。
尽管在PEG修饰的基于肽的化合物领域中取得了进步，但是仍然需要具有提高的抗原性和耐久性的新的PEG修饰的化合物。
本章节和整个说明书中的引用和/或对参考文献的讨论不应该被认为是承认这些参考文献是本发明的现有技术。
发明概述本发明涉及基于肽的化合物，其包含肽部分、间隔臂部分，和水溶性聚合物部分，如聚(乙二醇)。间隔臂部分在肽和水溶性聚合物部分之间。
本发明还涉及基于肽的化合物，其还包含连接体部分。间隔臂部分在连接体部分和水溶性聚合物部分之间，连接体部分在间隔臂部分和肽之间。备选地，连接体部分可以包含间隔臂部分。
在本发明的一个实施方案中，间隔臂部分具有下面的结构-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每个都是整数，它们的值独立地选择。
在优选实施方案中，α为整数，1≤α≤6；β为整数，1≤β≤6；ε为整数，1≤ε≤6；δ为0或1；γ为整数，0≤γ≤10；Y为NH或CO。
在某些优选实施方案中，当γ＞1时β＝2。
在一个尤其优选的实施方案中，α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y为NH。
在其他实施方案中，γ＝δ＝0；
2≤α+ε≤5；Y为CO。
在某些其他实施方案中，γ＝δ＝0；α+ε＝5；Y为CO。
在其他实施方案中，α＝2；γ＝δ＝β＝ε＝0；Y为CO。
在本发明的一个实施方案中，连接体部分具有下面的结构-CO-(CH2)η-N-(CH2)ψ-CO-其中η和ψ每个都为整数，它们的值独立地选择并且N可以共价结合间隔臂部分的Y。
在优选实施方案中，η为整数，1≤η≤6；ψ为整数，1≤ψ≤6；在一个尤其优选的实施方案中，η＝ψ＝1。
在另一实施方案中，连接体部分为赖氨酸残基或者赖氨酸酰胺(赖氨酸残基，其中羧基已经被转化成酰胺部分-CONH2)。
优选地，水溶性聚合物部分是聚(乙二醇)部分。更优选地，聚(乙二醇)部分是线性的并且具有10K道尔顿以上的分子量。甚至更优选地，聚(乙二醇)部分具有约20到60K道尔顿的分子量。最优选地，聚(乙二醇)部分具有20K道尔顿的分子量。优选地，聚(乙二醇)部分具有小于1.20，更优选小于1.1，最优选小于1.05的多分散值(Mw/Mn)。水溶性聚合物部分可以是二聚体的并且包含通过连接体或者间隔臂部分连接的两个单体水溶性聚合物。
在本发明的一个实施方案中，肽部分是二聚体的并且包含通过连接体部分连接的两个单体肽。
在一个实施方案中，肽部分选自结合红细胞生成素-受体的肽。此类EPO-R结合肽的非限制性实例包括在公开的国际申请PCT/US00/32224(公开号WO01/38342A2，美国指定的)、PCT/US96/09810(公开号WO96/40749，美国指定的)和PCT/US01/16654(公开号WO01/91780A1)；和美国专利5,767,078、5,773,569、5,830,851、5,986,047和6,221,608中的那些。此类EPO-R结合肽的额外的非限制性实例公开在美国临时申请序号60/470,245、60/469,993和60/470,244中，它们都在2004年5月12日提交。
在另一实施方案中，肽部分选自结合血小板生成素受体(“TPO-R”)的肽。此类TPO-R结合肽的非限制性实例包括公开于美国专利6,552,008、6,506,362、6,498,155、6,465,430、6,333,031、6,251,864、6,121,238、6,083,913、5,932,546、5,869,451、5,683,983、5,677,280、5,668,110和5,654,276；和公开的美国专利申请2003/0083361、2003/0009018、2002/0177166和2002/0160013中公开的那些。
本发明还涉及包含上述化合物的药物组合物。
发明详述定义肽中氨基酸残基如下简写苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；甘氨酸为Gly或G。肽中非常规氨基酸缩写如下1-萘基丙氨酸为1-nal或者Np；2-萘基丙氨酸为2-nal；N-甲基甘氨酸(也称作肌氨酸)为MeG或Sc；乙酰化甘氨酸(N-乙酰基甘氨酸)为AcG。
“肽”或者“多肽”指通过酰胺键连接在一起的α氨基酸的单体的聚合物。肽长为两个或通常更多个氨基酸单体。优选地，本发明的肽含有长度小于约50个氨基酸单体。
如文中所用的短语“药学上可接受的”指“通常认为安全”，即当施用于人时为生理上可耐受的并且通常不产生过敏或者类似的不良反应，如胃不适、眩晕等等的分子实体和组合物。优选地，如本文所用的术语“药学上可接受的”指得到联邦或者州政府管理机构的批准或者美国药典或者其他公知的药典中所列用于动物，更尤其用于人。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或者水性溶液盐溶液和水性右旋糖和甘油溶液优选用作载体，尤其用于可注射溶液。适宜的药物载体在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
如本文所用的术语“激动剂”指生物活性配体，其结合其互补生物活性受体并活化该受体而导致该受体中生物应答或者增强所述受体的现有生物活性。
间隔臂部分在本发明中，肽部分通过间隔臂部分连接到PEG部分，所述间隔臂部分具有下面的结构在本发明的一个实施方案中，间隔臂具有下面的结构-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每个都是整数，它们的值独立地选择。
在优选实施方案中，α为整数，1≤α≤6；β为整数，1≤β≤6；ε为整数，1≤ε≤6；δ为0或1；
γ为整数，0≤γ≤10；Y为NH或CO。
在某些优选实施方案中，当γ＞1时β＝2。
在一个尤其优选的实施方案中，α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y为NH。
在其他实施方案中，γ＝δ＝0；2≤α+ε≤5；Y为CO。
在某些其他实施方案中，γ＝δ＝0；α+ε＝5；Y为CO。
在其他实施方案中，α＝2；γ＝δ＝β＝ε＝0；Y为CO。
根据本发明，水溶性聚合物部分(优选PEG)连接到间隔臂的NH末端。水溶性部分可以直接连接到间隔臂或者其可以例如，使用酰胺键或者氨基甲酸酯键间接连接。在此类实施方案中，PEG部分包含至少一个单体PEG链。
在某些实施方案中，PEG部分包含两条单体PEG链。优选地，两条单体PEG链通过赖氨酸残基或者赖氨酸酰胺(赖氨酸残基，其中羧基已经被转化成酰胺部分-CONH2)连接在一起。更优选地，两条PEG链连接到赖氨酸的α和ε氨基，而羧基活化为羟基琥珀酰亚胺基酯用于结合间隔臂部分。例如，当赖氨酸酰胺连接两条单体PEG链时，二聚体可以在结构上如式I阐明，并且如式II所概述式I式II 在式I中，N2代表赖氨酸的ε氨基的氮原子，N1代表赖氨酸的α氨基的氮原子。在优选实施方案中，两个肽单体的C-末端赖氨酸为L-赖氨酸。在备选实施方案中，一个或多个赖氨酸残基可以是D-赖氨酸。
根据本发明，肽部分连接到间隔臂的Y末端。间隔臂可以连接到肽的C-末端或者N-末端。所以，在其中间隔臂连接到肽的C-末端的实施方案中，Y为NH。在其中间隔臂连接到肽的N-末端的实施方案中，Y为CO。在备选的优选实施方案中，其中Y为NH的本发明的间隔臂通过酰胺键与肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε氨基连接。
连接体部分在另一优选实施方案中，本发明的间隔臂连接到肽作为三功能连接体(下述)的部分。在该实施方案中，间隔臂部分的Y是CO，并且间隔臂部分的Y与三功能连接体的N原子形成酰胺键。
在一个尤其优选的实施方案中，连接体部分是具有下面结构的三功能连接体-CO-(CH2)η-N-(CH2)ψ-CO-其中η和ψ每个都为整数，它们的值独立地选择，N可以共价结合间隔臂部分，并且间隔臂部分的Y是CO。
在优选实施方案中，η为整数，1≤η≤6；ψ为整数，1≤ψ≤6；在一个尤其优选的实施方案中，η＝ψ＝1。
肽合成期间间隔臂部分可以掺入到肽中。例如，当间隔臂含有游离氨基和使得能够结合另一分子部分的第二个官能团(例如，羧基或者氨基)时，间隔臂可以缀合到固相支持体。之后，可以通过标准固相技术将肽直接合成到间隔臂的游离氨基。
在优选实施方案中，含有两个官能团的间隔臂首先通过第一个官能团偶联到固相支持体。当将合成二聚肽时，任选地连接体LK部分通过间隔臂的第二个官能团和连接体的第三个官能团缀合到间隔臂，所述连接体LK部分具有能够作为肽合成起始位点的两个或多个官能团和使得能够结合另一分子部分的额外的官能团(例如，羧基或氨基)。之后，可以以固相合成技术的变通方案将两个肽单体直接合成到连接体LK部分的两个活性氮基团。例如，固相支持体偶联的具有游离胺基的间隔臂可以通过连接体的游离羧基与赖氨酸连接体反应。
