专利名称：用于核酸转染的二硫化物连接的聚乙二醇/肽缀合物的制作方法
用于核酸转染的二硫化物连接的聚乙二醇/肽缀合物本发明涉及通式(I)的新型聚合载体分子及其变化形式，其允许在体内和体外将核酸有效地转染到细胞中，涉及由核酸和所述新型聚合载体分子形成的聚合载体货物复合物，还涉及制备所述新型聚合载体分子和所述新型聚合载体货物复合物的方法。本发明还提供所述新型聚合载体分子和新型聚合载体货物复合物作为用于治疗各种疾病的药物和在制备用于治疗此类疾病的药物组合物中的应用方法和用途。目前，多种疾病需要涉及施用基于肽、蛋白、和核酸的药物、特别是涉及将核酸转染到细胞或组织中的治疗。基于肽、蛋白、和核酸的药物的完全治疗能力通常受到它们有限的穿过哺乳动物细胞质膜的能力的损害，这导致较差的细胞通过和不充分的治疗功效。目前，这种妨碍代表着对于生物医学开发和多种生物制药商业成功的主要挑战(参见，例如， Foerg 禾口 Merkle，Journal of Pharmaceutical Sciences (制药科学杂志)，在线公布于 www. interscience. wiley. com,2008,97(1) 144-62)。对于一些疾病或病症，已经开发了基因治疗途径作为此类治疗的特定形式。这些治疗通常利用将核酸或基因转染到细胞或组织中，而基因治疗方法另外涉及将这些核酸或基因中的一种或多种插入到个体细胞和组织中来治疗疾病，例如，遗传性疾病，其中缺陷型突变等位基因被有功能的等位基因替换。然而，目前，将这些核酸或基因中的一种或多种转移或插入到个体细胞中仍然代表主要的挑战，并且对于确保基于核酸的药物的良好治疗效果(特别是在基因治疗领域中)绝对是必需的。为了实现将核酸或基因成功转移到个体细胞中，必须克服多种不同的障碍。核酸的转运典型地通过核酸与细胞膜的缔合以及随后由内体摄入而进行。在内体中，引入的核酸与胞质分开。当在细胞溶胶中进行表达时，这些核酸必须脱离胞质。如果核酸不成功脱离胞质，则内体与溶酶体融合导致其内含物的降解，或者内体与细胞膜融合导致其内含物返回到细胞外介质中。为了有效转移核酸，因此，内体逃逸似乎是除转染效率本身之外最重要的步骤之一。迄今为止，存在解释这些问题的不同途径。然而，没有一种途径至少在所有方面是成功的。目前，本领域中所用的转染剂典型地包括肽、不同的聚合物、脂质以及纳米颗粒和微粒(参见，例如，Gao，X.，K. S.Kim，等(2007), Aaps J 9(1) :E92_104)。这些转染剂典型地已经仅成功地用在体外反应中。当在体内将核酸转染到活动物的细胞中时，必须满足进一步的需要。例如，考虑到凝集，复合物必须在生理盐溶液中是稳定的。此外，其不与宿主补体系统的各部分相互作用。另外，复合物应该保护核酸不被到处存在的核酸酶过早地在细胞外降解。此外，对于基因治疗应用，极其重要的是，载体不被适应性免疫系统识别(免疫原性)并且不刺激非特异性的细胞因子爆发(imspecific cytokine storm)(急性免疫应答)(参见 Gao, Kim 等，(2007,同上)；Martin, Μ. Ε.和 K. G. Rice (2007)，Aaps J 9(1) E18-29 ；以及 Foerg 和 Merkle, (2008，同上))。Foerg和Merkld2008，同上)讨论基于肽、蛋白和核酸的药物的治疗潜力。根据他们的分析，这些药物的完全的治疗潜力通常被其有限的穿过哺乳动物细胞质膜的能力所损害，这导致较差的细胞通过和不充分的治疗功效。目前，这种妨碍代表着对于生物医学开发和多种生物制药商业成功的主要挑战。在这种情形中，Gao等(Gao 等 The AAPS Journal (AAPS 杂志)2007 ；9 (1)论文 9) 注意到在开发将治疗性基因递送至所选的细胞(在其中可以获得正确的基因表达)的方法中对基因治疗的主要挑战。然而，基因递送和将核酸特别成功的转染到细胞或组织中并不简单，并且典型地取决于多种因素。为了成功的递送，例如，将核酸或基因递送至细胞或组织，必须克服许多障碍。根据Gao等Q007)，一种理想的基因递送方法需要满足3个主要标准(1)应该保护转基因在细胞内基质中不被核酸酶降解，( 应该使得转基因穿过质膜， 和(3)应该没有有害作用。这些目标必须使用不同化合物或载体的组合来实现。显著地，存在一些化合物或载体，其至少克服这些障碍中的一些。最常见地，例如，核酸的转染，使用病毒或非病毒载体进行。为了成功的递送，这些病毒或非病毒载体必须能够克服上文提及的障碍。目前可用的最成功的基因治疗策略依赖于使用病毒载体，诸如腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、和疱疹病毒。病毒载体能够以高效和长期基因表达的可能性介导基因转移，并且满足3个标准中的2个。然而，基因治疗临床试验所不包括的急性免疫反应、免疫原性、和插入诱变已经引起关于一些常用病毒载体的严重的安全性关注。当使用非病毒载体时，可能发现对该问题的解决方案。尽管非病毒载体不如病毒载体有效，但是已经开发了多种非病毒载体来提供基因治疗的更安全的备选方案。已经使用物理(无载体基因递送)和化学方法(基于合成载体的基因递送)研究了非病毒基因递送方法。物理方法通常包括针头注射、电穿孔、基因枪、超声、和流体动力学递送，利用穿透细胞膜并且促使细胞内基因转移的物理力进行。化学方法典型地使用合成的或天然存在的化合物(阳离子脂质、阳离子聚合物、脂质-聚合物杂化系统)作为载体将转基因递送至细胞。尽管已经在基础科学和多种非病毒基因递送系统的应用中取得了显著的进展，但是大部分的非病毒方法的有效性仍然比病毒载体差得多，尤其是用于体内基因递送时(例如， 参见，Gao 等 The AAPS Journal (AAPS 杂志)2007 ；9 (1)论文 9)。在过去的十年间，已经宣告了对于核酸细胞递送的实质性改善的有吸引力的展望，认为这由其与所谓的细胞穿透肽(CPI^s)的物理组装或化学连接所导致，所述细胞穿透肽也表示为蛋白-转导结构域(PTDs)(参见R)erg和Merkle，Q008，同上))。