专利名称：功能基团在长链末端的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属高分子材料技术领域，具体涉及一种活性功能基团在长链末端的多臂聚乙二醇及其制备方法和在药物制备中的应用。
背景技术：
目前，抗肿瘤药物的种类繁多，就其分子量大小来分，一般可分为两大类一类分子量较低，通常在1000以下，绝大多数为常用的化学合成药物和一些天然药物，如氮芥，顺铂，5-氟尿嘧啶，紫杉醇等都属此列；另一类则分子量较大，绝大多数由基因工程生产的蛋白质和多肽药物则属于第二类。但是无论小分子药物还是大分子药物，都存在着毒性大，溶解性差，半衰期短等缺点。对蛋白质和多肽药物来说，还存在一个免疫性的问题。
将具有生物相容性的聚合物连结药物是解决问题的一个途径。Caliceti，T.等在J.Bioactive Compatible Polym.10103-120(1995)报道了用聚乙烯基吡咯烷酮修饰超氧化物歧化酶的反应；Uren，J.R.等在Cancer Res.39，1927-1933(1981)则报道了多聚DL-丙氨酸对L-天冬酰胺酶的修饰反应。文献和专利中报道最多的则是用各种活化的聚乙二醇(PEG)对各种药物进行的修饰反应。如Nandini，K在Eur.Pat.87304703.9，Mike.A在PCT/US98/00683等描述了肿瘤坏死因子(TNF)和PEG的反应；Gilbert，C.W.等在美国专利US5951974，US5981709以及US6042822报道了PEG对干扰素-α的修饰反应。类似的反应如白介素-2(Rrakash，R.K.，US6251866)和PEG；粒细胞巨噬细胞集落因子(GM-CSF)和PEG(Knusli，C等，Br.J.Haematl，82(4)，654-663(1992)；Malik，E等，Exp.Hemaol，20(8)，1028-1035(1992))；生长激素和PEG等，在众多文献和专利中都可以找到。
在PEG的修饰反应中，用的最多的活性基团由琥珀酰亚胺的酯基，醛基，三氟磺酸酯基，对硝基苯碳酸酯基以及苯并三唑碳酸酯基等。而常用的PEG有线型的和两臂分叉型两种，其分子量在2,000～60,000之间，其中的一端被烷基化(Monfardini，C.et al.BioconjugateChem.662-69(1995))。
众所周知，药物高分子化后的性能和所用高分子材料的结构、分子量、分子量分布以及高分子的构型有关。同一结构，不同分子量的高分子在修饰药物后，会产生不同的性质；同一结构，相同分子量，但构型不同的高分子在修饰药物后，也会产生很大的差异。以往在对蛋白质或者其它药物进行聚乙二醇化时存在的几个问题使得所制备的聚乙二醇/蛋白质或者药物的结合物的优点难以实现。其一是与蛋白偶合的多臂聚乙二醇活性官能团位于臂的连接处，这样与蛋白偶合的空间位阻较大，不利于反应进行。其二由于偶合反应缺乏选择性，蛋白质的活性部位很有可能被反应，从而失去生物活性。其三是对于有多个反应点的蛋白质而言，要很好的控制反应的部位一般来说比较困难，这使得结合物的质量很难控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性功能基团在长链末端的多臂PEG及其制备方法和在药物中的应用。和相同分子量的线型和两臂PEG比较，该类型多臂PEG的静态粘度小，流体力学体积大，能对蛋白质药物能产生更为有效的生理作用。和活性功能基团在臂连接处的多臂树杈型PEG比较，它的活性端基在长链的末端，空间位阻较小，更利于与药物分子的偶合反应。
本发明提出的活性功能基团在长链末端的多臂PEG，是由三官能团小分子化合物经化学反应将PEG结合在一起而获得。该功能化的多臂PEG记为(R-PEG)z-X-PEG-F，其中R为10个碳以下的直链烷烃，异丙基或苄基；Z代表臂数，为1-8的整数；X为连结点，即三官能团小分子化合物；PEG为聚乙二醇，F表示活性功能基团，例如为端基官能团等；PEG与三官能团小分子化合物以共价键连接，连接基团选自酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、环氧基、羧基、羟基、巯基或碳水化合物，或其中几个组合之一种；所用的三官能团小分子化合物的结构式为下列A、B、C、D、E和F之一种 这里，n为1～9的整数，m为0～6的整数；例如，当其中三官能团小分子化合物X为H2N(CH2)nCH(NH2)CO2H(n为1-9的整数)，连接基团为酰胺基或者氨基甲酸酯时，为活性端基在长链末端的八臂聚乙二醇((R-PEG)8-X-PEG-F)，其结构式如下
这里，R为10个碳以下的直链烷烃，异丙基或苄基，优先选择甲基；N为1～9的整数；K为0～6的整数；S，t，o，p为10～2,000的整数；W为O、S或者NH之一；F为下列功能基团之一H，OH，NH2， 其他臂数的树杈型活性PEG具有与上述(R-PEG)8-X-PEG-F类似的结构，具体结构将根据具体臂数而有所不同。例如，在七臂PEG的结构中，将会有一个单链PEG取代八臂PEG结构中的一个二臂结构，而在六臂PEG的结构中，则含有六个单链PEG，依此类推。其中，每臂PEG的分子量为400～80,000。