在另一实施方案中，间隔臂部分可以在肽合成后缀合到肽。此类缀合可以通过本领域公知的方法实现。在一个实施方案中，连接体含有适于连接合成肽的靶官能团的至少一个官能团。例如，具有游离胺基的间隔臂可以与肽的C末端羧基反应。
水溶性聚合物/PEG部分本发明的水溶性聚合物部分包括，但不限于，(a)聚亚烷基二醇和其衍生物，包括PEG、mPEG、PEG均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述均聚物和共聚物是未取代的或者在一个末端被烷基取代；(b)纤维素和纤维素衍生物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素；(c)淀粉和糊精，和它们的衍生物；(d)葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖、交联的糊精，和羧甲基糊精；(e)肝素和肝素片段；(f)聚乙烯醇和聚乙烯乙基醚；(g)聚乙烯吡咯烷酮；(h)a，b-聚[(2-羟基乙基)-DL-aspartamide；和(i)聚氧乙烯化多元醇。
这些聚合物可以是线性的、分枝的或者星形的，具有宽范围的分子量。
水溶性聚合物部分优选为PEG。用于本发明的优选PEG为分子量大于20K道尔顿的PEG。优选地，PEG具有约20K道尔顿到约60K道尔顿的分子量。更优选地，PEG具有约20K道尔顿到约40K道尔顿的分子量。最优选地，PEG具有约20K道尔顿的分子量。
水溶性聚合物部分共价连接到间隔臂或者连接体部分。在一个实施方案中，PEG部分连接到间隔臂的N-末端。
本发明的化合物可以包含多个水溶性聚合物部分(优选PEG部分)(例如，2、3、4或更多)，至少一个此类多个水溶性聚合物部分通过间隔臂部分连接。当化合物包含一个以上水溶性聚合物部分时，多个水溶性聚合物部分可以是相同或不同的化学部分(例如，不同分子量的PEG)。在本发明的一个实施方案中，水溶性聚合物部分是二聚体的并且包含通过间隔臂部分连接的两个单体PEG。在一些情况中，PEG化的程度(连接到肽的PEG部分数和/或PEG所连接的肽的总数)可以受到PEG化反应中PEG分子与肽分子的比例以及总浓度(如果PEG分子和肽分子都存在于反应混合物中)的影响。通常，最适PEG与肽比例(按照不提供过量的未反应的肽和/或PEG的反应效率)将由如下因素确定诸如希望的PEG化程度(例如，单、二-、三-，等等)、所选聚合物的分子量、聚合物是分枝的还是未分枝的，以及具体连接方法的反应条件。
本领域技术人员可以利用多种PEG连接方法[见，例如，Goodson，等人(1990)Bio/Technology 8343(PEGylation of interleukin-2 at itsglycosylation site after site-directed mutagenesis)；EP 0 401 384(couplingPEG to G-CSF)；Malik，等人，1992)Exp.Hematol.201028-1035(PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride)；PCT公开号WO90/12874(PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introducedcysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative)；美国专利号5,757,078(PEGylation of EPO peptides)；美国专利号5,672,662(Poly(ethylene glycol)and related polymers monosubstituted with propionic orbutanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnicalapplications)；美国专利号6,077,939(PEGylation of an N-terminalα-carbon of a peptide)；Veronese等人，1985)Appl.Biochem.Bioechnol 11141-142(PEGylation of an N-terminalα-carbon of a peptide withPEG-nitrophenylcarbonate(″PEG-NPC″)orEG-trichlorophenylcarbonate)；和Veronese(2001)Biomaterials 22405-417(关于肽和蛋白质PEG化的综述文章)]。
例如，PEG可以通过反应基共价结合氨基酸残基。反应基为活化的PEG分子可以结合的基团(例如，游离氨基或羧基)。例如，N-末端氨基酸残基和赖氨酸(K)残基具有游离氨基；C-末端氨基酸具有游离羧基。巯基(例如，半胱氨酸残基中存在的)也可以用作连接PEG的反应基。此外，已经描述了用于在多肽的C-末端特异引入活化基团(例如，酰肼、醛和芳香族氨基)的酶辅助方法[Schwarz，等人(1990)Methods Enzymol.184160；Rose，等人(1991)Bioconjugate Chem.2154；Gaertner，等人(1994)J.Biol.Chem.2697224]。
例如，使用具有不同反应部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)可以将PEG分子连接到氨基。此类反应部分的非限制性实例包括琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、mPEG-亚胺酯、对-硝基苯基碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和氰尿酰氯。此类mPEGs的非限制性实例包括mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG2-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG2-SS)、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG2-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG2-SC)、mPEG-亚胺酯、mPEG-对-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-亚胺酯、mPEG2-对-硝基苯基碳酸酯(mPEG2-NPC)、mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG2-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG2-SPA)、mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)、mPEG2-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)、mPEG-氰尿酰氯、mPEG2-氰尿酰氯、mPEG2-赖氨醇-NPC，和mPEG2-Lys-NHS。
当PEG的连接不是特异的并且希望包含特异PEG连接的肽时，可以从PEG化化合物的混合物纯化所希望的PEG化化合物。例如，如果希望N-末端PEG化的肽，那么可以从随机PEG化肽群体纯化N-末端PEG化形式(即，从其他单PEG化部分分离该部分)。
在一些实施方案中，PEG位点特异地连接到肽或间隔臂。通过固相合成已经进行了在生长激素释放因子的有效类似物的N-末端、侧链和C-末端的位点特异PEG化[Felix，等人(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46253]。另一种位点特异方法包括通过N-末端苏氨酸的高碘酸钠氧化产生的N-末端的反应性醛基以位点特异的方式将肽连接到脂质体表面嫁接的PEG链的末端[Zalipsky，等人(1995)Bioconj.Chem.6705]。然而，该方法局限于具有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的多肽。