CPI3S表示 10至约30个氨基酸的短肽序列，其可以穿过哺乳动物细胞的质膜，并且因此可以为细胞药物递送提供无比的机会。几乎所有这些肽都包含一系列与序列组合的阳离子氨基酸，其在低PH下形成α-螺旋。当在体内PH通过质子泵持续降低时，通常快速起始肽的构象变化。 该螺旋基序介导插入到内体的膜中，导致其内容物释放到细胞质中(参见i^oerg和Merkle， (2008,同上)；和 Vives，E.，P. Brodin，等(1997). “ A truncated HIV-ITat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus (截短的HIV-ITat蛋白碱性结构域快速通过质膜易位并且在细胞核中积聚)· “ J Biol Chem (生物化学杂志)272 05) :16010-7) 0尽管有这些优点，但是认为 CPP介导的药物递送的主要障碍由在与上皮和内皮的酶屏障接触或通过上皮和内皮的酶屏障时的常见的肽快速代谢清除所组成。总之，CPI^s的代谢稳定性代表着其细胞生物利用度的重要生物制药学因素。然而，在本领域中没有可用的CPI^s，所述CPI^s—方面足够稳定，足以在它们被代谢清除之前将它们的货物运送到靶标，并且另一方面，在它们可能积聚并且达到毒性水平之前可以从组织中清除。本领域用于将货物分子递送到细胞中(例如，用于基因治疗)的另一种方法包括肽配体(参见 Martin 和 Rice (参见 Martin 和 Rice, The AAPS Journal (AAPS 杂志)2007 ； 9(1)论文幻)。肽配体可以是取自较长蛋白的短序列，其代表受体识别所需要的基本氨基酸，诸如用于靶向癌细胞的EGF肽。已经鉴别了其它的肽配体，包括用于靶向凝集素-样氧化的LDL受体(L0X-1)的配体。内皮细胞中L0X-1的上调与功能障碍状态如高血压和动脉粥样硬化(atherosclerosis)相关。然而，此类肽配体不适用于多种基因治疗途径，因为它们不能通过复合或黏附与其货物分子连接，而是需要共价键，例如，交联剂，这典型地在细胞中表现出细胞毒性作用。在本领域中，合成的载体也可以用于将货物分子递送到细胞中，例如，用于基因治疗目的。然而，许多合成的载体的一个主要缺点是它们比病毒载体差的转染效率，并且需要显著的改善才能够获得进一步的临床发展。已经鉴定了限制核酸体外和体内转运的一些障碍，并且包括载体在生理条件下较差的细胞内递送、毒性和不稳定性(参见，例如Read， Μ· L. ,K. H. Bremner,等(2003) · “ Vectors based on reducible polycations facilitate intracellular release of nucleic acids (基于可还原的聚阳离子的载体促进核酸的细胞内释放).“J Gene Med (基因医学杂志)5 (3) :232-45)。基因治疗的一种特定的方法使用阳离子脂质。然而，尽管多种阳离子脂质在细胞培养中表现出极好的转染活性，但是大部分在存在血清的条件下表现得不好，仅有一些在体内有活性。当脂质复合物(lipoplexes)暴露于血液、黏液上皮细胞衬液、或组织基质中存在的压倒性量的带负电荷且通常是两性的蛋白和多糖时，在尺寸、表面电荷、和脂质组成方面发生急剧变化。当体内施用时，脂质复合物倾向于与带负电荷的血液成分相互作用，并且形成可能吸附到循环的红血细胞表面上、截留在厚的黏膜层或栓塞在微血管中的大聚集体，这防止它们到达远端位置的既定靶细胞。此外，已经观察到了与脂质复合物基因转运相关的毒性。症状特别包括诱导炎性细胞因子。在人类中，在接受脂质复合物的受试者中观察到不同程度的不利的炎性反应，包括流感样症状。因此，关于脂质复合物是否可以完全安全地在人类中使用似乎是有疑问的。基因治疗的另一种更有希望的方法使用阳离子聚合物。证明阳离子聚合物对核酸转染是有效的，因为它们可以紧紧复合并缩合带负电荷的核酸。因此，已经研究了多种阳离子聚合物作为体外和体内基因递送的载体。这些包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚酰胺型胺类(polyamidoamine)和聚丙胺树状聚体，聚丙烯胺，阳离子葡聚糖，壳聚糖，阳离子蛋白和阳离子肽。尽管大部分阳离子聚合物共有将DNA缩合成小颗粒的功能并且通过经由与细胞表面上阴离子位点的电荷-电荷相互作用的内吞作用促进细胞摄入，但是它们的转染活性和毒性显著不同。有趣的是，由于较强的带负电荷核酸货物的复合作用，随分子量升高，阳离子聚合物表现出更好的转染效率。然而，升高的分子量也导致阳离子聚合物升高的毒性。 PEI可能是活性最强的，且是研究最多的用于基因递送的聚合物，但是其作为转染试剂的主要缺点涉及其非生物降解的性质和毒性。此外，即使由高分子量聚合物形成的人工合成多聚体(polyplexes)在生理条件下表现出提高的稳定性，但是数据已表明此类聚合物可能妨碍载体卸载(unpacking)。例如，19和36个残基的聚(L-赖氨酸)(PLL)表现出比180 个残基的PLL更迅速地与DNA解离，导致显著提高的短期基因表达。将DNA压缩成在受体介导的基因递送中有活性的结构需要6-8个阳离子氨基酸的最短长度。然而，由短的聚阳离子形成的人工合成多聚体在生理条件下是不稳定的，并且典型地在生理盐溶液中迅速聚集。为了克服这一不利影响，Read 等(参见 Read，M. L.，K. H. Bremner，等(2003). “ Vectors based on reducible polycations facilitate intracellular release of nucleic acids(基于可还原的聚阳离子的载体促进核酸的细胞内释放)."J Gene Med(基因医学杂志)5(3) :232-45 ；和 Read，M. L.