上述多臂聚乙二醇的制备方法如下先由单链聚乙二醇与三官能团小分子化合物反应，然后再由两端都带有活性基团的PEG反应，即得到活性基团在长链末端的多臂聚二乙醇。
本发明中，所述三官能小分子化合物(X)的活性基团为羧基和两个氨基，或者为羧基和两个羧基。具体可以为前述结构式(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)之一种。
本发明中，每臂PEG的分子量为400-80000。通过控制反应，在制备单臂或双臂的活性PEG的基础上，分别制备活性基团在长链末端的3臂、4臂、5臂、6臂、7臂或8臂的聚乙二醇。
二臂树杈型PEG的合成方法在本领域中已有描述，例如，Yamsuki等，Agric.Bio.Chem.1998，52，2185-2196；Monfardini等，Bioconjugate Chem。1995，6，62-69。在本发明中，这些文献均被引入作为参考。
活性端基在长链末端的多臂PEG的制备方法类似，当X为赖氨酸(Lysine)，W为NH，n为4，k为0，F为NH2时，可按下列反应路线来制备活性端基NH2在PEG末端的三臂树杈型PEG((R-PEG)3-Lys-PEG-NH2)，其中所用到的单臂和双臂的活性PEG可根据上述Monfardini等人的方法来制备。
上述路线中是通过对硝基苯酚酯来活化羧基的，也可以用生成其他活性酯的方法来对羧基进行活化，如琥珀酰亚胺酯。
显然，依据上面的路线，只需在制备过程中根据需要对反应条件予以适当控制，就可以比较容易地制备出活性端基在长链末端的多臂PEG。结合本发明的公开，这一点对于本领域的技术熟练人员来说将是显而易见的。
本发明提供的活性端基在长链末端的多臂PEG可用于药物的制备。如可广泛用于小分子药物、蛋白质和多肽药物的修饰，即通过长链末端的活性功能基团与小分子药物、多肽或蛋白质药物结合。这里小分子药物如抗肿瘤药物中的苯丁酸氮芥、顺鉑、5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素或甲氨喋呤；蛋白质药物如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、生长因子、集落刺激因子、促红细胞生成素或超氧化物歧化酶。修饰的具体操作可参照单链PEG的方法，这在本领域已有描述。如Greenwald等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Caliceti等，IL Farmaco，1993，48，919；Zalipsky与Lee，《聚乙二醇化学生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，Plenum Press，N.Y.，1992。在此将这些文献公开，全部引入本文作为参考。使用本发明的高分子材料修饰的药物，可改进药物的溶解性、稳定性和免疫原性，以延长药物的半衰期，提高疗效。
实际试验表明，本发明具有如下优点其一，由于制备的多臂PEG的活性功能基团位于长链的末端，增大了与药物分子上反应基团的碰撞几率，提高了反应效率。其二，由于活性端基在长链末端的多臂PEG的流体力学体积大，当它与蛋白质上的某个部位结合后，由于空间位阻的作用，其他部位就很难与另一多臂PEG反应，从而提高了对结合部位的选择性。其三，通过控制多臂PEG的臂数及分子量可以控制其流体力学体积，使得其难接近蛋白质的活性部位，这样所得的聚乙二醇/蛋白质结合物可以保持较高的生物活性。其四，由于多臂结构的存在，使得多臂PEG将会比线形PEG或者二臂分叉PEG更为有效地阻止接近蛋白质表面的大分子或者细胞，从而进一步提高结合物在体内循环的时间，减少免疫反应的发生。
具体实施例方式
本发明在以下的实施例中得到进一步的说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。为了便于说明，在以下的实施例中，R基为甲基，mPEG指单甲氧基PEG，其中表征方法GPC指凝胶渗透色谱，MALDI为基质辅助激光解吸/离子化质谱。
实施例一不同臂长的mPEG3-Lys-PEG-NH2的制备(对硝基苯酚酯活化法)将赖氨酸(439mg，3mmol)溶于20mlpH值为8.0～8.3的水中，然后在3小时内向其中分批加入mPEG2-Lys-CO2PhNO2(二臂mPEG对硝基苯酚酯，分子量10000，其中一臂为7000，另一臂为3000，10g，1mmol)，同时用0.2mol/L的NaOH来维持体系的pH值在8.3。在室温搅拌过夜后，将反应物冷却到0℃，并用2mol/L的盐酸将体系的pH值调节到3。现用乙醚从水中提取出杂质，再用氯仿连续提取三次，提取液浓缩后滴加入无水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀经乙醇两次重结晶后，得到mPEG2单取代的赖氨酸(mPEG2-mono-Lysine)。产物经氨基滴定，GPC及MALDI表征，其纯度达99％。