在一个方法中，通过还原性烷基化可以实现选择性N-末端PEG化，还原性烷基化利用特定肽或者间隔臂部分中可用于衍生的伯氨基(赖氨酸对N-末端)的不同类型的差别反应性。在适宜的反应条件下，包含羰基的PEG选择性连接到肽或者间隔臂的N-末端。例如，通过在一定pH下进行反应可以选择性N-末端PEG化蛋白质，所述反应利用赖氨酸残基的ε-氨基和肽或者间隔臂的N-末端残基的α-氨基之间的pKa不同。通过这种选择性连接，主要在蛋白质的N-末端发生PEG化，而不明显修饰其他反应基(例如，赖氨酸侧链氨基)。使用还原性烷基化，PEG应该具有用于偶联蛋白质的一种反应性醛(例如，可以使用PEG丙醛)。
位点特异诱变是可以用于制备用于位点特异聚合物连接的肽的另一种方法。通过该方法，肽的氨基酸序列设计成在肽内的希望的位置上掺入适宜的反应基。例如，WO 90/12874描述了通过插入半胱氨酸残基或者用半胱氨酸残基替换其他残基修饰的蛋白质的位点定向PEG化。该公开还描述通过将半胱氨酸特异的mPEG衍生物与EPO上重组导入的半胱氨酸残基反应制备mPEG-红细胞生成素(“mPEG-EPO”)。
当PEG部分连接到间隔臂部分或者连接体部分时，可以使用类似的连接方法。在该情况中，间隔臂或者连接体含有反应基并且含有适宜的补充反应基的活化的PEG分子用于实现共价连接。在优选实施方案中，连接体或者间隔臂反应基是末端反应基(即，位于连接体或者间隔臂的末端)。
使用将水溶性聚合物连接到分子的受体结合部分(例如，肽+间隔臂)的多种化学方法的任意一种可以将本发明的肽、肽二聚体和其他基于肽的分子连接到水溶性聚合物(例如，PEG)。通常的实施方案利用一个连接接头将水溶性聚合物共价连接到受体结合部分，然而，在备选实施方案中，可以使用多个连接接头，包括其他变通方案，其中不同种类的水溶性聚合物连接到不同连接接头处的受体结合部分，所述接头可以包括间隔臂和/或一个或多个肽链的共价连接接头。在一些实施方案中，二聚体或者更高级多聚体将包含不同种类的肽链(即，异二聚体或者其他异多聚体)。作为实例并且不限制，二聚体可以包含具有PEG连接接头的第一条肽链和缺少PEG连接接头或者利用不同于第一条肽链的连接化学的第二条肽链，在一些变通方案中，间隔臂可以包含或者缺乏PEG连接接头和所述间隔臂，如果被PEG化，可以利用不同于第一和/或第二条肽链的连接化学。备选实施方案利用连接到受体结合部分的间隔臂部分的PEG和缀合到所述分子的肽部分的氨基酸之一的侧链的不同水溶性聚合物(例如，糖)。
多种聚乙二醇(PEG)种类可以用于PEG化受体结合部分(肽+间隔臂)。基本上可以使用任意适宜的反应性PEG试剂。在优选实施方案中，反应性PEG试剂将导致缀合到受体结合部分时形成氨基甲酸酯或者酰胺键。适宜的反应性PEG种类包括，但不限于，可以在NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3 Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo150-6019)的Drug Delivery Systems目录(2003)和Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目录(2003)中出售的那些种类。例如并且不限于下面的PEG试剂通常是多种实施方案中优选的mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、multi-Arm PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-Double Esters、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、杂官能PEGs(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEGs，包括本领域技术人员所选化学活化的基于甘油的PEGs的GL序列，任意一种SUNBRITE活化的PEGs(包括但不限于羧基-PEGs、p-NP-PEGs、Tresyl-PEGs、醛PEGs、缩醛-PEGs、氨基-PEGs、硫醇-PEGs、马来酰亚胺-PEGs、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羟基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂，和本领域技术人员选择用于他们的特定应用和习惯的其他类似和/或适宜的反应性PEGs。
肽部分来源于多种动物(包括人、微生物或植物)和通过遗传工程和合成产生的任意肽可用作肽部分。实例包括结合EPO-R的肽；结合TPO-R的肽、细胞因子，如多种干扰素(例如，α干扰素、β干扰素、γ干扰素)、白介素-2和白介素-3、激素，如胰岛素、生长激素释放因子(GRF)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、心房钠尿肽(ANP)、血管升压素、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、血管活性肠肽(VIP)、促胰液素、α-促黑素细胞激素(α-MSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、缩胆囊素(CCK)、胰高血糖素、甲状旁腺激素(PTH)、促生长素抑制素、内皮素、物质P、强啡肽、催产素和生长激素释放肽(GHRP，例如，Endocrinology，114，1537(1984)]、生长因子，如生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、β神经生长因子(β-NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)，酶，如组织纤溶酶原活化物(t-PA)、弹性蛋白酶、超氧化物歧化酶(SOD)、胆红素氧化酶、过氧化氢酶、尿酸氧化酶和天冬酰胺酶，其他蛋白质，如泛蛋白、胰岛活化蛋白(IAP)、血清胸腺因子(STF)、肽-T和胰蛋白酶抑制剂，和它们的衍生物。
优选地，肽部分包含一种或多种肽，每种肽的长度小于50个氨基酸，更优选约10到25个氨基酸，最优选约12-18个氨基酸。
在一个优选实施方案中，肽部分选自结合EPO-R的肽，如在Wrighton等人的美国专利号5,773,569；5,830,851；和5,986,047；Wrighton等人的PCT公开号WO96/40749；Johnson和Zivin的美国专利号5,767,078和PCT公开号96/40772；Balu的PCT公开号WO01/38342和Smith-Swintosky，等人的WO01/91780中公开的那些肽。可以用作本发明肽部分的其他代表性EPO-R结合肽在2003年5月12日提交的美国临时申请序号60/470,245中描述。可以用作本发明肽部分的另外的代表性EPO-R结合肽在2003年5月12日提交的美国临时申请序号60/469,993中描述。可以用作本发明肽部分的另外的代表性EPO-R结合肽在2003年5月12日提交的美国临时申请序号60/470,244中描述。
在另一优选实施方案中，肽部分选自结合血小板生成素-受体(“TPO-R”)的肽。此类TPO-R结合肽的非限制性实例包括在美国专利6,552,008、6,506,362、6,498,155、6,465,430、6,333,031、6,251,864、6,121,238、6,083,913、5,932,546、5,869,451、5,683,983、5,677,280、5,668,110和5,654,276和公开的美国专利申请2003/0083361、2003/0009018、2002/0177166和2002/0160013中公开的那些TPO-R结合肽。
在一个实施方案中，肽部分是长为10到40或更多氨基酸残基并且具有序列X3X4X5GPX6TWX7X8的单体肽，其中每个氨基酸由标准的单字母简写表示；X3为C；X4为R、H、L或W；X5为M、F或I；X6独立地选自20种遗传编码的L-氨基酸的任一种；X7为D、E、I、L或V；X8为C，所述肽结合并活化红细胞生成素受体(EPO-R)或者作为EPO激动剂。
在另一实施方案中，肽部分是长为17到约40个氨基酸的单体肽，其包含核心氨基酸序列LYACHMGPITX1VCQPLR，其中每个氨基酸由标准的单字母简写表示；X1为色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)或者2-萘基丙氨酸(2-nal)。