，S. Singh，等(2005). “ A versatile reducible polycation-based system for efficient delivery of a broad range of nucleic acids(用于有效递送宽泛范围的核酸的通用基于聚阳离子的系统)."Nucleic Acids Res (核酸研究)33 (9) :e86)研发了一种新型合成的载体，该载体基于通过肽Cys-Lysltl-Cys 的氧化缩聚制备的直链可还原的聚阳离子(RPC)，其可以通过细胞内环境分裂，从而促进核酸的释放。他们可能表明，由RPC形成的人工合成多聚体通过还原条件而去稳定，能够有效释放DNA和mRNA。RPC的分裂还将聚阳离子的毒性减少至与低分子量肽相当的水平。Read 等0003，同上)的这种方法的缺点是另外需要内体裂解剂氯喹或阳离子脂质DOTAP将转染效率提高至足够的水平。结果，Read等0005，同上)在具有已知的内体缓冲能力的RPCs 中包括组氨酸残基。他们可能表明，富含组氨酸的RPCs可以被细胞内还原环境分裂，能够在不需要内体裂解剂氯喹的条件下进行宽泛范围核酸的有效的细胞质递送，所述核酸包括质粒DNA、mRNA和siRNA分子。不幸的是，Read等Q005，同上)没有评价富含组氨酸的RPCs是否可以直接用于体内应用。在他们的研究中，转染在不存在血清的条件下进行，以避免可能由于血清蛋白与限制细胞摄入的人工合成多聚体的结合导致的对组氨酸残基增强基因转运的能力的掩蔽。 初步的实验表明富含组氨酸的RPC人工合成多聚体的转染特性可以受到血清蛋白存在的影响，在10% FCS (胎牛血清)中观察到GFP-阳性细胞减少50%。对于体内应用，他们提议用亲水性聚合物聚-[N-Q羟基-丙基)甲基丙烯酰胺]进行修饰。不幸的是，Read等 0005，同上)没有防止人工合成多聚体的聚集和聚阳离子蛋白与血清蛋白的结合。此外， 由于聚合物大量过剩(其特征在于高N/P比率)，当复合核酸时，形成强阳离子复合物，由于它们强烈的盐诱导凝集的倾向和与血清内容物的相互作用(调理作用(opsonization))， 它们仅在体内有有限的应用。另外，当用于基因治疗目的时，这些复合物可能激发急性免疫应答。Read等0003，同上)也没有提供公布中所示的关于基于RPC的复合物的体内数据。 还证明这些基于强阳离子RPC的复合物在局部施用到皮肤中后完全没有活性。此外，Read 等0005，同上)使用严格的氧化条件(30%DMS0)来诱导产生具有尽可能长的链长度的高分子聚合物(“逐步生长聚合作用”)，从而确保核酸货物的完全复合。以与 Read 等相似的方法，McKenzie 等(McKenzie, D. L.，K. Y. Kwok,等(2000)， J Biol Chem(生物化学杂志)275(14) :9970-7.，McKenzie, D. L.，E. Smiley，等(2000)， Bioconjug Chem(生物缀合化学)11(6) :901_9，和US 6，770，740 Bi)出于减少对高分子聚阳离子观察到的毒性的目的通过将多个半胱氨酸插入到短的合成肽中而开发了自交联的肽作为基因递送剂。为了复合DNA，他们将自交联肽与DNA混合以诱导肽间二硫键同时复合 DNA货物。对于体内基因递送方法，他们提议用在远离每个末端的位点可操作地连接到肽上的隐形剂(stealthing agent)(例如，聚乙二醇)或靶向剂衍生自交联肽。在另一种方法中，为掩蔽DNA肽缩合物并由此减少与血液成分的相互作用的目的，同作者研发了通过可还原或不可还原的连接用聚乙二醇衍生非交联阳离子肽CWK18 (Kwok，K. Y.，D. L. McKenzie, 等(1999). “ Formulation of highly soluble poly (ethylene glycol)-peptide DNA condensates (配制高度可溶的聚(乙二醇)-肽DNA缩合物).〃 J Pharm ki (药学科学杂志)88(10) :996-1003.)。总结上述，上文示例的现有技术有多种缺点。Read等Q003，同上)或McKenzie 等0000 I和II，同上与US 6，770，740 Bi)所述的自交联肽的一个特别的缺点涉及在所形成的颗粒表面上的高正电荷。由于高的正电荷，当这些颗粒在体内经历升高的盐浓度时，所述颗粒表现出倾向于凝集的高度不稳定性。然而，这样的盐浓度在体内典型地存在于细胞或细胞外介质中。此外，高度带正电荷的复合物表现出强烈的调理作用倾向。这导致增加的由巨噬细胞的摄入，并且由于降解导致该复合物快速失活。具体地，免疫系统细胞对这些复合物的摄入通常导致不同细胞因子的下游刺激。然而，先天免疫系统的这种非特异性活化代表这些系统的严重缺点，应该避免，特别是出于基因治疗的一些方面的目的，其中应该严格避免急性免疫应答(细胞因子爆发)。另外，在生物系统中，带正电荷的复合物可以容易地被细胞外基质或血清的带负电荷成分结合或固定。此外，复合物中的核酸可能释放得太早，这导致复合物在体内的转运效率和半衰期降低。此外，用对体内基因递送有利的隐形剂(如聚乙二醇(PEG))对载体的可逆性衍生仅对肽单体是可能的，对自交联肽不可能，或相反用于具有确定的聚合物链长度的聚合载体。特别地，这样的可逆性衍生在交联的阳离子肽载体的末端是不可能的。另外，在现有技术中，仅记述了具有长聚合物链或具有由自交联肽组成的不限定的聚合物链长度的高分子聚合物，不利的是，其将它们的货物压缩到细胞中货物释放受到限制这样的程度。这种极端不确定的聚合物链长度对于基于RPC的药物的批准更加有问题。批准药物的一个前提是每种药物制剂总是具有相同的组成、相同的结构和相同的特性。对于基于来自现有技术的RPC’ s的复合物，这不能得到确切的保证。此夕卜，现有技术中提供的基于RPC的聚合物或复合物由于其不确定的结构或聚合物链长度难以进行表征。