向溶有上述产品(9g，0.9mmol)的无水二氯甲烷(30mL)中，加入三乙胺(TEA)直至pH值达到8。mPEG-Lys-CO2PhNO2(单臂mPEG对硝基苯酚酯，分子量5000，5.025g，1.05mmol)在三小时之内分批加入反应液中，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，被室温冷却，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。过量的mPEGCO2PhNO2在PH为9～10的Na2CO3缓冲溶液中搅拌过夜后被水解，溶液被冷至0℃，并用2mol/L的盐酸体系的pH值调节到3。然后通过乙醚提取溶液中的对硝基苯酚。再用氯仿连续提取三次，提取液经干燥浓缩后用无水乙醚沉淀，然后用无水乙醇重结晶。所得产物用QAESephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH＝8.9的硼砂缓冲液)进一步纯化，得到mPEG3-Lys-CO2H，其末端官能团为羧基。产物经羧基滴定，GPC及MALDI表征，纯度达99％。
在0℃，向溶有上述mPEG3-Lys-CO2H(三臂mPEG羧酸衍生物9g，0.6mmol)的无水二氯甲烷(20mL)中加入对硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经浓缩后用无水乙醚沉淀，再经乙酸乙酯重结晶，得到羧端基被对硝基苯酚酯活化的三臂PEG(mPEG3-Lys-CO2PhNO2)。产物经水解后，于碱性条件下测定对硝基苯酚负离子的紫外吸收，表明活性酯含量达98％以上。将两端为NH2基团的PEG(分子量2,000，5g，2.5mmol)溶解在无水二氯甲烷(20mL)中，用三乙胺调节pH值为8。向该溶液中分批加入mPEG3-Lys-CO2PhNO2(7.55g，0.5mmol)，两小时内加入完毕，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，室温冷却，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。所得产物用QAESephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH＝8.9的硼砂缓冲液)进一步纯化，得到mPEG3-Lys-PEG-NH2。产物经氨基滴定，GPC及MALDI表征，纯度达99％。
实施例2不同臂长的mPEG3-Lys-PEG-NH2的制备(N-羟基琥珀酰亚胺酯活化法)将上述实施例1中的对硝基苯酚改为等量的N-羟基琥珀酰亚胺即可。
实施例3不同臂长的mPEG4-Lys-PEG-NH2的制备(对硝基苯酚酯活化法)向溶有实施例1中所述产品mPEG2-mono-Lysine(分子量10000，9g，0.9mmol)的无水二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(TEA)直至PH值达到8时。mPEG2CO2PhNO2(分子量10000，其中一臂为6000，另一臂为4000，10.5g，1.05mmol)在三个小时内分批加入反应液中，同时用TEA维持体系的PH值在8左右。反应物回流72小时后，被冷却到室温，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。过量的mPEG2-CO2PhNO2在pH值9-10的缓冲溶液中搅拌过夜后被水解，溶液被冷至0℃，并用2mol/L的盐酸体系的pH值调节到3。然后通过乙醚提取溶液中的对硝基苯酚。再用氯仿连续提取三次，提取液经干燥浓缩后用无水乙醚沉淀，然后用无水乙醇重结晶。所得产物用QAESephadexA50柱(5×80cm，淋洗液PH＝8.9的硼砂缓冲液)分离后，得到很纯的mPEG4-Lys-CO2H，其末端官能团为羧基。产物经羧基滴定，GPC及MALDI表征，纯度为98.5％。
在0℃，向溶有上述mPEG4-Lys-CO2H(12g，0.6mmol)的无水二氯甲烷(25mL)中加入对硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室温下搅拌过夜后，过滤，滤液经浓缩后用无水乙醚沉淀，再经乙酸乙酯重结晶，得到羧端基被对硝基苯酚酯活化的四臂PEG(mPEG4-Lys-CO2PhNO2)，纯度98％。将两端为NH2基团的PEG(分子量2,000，5g，2.5mmol)溶解在无水二氯甲烷(20mL)中，用三乙胺调节pH值为8。向该溶液中分批加入mPEG4-Lys-CO2PhNO2(10.05g，0.5mmol)，两小时内加入完毕，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，室温冷却，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。所得产物用QAESephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH＝8.9的硼砂缓冲液)进一步纯化，得到mPEG4-Lys-PEG-NH2。产物经氨基滴定，GPC及MALDI表征，纯度达99％。