在再一个实施方案中，肽部分包含一个或多个TPO-R结合肽，其具有诸如Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Nal(1)-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar或Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar的序列。
在一个实施方案中，肽部分直接连接到间隔臂部分。
在另一实施方案中，肽部分通过连接体连接到间隔臂部分。
根据本发明的一些实施方案，独立地选自20种遗传编码的L-氨基酸或者立体异构的D-氨基酸的2个或多个，优选2到6个氨基酸残基将偶联到上述核心序列的一端或两端。例如，序列GG将通常连接到核心序列的一端或两端以便容易合成肽。本发明还提供了这些肽和所述肽的衍生物和肽模拟物的缀合物，它们保留了EPO-R结合性质。
20种常规氨基酸的异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，如a，a-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明化合物的适宜成分。非常规氨基酸的实例包括，但不限于β-丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、正亮氨酸、1-或2-萘基丙氨酸、肌氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸。
在优选实施方案中，本发明的肽部分在核心序列的两个半胱氨酸残基之间含有分子内二硫键。例如 或 二聚和寡聚肽在优选实施方案中，本发明的单体肽部分经二聚或者寡聚化以形成二聚体或者寡聚体。此外，此类二聚体和其他多体可以是异二聚体或异多聚体。
在一个实施方案中，使用生物素/链霉抗生物素蛋白系统可以寡聚化本发明的肽单体。通过标准技术可以合成肽单体的生物素化类似物。例如，肽单体可以C-末端生物素化。这些生物素化单体然后通过与链霉抗生物素蛋白孵育[例如，在室温下以4∶1摩尔比在磷酸缓冲盐水(PBS)或者HEPES缓冲的RPMI培养基(Invitrogen)中孵育1小时]寡聚化。在该实施方案的变通方案中，生物素化肽单体可以通过与多种通过商业途径可得到的抗-生物素抗体的任意一种[例如，山羊抗-生物素IgG，来自Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)]孵育而寡聚化。
连接体在优选实施方案中，通过共价连接到至少一种连接体部分二聚化本发明的肽单体。连接体(LK)部分优选为(尽管不是必须)基于氮的连接体。连接体部分最优选为任选以一个或两个-CO-键结束的三功能连接体。在本发明的优选实施方案中，连接体LK包含下面的结构-CO-(CH2)η-N-(CH2)-CO-其中，η和都是整数，它们的值独立地选择，N共价结合间隔臂部分的Y，间隔臂部分的Y是CO。最优选地，连接体通过相似地连接到每个单体的C-末端氨基酸桥接两个肽单体的C-末端。例如，当连接体LK与第一个和第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基可以形成酰胺键时，二聚体的结构可以如式III所示，并概述在式IV中式III式IV 在式IV中，N2代表赖氨酸的ε-氨基的氮原子，N1代表赖氨酸的ε-氨基的氮原子。该二聚结构可以写作[肽-Lys]2-LK以表示含有赖氨酸残基的肽，其中C-末端赖氨酸残基的ε-氨基结合连接体部分，写作[肽-Lys，二硫键]2-LK以表示含有赖氨酸残基的肽，其中C-末端赖氨酸残基的ε-氨基结合连接体部分，每个肽含有一个分子内二硫键环，写作[肽-Lys，二硫键]2-LK-间隔臂-PEG以表示含有赖氨酸残基的肽，其中C-末端赖氨酸残基的ε-氨基结合连接体部分，每个蛋白质含有一个分子内二硫键环并且间隔臂分子在赖氨酸的C-末端和PEG部分之间形成一个共价键，或者写作[肽-Lys，二硫键]2-LK-连接体PEG2以表示含有赖氨酸残基的肽，其中C-末端赖氨酸残基的ε-氨基结合连接体部分，每个蛋白质含有一个分子内二硫键环并且间隔臂分子在赖氨酸的C-末端和PEG部分之间形成两个共价键。
在另一优选实施方案中，连接体是赖氨酸残基或者赖氨酸酰胺(其中羧基已经被转化成酰胺部分-CONH2的赖氨酸残基)。更优选地，连接体通过同时连接到每个单体的C-末端氨基酸桥接两个肽单体的C-末端。例如，当C-末端连接体LK是赖氨酸酰胺时，该二聚体在式V中结构性阐明并且如图VI中概述式V式VI 在式V中，N2代表赖氨酸的ε-氨基的氮原子，N1代表赖氨酸的α-氨基的氮原子。该二聚结构可以写作[肽]2-LK以表示肽结合含有赖氨酸的连接体部分的α和ε氨基，或者写作[Ac-肽]2-LK以表示N-末端乙酰化肽结合到含有赖氨酸的连接体部分的α和ε氨基，或者写作[Ac-肽，二硫键]2-LK以表示N-末端乙酰化肽结合到含有赖氨酸的连接体部分的α和ε氨基，每个肽含有分子内二硫键环，或者写作[Ac-肽，二硫键]2-LK-间隔臂-PEG以表示N-末端乙酰化肽结合到含有赖氨酸的连接体部分的α和ε氨基，每个肽含有分子内二硫键环，并且间隔臂分子在连接体部分的C-末端和PEG部分之间形成共价键。
通常，尽管不是必须，通过不同于分子间二硫键形成的技术二聚化肽二聚体将还包含肽单体的半胱氨酸残基之间的一个或多个二硫键。例如，两个单体可以通过一个或多个分子间二硫键交联。优选地，两个单体含有至少一个分子内二硫键。最优选地，肽二聚体的两个单体含有分子内二硫键，从而每个单体含有环状基团。
肽修饰还可以修饰本发明肽化合物的氨基和/或羧基末端以产生本发明的其他化合物。氨基末端修饰包括甲基化(即，-NHCH3或者-N(CH3)2)、乙酰化(例如，用乙酸或者其卤化衍生物，如α-氯乙酸、α-溴乙酸、α-碘乙酸)、加入苄氧基羰基(Cbz)，或者用保护基团保护氨基末端，所述保护基团含有RCOO-定义的羧化物官能度或者R-SO2-定义的磺酰官能度，其中R选自烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基等等，和类似基团。还可以在N-末端掺入脱氨基酸(从而没有N-末端氨基)以减小对蛋白酶的敏感性或者限制肽化合物的构象。在优选实施方案中，N-末端被乙酰化。在最优选的实施方案中，乙酰化N-末端甘氨酸以产生N-乙酰甘氨酸(AcG)。
羧基末端修饰包括用氨甲酰基取代游离酸或者在羧基末端形成环状内酰胺以导入结构限制。还可以环化本发明的肽，或者在肽的末端掺入脱氨基或者脱羧基残基，从而没有末端氨基或者羧基，从而减小对蛋白酶的敏感性或者限制肽的构象。本发明化合物的C-末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基，和羧基，和它们的低级酯衍生物，和其药学上可接受的盐。
可以将20种遗传编码的氨基酸(或者立体异构的D型氨基酸)的天然发生的侧链用其他侧链取代，所述其他侧链为例如，烷基、低级烷基、4-、5-、6-到7-元环状烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基和它们的低级酯衍生物，和4-、5-、6-到7-元杂环。具体地，可以使用脯氨酸类似物，其中脯氨酸残基的环大小从5元改变到4、6或7元。环状基团可以是饱和的或不饱和的，如果饱和，可以是芳族或者非芳族的。杂环基团优选含有一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。此类基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)，和三唑基。这些杂环基团可以是取代或未取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧，或者取代或未取代的苯基。
可以通过磷酸化和其他方法(例如，如Hruby，等人(1990)BiochemJ.268249-262中描述]修饰肽部分。
本发明的肽部分还可以作为具有相似生物活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员认识到可以用多种技术构建具有与前导肽化合物相同或相似的所希望的生物活性的化合物，但是它们在溶解性、稳定性和对水解和蛋白水解方面比前导肽化合物具有更有利的活性[见，Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24243-252]。这些技术包括用由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸组成的主链替换肽主链。