但是，所得到的复合物或聚合载体的表征对于药物的批准绝对是必需的。因此，目前为止，还没有出现这样的可行的方法或载体其允许压缩和稳定核酸用于基因治疗目的或其它治疗应用，其表现出良好的转染活性并结合核酸货物的良好释放， 特别是在体内，并且毒性低或者甚至没有活性，例如，由于通过自交联聚合物对核酸的可逆隐形和可逆复合的组合所导致。因此，本领域对提供用于基因转运目的的载体仍然存在迫切的需求，所述载体一方面足够稳定足以在它们被代谢分解之前将它们的货物运送至靶标，并且另一方面可以在它们可能积聚且达到毒性水平之前从组织中清除。因此，本发明的目的是提供一种载体或络合剂(complexing agent)，特别是用于基因治疗目的或其它治疗应用的核酸转染，其能够压缩核酸，优选编码DNA或编码RNA，诸如mRNA，并且其不但允许在体外将核酸有效转染到不同的细胞系中，而且允许在体内的转染。因为细胞摄入通过内体途径发生，这样的载体或络合剂还应该允许或提供有效的核酸释放。另外，优选的是，由核酸货物和所述载体或络合剂形成的本发明的聚合载体货物复合物表现出提高的凝聚抗性。对于包含血清的介质，优选地，还应该赋予核酸货物增加的稳定性。最重要的是，应该获得体内活性，由此至少部分抑制急性免疫反应。此外，应该保证所述载体的可重现的生产和表征。这一目的通过本发明的主题得以解决，优选地通过后附权利要求的主题得以解决。特别地，按照本发明的第一实施方案，上述目的通过通式(I)的聚合载体分子得以解决L-P1-S- [S-P2-S] n-S-P3-L其中，P1和P3彼此不同或相同，并且表示直链或支链的亲水性聚合物链，每个P1和P3具有至少一个-SH-结构部分，当与组分P2、或备选地与(AA)x、或[(AA)x]z(如果所述组分用作P1和P2或P3和P2之间的接头)和/或与其他组分(例如，(AA)x, [(AA)JjL)缩合时能够形成二硫键，所述直链或支链的亲水性聚合物链彼此独立地选自聚乙二醇(PEG)， 聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱，聚(羟烷基L-天冬酰胺)，聚甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱)，羟乙基淀粉或聚(羟烷基 L-谷氨酰胺)，其中所述亲水性聚合物链具有约IkDa至约IOOkDa的分子量，优选约2kDa 至约25kDa的分子量；或更优选约2kDa至约IOkDa的分子量，例如，约5kDa至约25kDa或 5kDa至约IOkDa的分子量；P2是阳离子或聚阳离子肽或蛋白，优选具有约3至约100个氨基酸的长度，更优选具有约3至约50个氨基酸的长度，甚至更优选具有约3至约25个氨基酸的长度，例如，约 3至10，5至15，10至20或15至25个氨基酸的长度，更优选具有约5至约20个氨基酸的长度，甚至更优选具有约10至约20个氨基酸的长度；是阳离子或聚阳离子聚合物，典型地具有约0. 5kDa至约30kDa的分子量，包括约 IkDa至约20kDa的分子量，甚至更优选约1. 5kDa至约IOkDa的分子量，或具有约0. 5kDa至约IOOkDa的分子量，包括约IOkDa至约50kDa的分子量，甚至更优选约IOkDa至约30kDa 的分子量；每个P2具有至少两个-SH-结构部分，当与其它组分P2或组分P1和/或P3或备选地与其他组分(例如，(AA)x，或[(AA)Jz)缩合时能够形成二硫键；-S-S-是(可逆的)二硫键(对于更好的可读性，忽略括号)，其中S优选地表示硫或-SH携带结构部分，其已经形成(可逆的)二硫键。所述(可逆的)二硫键优选地通过任一组分P1与P2，P2与P2，或P2与P3，或任选地本文定义的其他组分(例如，L，(AA)x, [(AA) Jz等)的-SH-结构部分的缩合形成；所述-SH-结构部分可以是这些组分结构的一部分或通过下文定义的修饰添加；L是任选的配体，其可以存在或不存在，并且可以独立于其它选自RGD，转铁蛋白， 叶酸，信号肽或信号序列，定位信号或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体，细胞穿透肽 (例如，TAT或KALA)，受体的配体(例如，细胞因子，激素，生长因子等)，小分子(例如，糖类，如甘露糖或半乳糖或合成的配体)，小分子激动剂，受体的抑制剂或拮抗剂(例如，RGD 肽模拟类似物)等；η是整数，其典型地选自约1至50的范围，优选地选自约1，2或3至30的范围， 更优选选自约1，2，3，4，或5至25的范围，或约1，2，3，4，或5至20的范围，或约1，2，3，4， 或5至15的范围，或约1，2，3，4，或5至10的范围，包括例如约4至9，4至10，3至20，4至 20，5至20，或10至20的范围，或约3至15，4至15，5至15，或10至15的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，η在约1，2，3，4，或5至10的范围内，更优选地在约1，2， 3，或4至9的范围内，在约1，2，3，或4至8的范围内，或在约1，2，或3至7的范围内。本发明通式(I)的聚合载体分子通过新合成策略制备，并且有利地允许限定聚合物链的长度，并且将不同(短)聚合物的理想特性组合到一种聚合物中，例如，为了基因治疗或其他治疗应用的目的的有效核酸转染的目的有效地压缩核酸而不失去活性，特别在体外有效地将核酸转染到不同细胞系中以及体内转染。并且，本发明的聚合载体分子对细胞没有毒性，并且提供其核酸货物的有效释放。最后，由于特别在通式(I)的本发明的聚合载体分子末端可逆添加亲水性聚合物链(例如，PEG-单体)，其表现出提高的凝聚抗性，所述亲水性聚合物链另外赋予核酸货物对包含血清的介质的增加的稳定性，并且防止免疫系统识别所述聚合载体货物复合物。