实施例4不同臂长的mPEG4-Lys-PEG-NH2的制备(N-羟基琥珀酰亚胺酯活化法)将上述实施例3中的对硝基苯酚改为等量的N-羟基琥珀酰亚胺即可。
实施例5相同臂长mPEG4-Lys-PEG-NH2的制备将赖氨酸盐酸盐(365mg，2mmol)溶于100mLPH值在8的硼砂缓冲溶液中，然后向其中加入mPEG2-Lys-CO2Su(二臂mPEG琥珀酰亚胺酯，分子量20,000，每臂分子量均为10,000，80g，4mmol)，同时用0.2mol/L的NaOH来维持体系的pH值在8。在室温搅拌24小时后，将反应无用去离子水稀释到400mL，用草酸调节滤液的pH值到3，然后用二氯甲烷连续提取三次，提取液浓缩后滴加到无水乙醚中，得白色沉淀，所得沉淀经乙醇两次重结晶后，得到mPEG4-Lys-CO2H的粗产物。粗产物经DEAE Sephadex FF柱分离后，得纯的mPEG4-Lys-CO2H，产率为92％。产物结构经核磁共振，GPC及MALDI质谱证实。
将上述的mPEG4-Lys-CO2H(24g，0.6mmol)溶于溶于无水二氯甲烷(20mL)中，冷却至0℃，向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.138g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经浓缩后用无水乙醚沉淀，再经乙酸乙酯重结晶，得纯的产物mPEG4-Lys-CO2Su。产物中活性酯含量经紫外光谱法测定，为96％。
将两端为NH2基团的PEG(分子量2,000，5g，2.5mmol)溶解在无水二氯甲烷(20mL)中，用三乙胺调节pH值为8。向该溶液中分批加入mPEG4-Lys-CO2Su(20g，0.5mmol)，两小时内加入完毕，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，室温冷却，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。所得产物用QAESephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH＝8.9的硼砂缓冲液)进一步纯化，得到mPEG4-Lys-PEG-NH2。产物经氨基滴定，GPC及MALDI表征，纯度达99％。
实施例6相同臂长mPEG8-Lys-PEG-NH2的制备参照实施例5的方法，以mPEG4CO2Su为原料，制得mPEG8CO2Su，再与两端为氨基的PEG反应，得到相同臂长的mPEG8-Lys-PEG-NH2，总产率为85％。
在以下实施例中，若原料采用不等臂的多臂功能PEG，则产物为不等臂的；若原料采用等臂的多臂功能PEG，则产物为等臂的。
实施例7mPEG5-Lys-PEG-NH2的制备参照实施例1的方法，先后以mPEG3-Lys-CO2PhNO2和mPEG2-Lys-CO2PhNO2为原料，可制得mPEG5-Lys-CO2PhNO2，总产率为90％。参照实施例2的方法，可制得mPEG5-Lys-CO2Su，总产率为91％。再与两端为氨基的PEG反应，得到相应的mPEG5-Lys-PEG-NH2。
实施例8mPEG6-Lys-PEG-NH2的制备参照实施例1的方法，以mPEG3-Lys-CO2PhNO2为原料，可制得mPEG6-Lys-CO2PhNO2，总产率为89％，或者先后以mPEG2-Lys-CO2PhNO2和mPEG4-Lys-CO2Su为原料，可制得mPEG6-Lys-CO2PhNO2，总产率为92％。参照实施例2的方法，可制得mPEG6-Lys-CO2Su，总产率为88％。再与两端为氨基的PEG反应，得到相应的mPEG6-Lys-PEG-NH2。
实施例9mPEG7-Lys-PEG-NH2的制备参照实施例1的方法，先后以mPEG3-Lys-CO2PhNO2和mPEG4-Lys-CO2Su为原料，可制得mPEG7-Lys-CO2PhNO2，总产率为86％。参照实施例2的方法，可制得mPEG7-Lys-CO2Su，总产率为87％。再与两端为氨基的PEG反应，得到相应的mPEG6-Lys-PEG-NH2。
实施例10
mPEG8-Lys-PEG-NH2的制备参照实施例1的方法，先后以mPEG3-Lys-CO2PhNO2和mPEG5-Lys-CO2Su为原料，可制得mPEG8-Lys-CO2PhNO2，总产率为80％。参照实施例2的方法，可制得mPEG8-Lys-CO2Su，总产率为78％。再与两端为氨基的PEG反应，得到相应的mPEG6-Lys-PEG-NH2。
实施例11用实施例1-10同样的方法，我们制备了活性基团醛基在长链末端的3臂，4臂，5臂，6臂，7臂和8臂聚乙二醇。