药物组合物在本发明的另一方面，提供了基于上面的PEG修饰的肽的化合物的药物组合物。通过施用此类组合物减轻或者调节的疾病包括上文指出的那些疾病。此类药物组合物可以通过经口、肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或者皮下注射)、透皮(被动地或者使用离子电渗疗法或者电穿孔)、透粘膜(鼻、阴道、直肠或者舌下)施用途径或者使用生物可侵蚀的插入物施用，并且可以配制成适宜每种施用途径的剂型。通常，本发明包括包含有效量治疗肽(例如，结合EPO-R的肽)与药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。此类组合物包括多种缓冲成分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，如去污剂和增溶剂(例如，Tween 80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，Thimersol、苯甲醇)和膨胀性物质(例如，乳糖、甘露醇)；将所述物质掺入到聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等等的颗粒制剂，或者掺入到脂质体中。还可以使用透明质酸。此类组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率，和体内清除速率。见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712页，将其并入本文作为参考。可以以液体形式，或者可以以干燥粉剂(例如，冻干)形式制备组合物。
经口递送预计用于本文的是经口固体剂型，其在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA18042)第89章中一般性描述，将其并入本文作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、药片或者锭剂、扁囊剂、微型药片、粉剂或者粒剂。而且，脂质体或者类蛋白质胶囊化也可以用于配制本发明组合物(例如，在美国专利号4,925,673中报导的类蛋白质微球体)。可以使用脂质体胶囊化并且可以用多种聚合物衍生脂质体(例如，美国专利号5,013,556)。用于治疗剂的可能的固体剂型的描述由Marshall，K.在G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的ModernPharmaceutics(1979年)的第10章中给出，将其并入本文作为参考。通常，该制剂将包括EPO-R激动剂肽(或者其化学修饰的形式)和插入物成分，其允许保护免于胃环境的破坏，并在肠中释放生物活性物质。
还预计用于本文的是经口施用的液体剂型，包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，它们可以含有其他组分，包括惰性稀释剂；和佐剂，如湿润剂、乳化剂和混悬剂；和甜味剂、矫味剂和芳香剂。
肽可以经化学修饰从而衍生物的经口递送是有效的。通常，预计化学修饰将至少一个部分连接到组成分子自身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠吸收到血流中。还希望一种或几种组分的总体稳定性的增加和增加在体内的循环时间。如上文讨论，PEG化是药物使用的优选的化学修饰。可以使用的其他部分包括丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、脂肪酸(例如，豆蔻酸)、肽[见Dennis，M.S.等人J.Biol.Chem.2002，277，35035]、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane[见，例如，Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenberg和Roberts，编著(Wiley-InterscienceNew York，NY)367-383页；和Newmark，等人(1982)J.Appl.Biochem.4185-189]。
对于经口制剂，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)，或者大肠。本领域技术人员可以利用这样的制剂，其将不在胃中释放，而是将在十二指肠或者肠的别处释放。优选地，该释放将避免胃环境的有害影响，可以通过保护肽(或者衍生物)或者通过远离胃环境，如在肠中释放肽(或衍生物)避免胃环境的有害影响。
为了确保完全的胃抗性，对至少pH5.0不可渗透的包衣是必需的。用作肠包衣的更常见的惰性成分的实例是乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸树脂L30D、Aquateric、醋酞纤维素(CAP)、丙烯酸树脂L、丙烯酸树脂S和Shellac。这些包衣可以用作混合膜。
包衣或者包衣混合物也可以用在片剂上，这些包衣或者包衣混合物不意在保护免于胃的影响。所述包衣或者包衣混合物可以包括糖包衣，或者使得片剂更易吞咽的包衣。胶囊剂可以由用于递送干燥治疗剂(即，粉剂)的硬壳(如明胶)组成，对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是厚淀粉或者其他可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片或者片剂研制剂，可以使用湿法块化(moist massing)技术。
肽(或者衍生物)可以包括在制剂中作为颗粒大小为约1mm的粒剂或者微型药片形式的多微粒(multiparticulate)。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉剂、略微压制的块(plug)，或者甚至片剂。这些治疗剂可以通过压缩制备。
还可以包括着色剂和/或矫味剂。例如，可以(如通过脂质体或者微球体胶囊化)制备肽(或衍生物)，然后将其包含在可食用产品，如含有着色剂和矫味剂的冷藏饮料中。
可以用惰性物质稀释或者增加肽(或衍生物)的体积。这些稀释剂可以包括糖，尤其甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改良葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，它们包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些通过商业途径可获得的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
固体剂型的治疗剂制剂中可以包含崩解剂。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商用崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可以使用。崩解剂还可以是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶也可以用作崩解剂和粘合剂并且可以包括诸如琼脂、Karaya或黄蓍胶的粉状树胶。海藻酸和其钠盐也可以用作崩解剂。
粘合剂可以用于将肽(或衍生物)活性剂保持在一起以形成硬片剂并且包括来自天然产物的材料，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于醇溶液以粒化肽(或衍生物)。
肽(或衍生物)的制剂中可以包括抗摩擦剂以防止配制过程期间粘着。润滑剂可以用作肽(或衍生物)和模壁中间层，这些润滑剂包括但不限于硬脂酸，包括其镁和钙盐；聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、碳蜡4000和6000。
可以加入助流剂，其改善配制期间药物的流动性质并且帮助压制期间的重排。助流剂可以包括淀粉、滑石粉、致热性硅石和水合硅铝酸盐。
为了帮助肽(或衍生物)溶于水性环境，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可以使用阳离子去污剂并且其可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以包括在本发明制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂的名单为聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或者以不同比例的混合物存在于所述蛋白质或者衍生物的制剂中。