甚至更有利地，本发明通式(I)的聚合载体分子允许很大程度上改变其肽或聚合物内容物，并且因此非常容易且快速地调控其生物物理/生物化学特性，特别是组分 [S-P2-S]n的阳离子特性，例如，通过结合相同或不同的阳离子肽、蛋白或聚合物作为组分P2 和任选地在重复组分[S-P2-S]中添加其他组分，例如，氨基酸组分(AA)x，从而形成修饰的重复组分，如{[S-P2-S]a/[S-(AA)X-S]b}作为本发明聚合物载体的核心基序(其中a+b = n， 参见下文)。即使由非常小的无毒性单体单位组成，本发明的聚合载体分子形成具有确定链长度的阳离子结合序列，提供核酸货物的强缩合和复合物稳定性。在胞质的还原环境(例如，胞质GSH)中，该复合物迅速降解成其单体，其进一步被降解(例如，寡肽)或分泌(例如，PEG)。这支持核酸货物在胞质中的释放(deliberation)。由于在胞质中降解成小的寡肽，如对于高分子寡肽已知的，例如，对高分子寡聚精氨酸，没有观察到毒性。PEG- “包被” 还允许某种程度上在聚合载体末端用亲水性包衣“包被”聚合载体，其防止盐介导的凝聚和与血清成分的不理想的相互作用。在胞质中，在细胞的还原条件下，这种“包被”容易去除。 此外，这种作用促进核酸货物在胞质中的释放。如上文定义，配体(L)可以任选地用在本发明通式(I)的聚合载体分子中，例如， 用于将本发明的载体聚合物及其复合的核酸导向特定细胞中。它们可以独立于其它选自 RGD,转铁蛋白，叶酸，信号肽或信号序列，定位信号或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体， 细胞穿透肽，(例如TAT)，受体的配体(例如，细胞因子，激素，生长因子等)，小分子(例如，糖类如甘露糖或半乳糖或合成的配体)，小分子激动剂，受体的抑制剂或拮抗剂(例如， RGD肽模拟类似物)等。在这种情形中特别优选的是甘露糖作为配体靶向在其细胞膜上携带甘露糖受体的抗原呈递细胞。在本发明第一实施方案的进一步优选的方面，半乳糖作为任选的配体可以用来靶向肝细胞。此类配体可以通过下文定义的可逆二硫键或通过任何其他可能的化学附着连接至组分P1和/或P3，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(Michael addition)(例如马来酰亚胺结构部分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学(click-chemistry)(例如叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化 (methatesis)(例如烯烃类或炔烃类)，亚胺或腙形成(醛类或酮类，胼(hydrazins)，羟胺类(hydroxylamins)，胺类)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许Sn-型置换反应的组分(例如卤代烷，硫醇，醇类，胺类，胼，酰胼，磺酸酯，氧鳞盐(oxyphosphonium salts))或可以用于连接其它组分的其它化学结构部分。在本发明的式(I)的情形中，组分P1和P3表示含有至少一个-SH-结构部分的直链或支链的亲水性聚合物链，每个P1和P3彼此独立地选自，例如，聚乙二醇(PEG)， 聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱，聚(羟烷基L-天冬酰胺)或聚(羟烷基L-谷氨酰胺)。P1和P3可以彼此不同或相同。优选地，每个亲水性聚合物P1和P3具有约IkDa至约IOOkDa的分子量，优选约IkDa至约75kDa，更优选约5kDa至约50kDa，甚至更优选约5kDa至约25kDa的分子量。另外，每个亲水性聚合物P1 和P3典型地具有至少一个-SH-结构部分，其中所述至少一个-SH-结构部分在与组分P2或与组分(AA)x(如果其用作P1与P2或P3与P2之间的接头，如下文定义)和任选地与其它组分(例如L和/或(AA)x，例如如果包含两个以上-SH-结构部分)缩合时，能够形成二硫键。 上述通式(I)的下述分式"P1-S-S-P2"和“P2-S-S-P3”(对于更好的可读性，忽略括号)，其中Sj1和P3中的任一个如本文定义，典型地表示这样的情形，其中亲水性聚合物P1和P3的一个-SH-结构部分与上述通式(I)的组分P2的一个-SH-结构部分缩合，其中这些-SH-结构部分的两个硫形成如本文在式(I)中定义的二硫键-S-S-。这些-SH-结构部分典型地由亲水性聚合物P1和P3中的每一个提供，例如，通过内部半胱氨酸或任何其它携带-SH结构部分的(修饰的)的氨基酸或化合物提供。因此，如果-SH-结构部分是由半胱氨酸提供的，则分式"P1-S-S-P2"和 “P2-S-S-P3” 也可以写作"P1-Cys-Cys-P2"和 “P2-Cys-Cys-P3，，， 其中术语Cys-Cys表示通过二硫键而不是通过肽键偶联的两个半胱氨酸。在这种情形中，这些式中的术语“-S-S-”也可以写作“-S-Cys”，“-Cys-S”或“-Cys-Cys-”。在这种情形中，术语“-Cys-Cys-”不表示肽键而是表示两个半胱氨酸通过它们的-SH-结构部分形成二硫键的连接。因此，术语“-Cys-Cys-”也可以一般理解为“-(Cys-Q-(S-Cys)-”， 其中在这种特定情形中，S表示半胱氨酸-SH-结构部分的硫。同样地，术语“-S-Cys”和 “-Cys-S”表示含有-SH的结构部分和半胱氨酸之间的二硫键，其也可以写作"-S-(S-Cys)，， 和“-(Cys-Q-S”。备选地，亲水性聚合物P1和P3可以用-SH结构部分修饰，优选地通过与携带-SH结构部分的化合物进行的化学反应进行修饰，以便亲水性聚合物P1和P3中的每一个携带至少一个这样的-SH结构部分。这样携带-SH结构部分的化合物可以是，例如，(另外的)半胱氨酸或任何进一步(修饰的)携带-SH结构部分的氨基酸。这样的化合物也可以是任何非氨基化合物或结构部分，其包含或允许将-SH结构部分引入到本文定义的亲水性聚合物P1和P3中。