实施例12用实施例1-10同样的方法，我们制备了活性基团羧基在长链末端的3臂，4臂，5臂，6臂，7臂和8臂聚乙二醇。
实施例13用实施例1-10同样的方法，我们制备了活性基团羟基在长链末端的3臂，4臂，5臂，6臂，7臂和8臂聚乙二醇。
实施例14用实施例1-10同样的方法，我们制备了活性基团马来酰亚胺在长链末端的3臂，4臂，5臂，6臂，7臂和8臂聚乙二醇。
权利要求
1.一种活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇，其特征在于由三官能团小分子化合物经化学反应与PEG结合在一起而形成，记为(R-PEG)z-X-PEG-F，其中，R为10个碳以下的直链烷烃，异丙基或苄基；Z代表臂数，为1-8的整数；X为连结点，即三官能团小分子化合物；F表示活动功能基团，PEG为聚乙二醇，PEG与三官能团小分子化合物以共价键连接，连接基团选自酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、环氧基、羧基、羟基、巯基或碳水化合物，或其中几个组合之一种；所用的三官能团小分子化合物的结构式为下列之一种 这里，n为1～9的整数，m为0～6的整数。
2.根据权利要求1所述活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇，其特征在于当三官能团小分子化合物X为下列结构 其中，n为1～9的整数，连接为酰胺基或氨基甲酸酯时，为八臂树权型功能化聚乙二醇(R-PEG)8-X-PEG-F，其结构式如下 其中R为10个碳以下的直链烷烃，异丙基或苄基；n为1～9的整数；k为1～6整数；s，t，o，p为10～2,000的整数；W为O、S或者NH之一；F为下列功能基团之一
3.一种如权利要求1所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的制备方法，其特征在于通过单链聚乙二醇与三官能团小分子化合物反应，然后再与两端都带有活性基团的PEG反应，得到活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇。
4.根据权利要求3所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的制备方法，其特征在于三官能团小分子化合物的活性基团为羧基和两个氨基或者羧基和两个羟基。
5.根据权利要求3所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的制备方法，其特征在于三官能团小分子化合物为下列结构之一 其中，n为1～9的整数，m为0～6的整数。
6.根据权利要求3所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的制备方法，其特征在于通过单链PEG与三官能团小分子化合物反应，其每臂的分子量为400～80,000，通过控制反应，分别制备活性基团在长链末端的3臂，4臂，5臂，6臂，7臂和8臂聚乙二醇。
7.根据权利要求3所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的制备方法，其特征在于PEG与三官能团小分子化合物连接，连接基团为酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、环氧基、羧基、羟基、巯基或碳水化合物，或其中几个组合之一种。
8.如权利要求1述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇在药物制备中的应用，其特征在于其通过长链末端的活性功能基团与小分子药物、多肽和蛋白质药物结合。
9.根据权利要求8所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的应用，其特征在于所述小分子药物为苯丁酸氮芥、顺铂、5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素或甲氨喋呤。
10.根据权利要求8所述的活性基团在长链末端的多臂聚乙二醇的应用，其特征在于所述蛋白质药物为干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、生长因子、集落刺激因子、促红细胞生成素或超氧化物歧化酶。
全文摘要
本发明属高分子材料技术领域，具体为一种新型的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用。该多臂PEG中，一个臂的术端带有活性功能基团，可广泛用于小分子药物、蛋白质和多肽药物的修饰，用于改进药物的溶解性、稳定性和免疫原性，以延长药物的半衰期，提高疗效。
文档编号A61K47/48GK1995094SQ20061014767
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者黄骏廉, 任勇, 徐学伟 申请人:复旦大学