可以增强肽(或衍生物)吸收的添加剂为例如脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
控释经口制剂也是希望的。肽(或衍生物)可以掺入到允许通过扩散或者浸取机制释放的惰性基质，如树胶中。缓慢变性基质也可以掺入到制剂中。某些肠包衣也具有缓释效果。控释的另一种形式是通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即药物封装在半透性膜中，该膜允许水进入并且由于渗透作用将药物挤过一个小的开口。
其他包衣可以用于制剂。这些包衣包括可以在包衣锅中应用的多种糖。肽(或衍生物)还可以膜包衣的片剂提供并且用于该情况的材料分成两组。第一组是非肠物质并且包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组由通常为苯二甲酸酯的肠材料组成。
材料混合物可以用于提供最佳膜包衣。可以在锅涂布器或者在流化床或者通过压缩包衣进行膜包衣。
肠胃外递送用于肠胃外施用的根据本发明的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂或乳剂。非水性溶剂或者赋形剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油和玉米油、明胶和可注射的有机酯，如油酸乙酯。此类剂型还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如，通过保留细菌的滤器过滤、向组合物掺入消毒剂、通过放射处理组合物或者通过热处理组合物进行消毒。它们还可以在使用即刻前用无菌水或者某种其他无菌可注射介质产生。
直肠或阴道递送用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，其除了活性物质还包含赋形剂，如可可脂或者栓剂蜡。用于经鼻或舌下施用的组合物也可以用本领域熟知的标准赋形剂制备。
经肺递送本文还设想经肺递送EPO-R激动剂肽(或者其衍生物)。肽(或衍生物)被吸入时递送到哺乳动物的肺中并穿过肺上皮层进入血流[见，例如，Adjei，等人(1990)Pharmaceutical Research 7565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet，等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)143-146(内皮素-1)；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，卷III，206-212页(α1-抗胰蛋白酶)；Smith，等人(1989)J.Clin.Invest.841145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein，等人(1990)″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs，等人(1988)J.Immunol.1403482-3488(γ干扰素和肿瘤坏死因子α)；和Platz等人的美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)]。在Wong等人的美国专利号5,451,569中描述了经肺递送药物实现全身性效果的方法和组合物。
预计用于本发明实践中的是设计用于经肺递送治疗产品的多种机械装置，其包括但不限于喷雾器、定量吸入器和粉末吸入器，它们都是本领域技术人员熟悉的。适于本发明实践的通过商业途径可获得的装置的一些特例为Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)；Ventolin定量吸入器(GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC)；和Spinhaler粉末吸入器(FisonsCorp.，Bedford，MA)。
所有此类装置需要使用适于肽(或衍生物)的调剂的制剂。通常，每种制剂对于所有装置的类型是特异的并且可以包括除了用于治疗的常规稀释剂、佐剂和/或载体之外还使用适宜的推进剂物质。而且，预计使用脂质体、微囊剂或者微球体，包括复合物，或者其他类型载体。根据所用的化学修饰类型或者装置类型，在不同制剂中还可以使用化学修饰的肽。
适于用射流或超声喷雾器使用的制剂将通常包含溶于水中的肽(或衍生物)，其浓度为每毫升溶液约0.1到25mg生物活性蛋白质。该制剂还可以包括缓冲剂和简单糖(例如，用于蛋白质稳定和渗透压的调节)。喷雾器制剂还可以包含表面活性剂，其减小或者防止形成气溶胶中溶液的雾化导致肽(或衍生物)的聚集。
定量吸入器装置使用的制剂将通常包含细分的粉末，其含有通过表面活性剂悬浮在推进剂中的肽(或衍生物)。推进剂可以是用于该目的的任意常规物质，如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或者烃，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷或者它们的组合。适宜的表面活性剂包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
用于从粉末吸入器装置调剂的制剂将包含细分的干燥粉剂，其含有肽(或衍生物)并且还可以包括膨胀剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖或者甘露醇，它们的量将促进粉剂从装置的分散，例如，按重量计为制剂的50-90％。肽(或衍生物)应该最有利地以颗粒形式制备，其平均颗粒大小小于10mm(或者微米)，最优选0.5到5mm，以最有效地递送到远端肺。
鼻递送还预计EPO-R激动剂肽(或衍生物)的鼻递送。鼻递送允许向鼻子使用治疗产品后，肽直接进入血流，而不必使产物沉积在肺中。用于经鼻递送的制剂包括使用葡聚糖或者环葡聚糖的那些制剂。
剂量对于所有肽化合物，随着进一步研究的进行，将出现关于治疗多种患者中多种疾病的适宜的剂量水平的信息，普通技术人员考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康，将能够确定适宜给药。所选剂量取决于所希望的治疗效果、施用途径和所希望的治疗持续时间。通常，每天将0.001到10mg/kg体重的剂量水平施用于哺乳动物。通常，对于静脉内注射或者灌注，剂量可以较低。给药方案可以取决于循环半寿期和所用制剂而变。
本发明的肽(或者它们的衍生物)可以与一种或多种额外的活性成分或者药物组合物结合施用。
实施例下面的实施例阐明本发明，但是不作为限制。
实施例1H-HAP-Boc分子的合成步骤ACbz-TAP的合成 将TAP(10g，67.47mmol，从Aldrich Chemical Co.购买)在无水二氯甲烷(DCM)(100ml)中的溶液冷却到0℃。将氯甲酸苯甲酯(Cbz-Cl，Cbz＝羧基苄氧基)(4.82ml，33.7mmol)在无水DCM(50ml)中的溶液通过滴液漏斗在6-7小时内缓慢加入TAP溶液，而整个过程中反应混合物的温度保持在0℃。然后使所得混合物升温到室温(～25℃)。再过16小时后，真空下除去DCM并且残渣在3N HCl和乙醚之间分配。收集水性层并用50％NaOH水溶液中和到pH 8-9并用乙酸乙酯萃取。用无水Na2SO4干燥乙酸乙酯层，然后真空浓缩以提供粗品单-Cbz-TAP(5g，约50％产率)。该化合物不经进一步纯化直接用于步骤B的反应。
步骤BCbz-TAP-Boc的合成 将Boc2O(3.86g，17.7mmol，Boc＝叔丁氧基羰基)加入Cbz-TAP(5g，17.7mmol)在己烷(25ml)的剧烈搅拌的悬浮液中。在室温继续搅拌过夜。将反应混合物用DCM(25ml)稀释并用10％柠檬酸水溶液(2X)、水(2X)和盐水洗涤。用无水Na2SO4干燥有机层并真空浓缩。粗产物(产率5g)直接用于步骤C的反应中。
步骤CBoc-TAP的合成 将来自步骤B的粗品Cbz-TAP-Boc溶于甲醇(25ml)中并在5％披钯碳(5％w/w)存在下在气球压(balloon pressure)氢化16小时。过滤混合物，用甲醇洗涤并在真空下浓缩滤液得到粗品H-TAP-Boc产物(产率3.7g)。
步骤A-C后总产率约44％(基于所用Cbz-Cl的量计算)。
实施例2将间隔臂连接到具有C-末端的肽下面的反应图解阐明怎样将间隔臂连接具有C-末端的肽。
具有游离C-末端的肽
根据实施例1制备H-TAP-Boc。DCC为N，N’-二环己基碳二亚胺。