这样的非氨基化合物可以通过化学反应或结合化合物，例如，通过结合3-硫代丙酸或thioimolane，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(Michael addition)(例如马来酰亚胺结构部分，α , β不饱和羰基等)，通过click化学(click-chemistry)(例如叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(例如烯烃类或炔烃类)，亚胺或腙形成(醛类或酮类，胼，羟胺类，胺类)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许Sn-型置换反应的组分(例如卤代烷，硫醇，醇类，胺类，胼，酰胼，磺酸酯，氧鳞盐)或可以用于连接其它组分的其它化学结构部分而连接到本发明式(I)的亲水性聚合物P1和P3上。在这种情形中的特别优选的PEG衍生物是α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)。在每种情形中，SH-结构部分，例如半胱氨酸或任意进一步(修饰的)氨基酸或化合物的SH-结构部分，可以存在于亲水性聚合物P1和P3的末端或内部的任何位置。如本文定义，亲水性聚合物P1和P3中的每一种典型地具有至少一个-SH-结构部分(优选地在一个末端)，但是也可以包含两个或者甚至多个-SH-结构部分，其可以用于另外连接本文定义的其它组分，例如，配体、氨基酸组分(AA)x、抗体、细胞穿透肽(例如TAT)等。
按照本发明第一实施方案的进一步优选的方面，亲水性聚合物P1和P3中的每一种还可以包含至少一个其它官能结构部分，其允许连接本文定义的其它组分，例如， 配体、氨基酸组分(AA)x等。所述官能结构部分可以选自允许其它组分连接的官能度 (functionalities)，例如，本文定义的官能度，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(例如马来酰亚胺结构部分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学(click-chemistry)(例如叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(例如烯烃类或炔烃类)，亚胺或腙形成(醛类或酮类，胼，羟胺类，胺类)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许Sn-型置换反应的组分(例如卤代烷，硫醇，醇类，胺类，胼，酰胼，磺酸酯，氧鳞盐)或可以用于连接其它组分的其它化学结构部分。在本发明式⑴的情形中的组分P2优选表示阳离子或聚阳离子肽或蛋白，或备选地表示阳离子或聚阳离子聚合物。每个组分P2典型地具有至少两个-SH-结构部分，当与其它组分P2、组分P1和/或P3或备选地与其它组分(例如氨基酸组分(AA)x)缩合时能够形成二硫键。组分P2典型地存在于本发明式(I)的重复组分[-s-p2-s-]n中。术语“阳离子或聚阳离子”典型地是指带电荷分子，其在约1-9、优选4-9、5-8或甚至6-8的pH值，更优选在9以下、8以下、或7以下的pH值，最优选在生理pH值，例如，约7. 3-7. 4，是带正电荷的(阳离子)。因此，按照本发明作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或作为根据本发明是组分P2的阳离子或聚阳离子聚合物在生理条件下带正电荷，特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。在本发明式⑴的组分P2是阳离子或聚阳离子肽或蛋白的特定情形中，组分 [S-P2-Sln ^ {[S-P2-S]a/[S-(AA)x-s]b的阳离子特性(如下文定义)可以按其在整个组分^-严^丸或{[S-P2-S]a/[S-(AA)X-S]b}中的阳离子氨基酸的含量来确定。优选地，组分[S-P2-Sln ^ ([S-P2-Sla/[S-(AA)x-S] J中的阳离子氨基酸的含量为至少10%,20%, 或30%，优选至少40%，更优选至少50%，60%或70%，而且优选至少80%，90%，或甚至 95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 %，最优选至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %， 90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%，或可以在约10%至90%的范围内，更优选在约 15% -75%的范围内，甚至更优选在约20% -50%的范围内，例如20%，30%，40%或50%， 或在由前文提及的任意两个数值形成的范围内，条件是在整个组分^-严^^或{[S-P2-S] a/[S-(AA)x-S] J中的所有氨基酸(例如，阳离子、亲脂性、亲水性、芳香族和其它氨基酸)的含量是100%。在本发明式(I)的组分P2是阳离子或聚阳离子聚合物的特定情形中，组分 [S-P2-Sln或{[S-P2-S] a/[s-(AA)x-S] J的阳离子特性可以按其与组分[S-P2-Sln或 {[S-P2-S] J [S- (AA) x-s] J 的总电荷相比在整个组分[S-P2-S] n 或{[S-P2-S] J [S- (AA) X-S]J中的阳离子电荷含量来确定。