实施例3将间隔臂连接到具有游离侧链酸的肽下面的反应图解阐明怎样将间隔臂连接到具有游离侧链酸的肽。
具有游离侧链酸的肽 TFA是三氟乙酸。
实施例4用mPEG-NPC PEG化肽在C-末端具有TAP的肽 其中mPEG-NPC具有下面的结构 实施例5用mPEG-SPA PEG化肽在C-末端具有TAP的肽 其中mPEG-SPA具有下面的结构 实施例6连接间隔臂和合成肽下面的反应图解阐明怎样将间隔臂连接到固相支持体和在该固相支持体上合成肽。
实施例7合成连接到树脂的具有间隔臂的肽二聚体步骤ATentaGel-连接体的合成 将TentaGel溴化物(2.5g，0.48mmol/g，从德国Rapp Polymere得到)、苯酚连接体(5当量)和K2CO3(5当量)在20ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中加入到70℃并保持14小时。冷却到室温后，洗涤树脂(0.1N HCl、水、乙腈(ACN)、DMF、MeOH)并干燥得到琥珀色树脂。
步骤BTentaGel-连接体-TAP(Boc)的合成 将来自上面步骤的树脂2.5g和H-TAP-Boc(1.5gms，5当量)和冰醋酸(34μl，5当量)用1∶1MeOH/四氢呋喃(THF)的混合物吸收并过夜摇动。向混合物加入氰基硼氢化钠(5当量)溶于THF的1M溶液并再摇动7小时。树脂过滤洗涤(DMF、THF、0.1N HCl、水、MeOH)并干燥。将少量树脂用苄基氯和二异丙基乙基胺(DIEA)在DCM的溶液苯甲酰化并用70％三氟乙酸(TFA)-DCM切割并用LCMS和HPLC检查。
步骤CTentaGel-连接体-TAP-Lys的合成 来自上面步骤B的树脂用的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的活化溶液(Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基，从5当量氨基酸和5当量HATU(N，N，N’，N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲鎓制备)溶于0.5M DMF的溶液然后加入10当量DIEA制备)处理并轻微摇动14小时。然后将树脂洗涤(DMF、THF、DCM、MeOH)并干燥得到受保护的树脂。树脂用10％乙酸酐、20％吡啶在DCM中的溶液处理20分钟，然后如上洗涤来帽化残留胺基。将树脂在DMF中30％哌啶溶液轻微摇动20分钟除去Fmoc基团，然后洗涤(DMF、THF、DCM、MeOH)并干燥。
步骤DTentaGel-连接体-TAP-Lys(肽)2的合成
来自上面步骤C的树脂进行用HBTU/HOBt活化偶联Fmoc-氨基酸和用哌啶除去Fmoc的重复循环以同时构造两条肽链。这在可以从AppliedBiosystems，Inc得到的ABI 433自动肽合成仪上方便地进行。最后的Fmoc去除后，将末端胺基用乙酸酐(10当量)和DIEA(20当量)在DMF中的溶液酰化20分钟，然后如上洗涤。
步骤E从树脂切割 将来自上面步骤D的树脂室温下悬浮在TFA(82.5％)、苯酚(5％)、乙二硫醇(2.5％)、水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中3小时。也可以使用备选切割混合物，如TFA(95％)、水(2.5％)和三异丙基硅烷(2.5％)。TFA溶液冷却到5℃并倒入Et2O中以沉淀肽。过滤并减压干燥得到具有间隔臂的所希望的肽二聚体。通过制备HPLC以C18柱纯化得到具有间隔臂的纯的肽二聚体。
步骤F氧化氧化具有还原半胱氨酸残基的二聚肽(连接到间隔臂)得到具有二硫键的二聚肽。
二聚肽溶于20％DMSO/水(1mg干重肽/mL)并允许在室温静置36小时。通过将反应混合物加到C18HPLC柱(Waters Delta-Pak C18，15微米颗粒大小，300埃孔径，40mm×200mm长度)，然后使用40分钟内从5到95％ACN的线性ACN/水/0.01％TFA梯度进行纯化。含有所希望肽的级分经冻干得到松软的白色固态产物。
实施例8用mPEG-NPC PEG化具有间隔臂的肽二聚体 例如， 连接到间隔臂的二聚肽与等量(基于摩尔)活化的PEG种类(mPEG-NPC，日本的NOF Corp.生产，可以通过美国NektarTherapeutics(以前“Shearwater Corp.”)得到)在无水DMF中的溶液混合得到澄清溶液。5分钟后，向上述溶液加入4当量DIEA。在室温下搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱法证实PEG化肽的结构。mPEG-NPC具有下面的结构 实施例9用mPEG-SPA PEG化具有间隔臂的肽二聚体 还可以用mPEG-SPA实施具有间隔臂的肽二聚体的PEG化。mPEG-SPA具有下面的结构。
实施例10离子交换纯化实施例8中所得 样品用于鉴定适于纯化肽-间隔臂-PEG缀合物的离子交换支持体。
一般步骤如下将离子交换树脂(2-3g)装入1cm柱，然后转化成钠形式(将0.2N NaOH装入1cm柱，直到洗脱液为pH 14)，然后转化成氢形式(用0.1N HCl或者0.1M HOAc洗脱直到洗脱液匹配上样pH)，然后用25％ACN/水洗涤直到pH 6。缀合前的肽或者肽-PEG缀合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)并用TFA调节pH至低于3，然后在单独的实验中装入柱子上。用2-3体积25％ACN/水洗涤并收集5mL级分后，通过用25％ACN/水中的0.1MNH4OAc洗脱从柱子释放肽，再次收集5mL级分。HPLC分析揭示哪些级分包含目的肽。用蒸发光散射检测器(Evaporative Light-ScatteringDetector(ESLD))分析表明当肽滞留在柱上并用NH4OAc溶液洗脱时(通常级分4和10之间)，没有观察到作为污染物的非-缀合的PEG。当以最初洗涤缓冲液洗脱肽时(通常前2个级分)，没有观察到所希望的PEG-缀合物和过量PEG的分离。
基于离子交换支持体分离肽-PEG缀合物与未反应的(或水解的)PEG的能力以及它们滞留起始二聚肽的能力选择这些离子交换支持体。Mono SHR5/5强阳离子交换预装柱(Amersham Biosciences)、SE53 Cellulose微粒状强离子交换支持体(Whatman)、和SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换支持体(Amersham Biosciences)被鉴定为适宜的离子交换支持体。
实施例11基于α-氨基酸合成三功能分子合成具有下面结构的分枝三功能分子 m＝1-5，n＝1-14，m和n为整数其中X＝OH 或 所述合成是根据下面的方案
m＝1-5，n＝1-14，m和n为整数这些三功能分子可以同时作为连接体和间隔臂。
实施例12基于叔酰胺合成三功能分子合成具有下面结构的分枝三功能分子 m＝1-5，n＝1-14，m和n为整数其中X＝OH 或 所述合成是根据下面的反应方案 m＝1-5，n＝1-14，m和n为整数这些三功能分子可以同时作为连接体和间隔臂。
实施例13合成同三功能(homotrifunctional)分子合成具有下面结构的分枝三功能分子
m＝1-2，n＝1-6，m和n为整数其中X＝OH 或 所述合成是根据下面的反应方案 m＝1-2，n＝1-6，m和n为整数这些三功能分子可以同时作为连接体和间隔臂。
实施例14用三功能分子进行C-末端二聚化和PEG化根据实施例12产生具有如下结构的三功能分子
该三功能分子用于根据下面的反应图解的C-末端二聚化和PEG化 实施例15用三功能分子进行N-末端二聚化和PEG化根据下面的制备三功能分子 5分钟内向Boc-βAla-OH(10.0g，52.8mmol)(Boc＝叔丁氧基羰基)和亚氨基二乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)在200mL DCM中的0℃溶液加入DCC(10.5g，50.9mmol)。在2分钟内形成白色沉淀。让反应混合物升温到室温并搅拌24小时。用烧结滤器(介质多孔性)滤除尿素并减压除去溶剂。将残渣用500mL EtOAc(EtOAc＝乙酸乙酯)吸收，如上过滤，并转移到分液漏斗。有机相经洗涤(饱和NaHCO3、盐水、1N HCl、盐水)、干燥(MgSO4)、过滤和干燥得到无色油。油在10分钟内固化得到白色晶体状固体。