优选地，在本文定义的(生理)pH下组分[S-P2-S] 或{[S-P2-S]a/[S-(AA)x-S] J中的阳离子电荷含量是至少10%，20%，或30%，优选至少 40%，更优选至少50%，60%或70%，而且优选至少80%，90%，或甚至95%，96%，97%， 98%，99% 或 100%，最优选至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，96 %， 97%，98%，99%或100%，或可以在约10% -90%的范围内，更优选在约15% -75%的范围内，甚至优选在约20 % -50 %的范围内，例如20 %，30 %，40 %或50 %，或在由前文提及的任意两个数值形成的范围内，条件是在本文定义的(生理)pH下在整个组分[S-P2-S]n或{[S-P2-S]a/[S-(AA)x-S]J中的所有电荷(例如，正电荷和负电荷)的含量是100%。在由核酸货物和按照本文定义的通式(υ -Ρ^Ξ-Β-Ρ ΙΙ-Ρ3-!^(或按照其在本文中的任一种分式)的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的特定情形中，特别优选的是整个重复组分^-严^丸或{[S-P2-S]a/[S-(AA)x-s]b}中的所有电荷中至少有10%是阳离子，从而允许带负电荷的核酸货物的复合。作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白，或作为组分P2的阳离子或聚阳离子聚合物，优选地是直链分子，然而，还可以使用支化的阳离子或聚阳离子肽或蛋白作为组分P2 或支化的阳离子或聚阳离子聚合物作为组分P2。典型地，组分P2，例如本文定义的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或阳离子或聚阳离子聚合物，连接到其相邻组分，例如组分P1和P3，和/或作为重复组分[S-P2-S]n的一部分通过二硫键(-S-S-)连接至其它组分P2，或连接至作为{[S-P2-S]a/[S-(AA)x-s]b}的一部分的(AA)x组分。在这种情形中，在重复组分[S-P2-S]n中邻近组分P2的硫和通式(I) L-P1-S-LS-P2-SJn-S-P3-L中定义的硫是提供二硫键所必需的，可以由组分P2自身通过本文定义的-SH结构部分而提供，或可以通过修饰组分P2因此在上述重复组分[S-P2-S]n的定义中具有-SH结构部分而提供。组分P2的-SH结构部分优选如本文关于组分P1和P3所定义。如果按照上述意思形成二硫键(-S-S-)所必需的此类-SH-结构部分由组分P2自身提供，这可以这样存在，例如，通过已经存在于组分P2的氨基酸序列的任意位置在组分P2的氨基酸序列内的携带-SH结构部分的至少两个半胱氨酸或任何进一步(修饰的)氨基酸或化学化合物而存在。备选地，组分P2可以相应地用携带(游离)-SH结构部分的化学化合物修饰，例如，半胱氨酸或任意进一步(修饰的)氨基酸或化学化合物进行修饰。由此，组分P2 优选地携带至少两个-SH-结构部分，其硫原子能够在与本文定义的组分P1或P3的-SH-结构部分缩合时形成二硫键或在第一组分P2和另一组分P2之间形成二硫键，等。此类-SH-结构部分优选如本文定义。优选地，所述至少两个SH-结构部分位于组分P2的末端或在其末端附近。按照本发明第一实施方案的一个特定的方面，在上述通式(I)的重复组分 [S-P2-Sln内的组分P2可以包含半胱氨酸作为-SH结构部分。在这一情形中，重复组分 [S-P2-S]n因此可以写作[Cys-P2-CysJn其中η和P2如本文定义，并且每个Cys提供-SH-结构部分用于二硫键。Cys是其三字母密码表示的氨基酸半胱氨酸。(为了举例说明的目的，在本说明书中，二硫键-S-S-通常还可以写作-(Cys-S) - (S-Cys)-，其中Cys-S表示具有天然存在的-SH结构部分的半胱氨酸，其中该-SH结构部分与第二半胱氨酸的-SH结构部分形成二硫键。因此，重复组分 [Cys-P2-Cys]n还可以写作[(S-Cys)-P2-(Cys-S) ]n，其表示由半胱氨酸提供的-SH-结构部分和半胱氨酸自身提供二硫键的硫。)在上述完整式(I)的情形中，第一实施方案的这一特定方面因此可以定义如下L-P1-S- [Cys-P2-Cys] n_S_P3-L其中L，P1, P2, P3和η如本文定义，S是硫，并且每个Cys提供一个_SH_结构部分用于二硫键。在每种情形中，SH-结构部分，例如用于修饰组分P2的半胱氨酸或任意进一步(修饰的)氨基酸或其它化合物的SH-结构部分，可以存在于作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或阳离子或聚阳离子聚合物，存在于内部或在其一个或两个末端，例如，如果用阳离子或聚阳离子肽或蛋白作为组分P2，可以存在于作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白的N端或C端、这两个末端、和或在内部的任意位置。优选地，-SH结构部分可以存在于组分P2的至少一个末端，更优选地存在于两个末端，例如，存在于作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白的N端和/或C端、更优选地在N端和C端两端。由于其重复特征，组分[S-P2-S] n可以表示一种情形，其中组分P2的至少两个-SH-结构部分中的一个与上述通式(I)的另一个组分P2的-SH-结构部分缩合，其中这些-SH-结构部分的两个硫在第一组分P2和至少一个其它组分P2之间形成二硫键(-S-S-)。在这种情形中，本发明式(I)中组分P2的重复数定义为整数η。是整数，典型地选自约1-50的范围，优选选自约1，2或3至30的范围，更优选选自约1，2，3，4，或5至25 的范围，或约1，2，3，4，或5至20的范围，或约1，2，3，4，或5至15的范围，或约1，2，3，4， 或5至10的范围，包括例如，约3至20，4至20，5至20，或10至20的范围，或约3至15， 4至15，5至15，或10至15的范围，或约6至11或7至10的范围。