将粗品二酯用75mL THF(THF＝四氢呋喃)和75mL MeOH(MeOH＝甲醇)吸收并加入50mL水。向该溶液加入25mL水中的KOH(KOH＝氢氧化钾)(8.6g，153mmol)溶液。反应混合物颜色变成淡黄色。搅拌12小时(pH仍然～12)后，在旋转蒸发器上除去有机溶剂，所得淤浆在Et2O(Et2O＝二乙酯)和饱和NaHCO3之间分配。合并的水相酸化到pH 1，用NaCl饱和，并用EtOAc萃取。将EtOAc相洗涤(盐水)、干燥(MgSO4)，并浓缩得到13.97g产物，其为白色固体(2步90.2％)。
注释当在ACN中进行DCC反应时产率下降到73％。当使用DIC时，不用层析不能从目的产物除去尿素副产物；不用层析可以定量除去DCC尿素。用水溶性碳二亚胺也能很好地进行反应。
5分钟内向50mL ACN中二酸(1.00g，3.29mmol)和羟基琥珀酰亚胺(0.945g，8.21mmol)的溶液加入DCC(1.36g，6.59mmol)。立即形成白色沉淀。搅拌反应混合物22小时并过滤除去DCC尿素。减压除去溶剂并用EtOAc(250mL)吸收溶剂，并转移到分液漏斗。有机相经洗涤(饱和NaHCO3、盐水、1N HCl、盐水)、干燥(MgSO4)、并浓缩得到白色固体。将固体以75mLACN吸收、过滤、浓缩得到1.28g产物，其为白色固体(78.2％产率)。
注释产率在THF中下降到31％，在DMF(DIC代替DCC)中下降到68％，在DCM/DMF中下降到57％。起始二酸在ACN中是可溶的，因此如果在DCC加入前存在没有溶解的物质，可以将其滤除并丢弃。
该三功能分子用于根据下面的反应图解进行N-末端二聚化和PEG化 实施例16合成mPEG2-赖氨醇-NPC将通过商业途径可获得的赖氨醇(lysinol)用过量mPEG2处理，导致形成mPEG2-赖氨醇。之后，用过量NPC处理mPEG2-赖氨醇，形成mPEG2-赖氨醇-NPC。
实施例17用三功能分子PEG化(PEG部分包含两个线性PEG链)根据实施例15制备具有下面结构的三功能分子
步骤1-三功能连接体偶联到肽单体为了偶联连接体，将2当量肽与无水DMF中的1当量三功能连接体混合得到澄清溶液，2分钟后加入5当量DIEA。室温下搅拌混合物14小时。减压除去溶剂并将粗产物溶于DCM中的80％TFA中30分钟以除去Boc基团，然后通过C18反相HPLC纯化。通过电喷射质谱法证实二聚体的结构。该偶联反应将连接体连接到每个单体的赖氨酸残基的ε氨基的氮原子。
步骤4-肽二聚体的PEG化通过氨基甲酸酯键PEG化将肽二聚体和PEG种类(mPEG2-赖氨醇-NPC)以1∶2摩尔比在无水DMF中混合得到澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入4当量DIEA。室温搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还将纯化的肽通过如下概述的阳离子交换层析进行纯化。
通过酰胺键PEG化将肽二聚体和PEG种类(mPEG2-Lys-NHS)以1∶2摩尔比在无水DMF中混合得到澄清溶液。5分钟后，向上面的溶液加入10当量DIEA。可以从例如，Nektar Therapeutics(490 Discovery Drive，Huntsville，Alabama35806)的Molecular Engineering目录(2003)的条目号2Z3X0T01得到mPEG2-Lys-NHS。室温搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还将纯化的肽通过如下概述的阳离子交换层析进行纯化。
本发明不限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，根据前面的描述和附图
，除了本文描述的之外对本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这些修饰意在所附权利要求书的范围内。
本发明的说明书中引用和讨论了多种参考文献，包括专利、专利申请、方案和多种出版物。提供这些参考文献的引用和/或讨论仅仅是用于阐明本发明的描述并且不是承认此类参考文献是本文描述的发明的“现有技术”。该说明书中引用和讨论的所有参考文献在此完整并入本文作为参考，就像每个参考文献单独并入作为参考一样。
权利要求
1.包含肽部分、间隔臂部分和水溶性聚合物部分的化合物，其中间隔臂部分在肽部分和水溶性聚合物部分之间并且具有结构-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每个都是整数，它们的值独立地选择。
2.权利要求1的化合物，其中α为整数，1≤α≤6；β为整数，1≤β≤6；ε为整数，1≤ε≤6；δ为0或1；γ为整数，0≤γ≤10；Y为NH或CO。
3.权利要求2的化合物，其中γ＞1并且β＝2。
4.权利要求1的化合物，其中α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y为NH。
5.权利要求1的化合物，其中水溶性聚合物部分是聚(乙二醇)部分。
6.权利要求5的化合物，其中聚(乙二醇)部分的分子量大于20K道尔顿。
7.权利要求5的化合物，其中聚(乙二醇)部分是线性的。
8.权利要求5的化合物，其中聚(乙二醇)部分的分子量为20到40K道尔顿。
9.权利要求5的化合物，其中聚(乙二醇)部分具有小于1.20的多分散值(Mw/Mn)。
10.权利要求1的化合物，其中肽部分是包含一个肽的肽单体。
11.权利要求1的化合物，其中肽部分是包含通过连接体部分连接的两个肽的肽二聚体。
12.权利要求10或11的化合物，其中每个肽包含不超过50个氨基酸单体。
13.权利要求12的化合物，其中每个肽包含约10到25个氨基酸单体。
14.权利要求1的化合物，其中肽部分包含结合红细胞生成素受体的一个或多个肽。
15.权利要求1的化合物，其中肽部分包含结合血小板生成素受体的一个或多个肽。
16.药物组合物，其包含(a)包含肽部分、间隔臂部分和水溶性聚合物部分的化合物，其中间隔臂部分在肽部分和水溶性聚合物部分之间并且具有结构-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每个都是整数，它们的值独立地选择；和(b)一种或多种药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。
17.权利要求16的组合物，其中α为整数，1≤α≤6；β为整数，1≤β≤6；ε为整数，1≤ε≤6；δ为0或1；γ为整数，0≤γ≤10；Y为NH或CO。
18.权利要求17的组合物，其中γ＞1并且β＝2。
19.权利要求16的组合物，其中α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y为NH。
20.权利要求16的组合物，其中水溶性聚合物部分是聚(乙二醇)部分。
21.权利要求20的组合物，其中聚(乙二醇)部分的分子量大于20K道尔顿。
22.权利要求20的组合物，其中聚(乙二醇)部分是线性的。
23.权利要求20的组合物，其中聚(乙二醇)部分的分子量为20到40K道尔顿。
24.权利要求20的组合物，其中聚(乙二醇)部分具有小于1.20的多分散值(Mw/Mn)。
25.权利要求16的组合物，其中肽部分是包含一个肽的肽单体。
26.权利要求16的组合物，其中肽部分是包含通过连接体部分连接的两个肽的肽二聚体。
27.权利要求25或26的组合物，其中每个肽包含不超过50个氨基酸单体。
28.权利要求27的组合物，其中每个肽包含约10到25个氨基酸单体。
29.权利要求16的组合物，其中肽部分包含结合红细胞生成素受体的一个或多个肽。
30.权利要求16的组合物，其中肽部分包含结合血小板生成素受体的一个或多个肽。
31.权利要求1的化合物，其中α＝2；γ＝δ＝β＝ε＝0；Y为CO。
32.权利要求16的组合物，其中α＝2；γ＝δ＝β＝ε＝0；Y为CO。
33.权利要求5的化合物，其中聚(乙二醇)部分包含至少一条单体聚(乙二醇)链。
34.权利要求33的化合物，其中每条聚(乙二醇)链具有20到40K道尔顿的分子量。
35.权利要求16的组合物，其中聚(乙二醇)部分包含至少一条单体聚(乙二醇)链。
36.权利要求35的化合物，其中每条聚(乙二醇)链具有20到40K道尔顿的分子量。
全文摘要
本发明涉及包含肽部分、间隔臂部分和水溶性聚合物部分如聚(乙二醇)部分的化合物。间隔臂部分在肽部分和水溶性聚合物部分之间。间隔臂部分具有结构－NH－(CH
文档编号C07K14/52GK1849141SQ200480018759
公开日2006年10月18日 申请日期2004年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者C·P·霍姆斯, D·图梅尔提, 殷群 申请人:阿费麦克斯公司