例如，如果在重复组分 [S-P2-Sl1^，整数η是5，则重复组分[S-P2-S]J;jt选如下[S-P2-S-S-P2-S-S-P2-S-S-P2-S-S-P2-S]在上述实例中，组分P2出现5次(优选以线性顺序)，其中每个组分P2通过符合上述重复组分[S-P2-S]n定义的二硫键与其邻近组分连接。任意组分P2可以彼此相同或不同。按照这一实施方案的一个特定方面，组分P2表示长度为约3至约100个氨基酸、更优选长度约3至约50个氨基酸、甚至更优选长度约3至约25个氨基酸、例如，长度约3-10、 5-15、10-20或15-25个氨基酸、更优选长度为约5至约20个和甚至更优选长度约10至约 20个氨基酸的阳离子或聚阳离子肽或蛋白。作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以是适于这一目的并且具有至少两个-SH-结构部分的任何蛋白或肽，特别是按照本发明定义能够复合核酸并且由此优选地缩合所述核酸的任意阳离子或聚阳离子肽或蛋白。作为组分P2的具有至少两个-SH-结构部分的特别优选的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以选自鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多肽，聚精氨酸，细胞穿透肽(CPI3S),嵌合CPI3S,如Transportan，或MPG肽，HIV-结合肽，Tat，HIV-I Tat (HIV), Tat-衍生肽，寡聚精氨酸，穿透肽家族成员，例如穿透肽(Penetratin)，触角
— 生月太(Antennapedia-derived peptides) (^ !] f=l Drosophila antennapedia), pAntp，pIsl 等，抗微生物-衍生的 CPI3S,例如 Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB (1), pVEC, hCT-衍生肽，SAP, MAP, KALA，PpTG20，富含脯氨酸的肽，Loligomere，富含精氨酸的肽，降钙素-肽，FGF，乳铁蛋白，组蛋白，VP22衍生的或类似物肽，HSV, VP22 (单纯疱疹(Herpes simplex)), MAP, KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，Pep-1, L-寡聚物，降钙素肽等。按照本发明第一实施方案的一个特别优选的方面，作为组分P2的阳离子或聚阳离子肽或蛋白选自具有下述总合式(II)的下述阳离子肽，优选满足它们另外具有至少两个-SH-结构部分的条件
{(Arg) ！ ； (Lys)m ； (His)n ； (Orn) 0 ； (Xaa) J ；(式(II))其中1+m+n+o+x = 8-15，且 l，m，n 或 ο 彼此独立地可以是选自 0，1，2，3，4，5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14或15的任意数，条件是Arg，Lys, His和Orn的总含量占寡肽所有氨基酸的至少10% ；且Xaa可以是选自除Arg、Lys、His或Orn之外的天然(=天然存在的) 或非天然氨基酸的任意氨基酸；且χ可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14 的任意数，条件是Xaa的总含量不超过寡肽所有氨基酸的90%。氨基酸Arg、Lys、His、Orn 和Xaa的任一个可以位于肽的任意位置。该式的特别优选的肽是寡聚精氨酸，如例如，Au7， Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3，YSSR9SSY, (RKH) 4，Y (RKH) 2R 等(SEQ ID NOs :1_9)。按照第一实施方案的特别优选的方面，作为组分P2的具有上文所示的实验式(II) 且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以，但不限于，选自以下亚组的式Arg8, Arg9, Arg10, Arg11, Arg12, Arg13, Arg14, Arg15 ； (SEQ ID NOs :2_3，10-15)；Lys8, Lys9, Lys10, Lys11, Lys12, Lys13, Lys14, Lys15 ； (SEQ ID NOs :16-23)；His8, His9, His10, His11, His12, His13, His14, His15 ； (SEQ ID NOs :24-31)；Orn8, Orn9, Orn10, Orn11, Orn12, Orn13, Orn14, Orn15 ； (SEQ ID NOs :32-39)；按照第一实施方案的特别优选的方面，作为组分P2的具有上文所示的实验式(II) 且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以，但不限于，选自以下亚组的式，其中下式(如同实验式(II))不指定任何氨基酸顺序，但是意欲通过专门指定作为各个肽的组分的氨基酸(的顺序)来反映实验式。因此，例如，实验式Arg(7_14)LySl意欲意指落入该式的肽包含顺序不限的7-14个Arg残基和1个Lys残基。如果该肽包含7个 Arg残基和1个Lys残基，包括所有具有7个Arg残基和1个Lys残基的变体。因此，Lys 残基可以位于例如由7个Arg和1个Lys残基组成的8氨基酸长序列中的任意位置。该亚组优选地包括
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权利要求
1.式(I)的聚合载体分子 L-P1-S- [S-P2-S] n-S-P3-L 其中，P1和P3彼此不同或相同，并且表示直链或支链的亲水性聚合物链，每个P1和P3具有至少一个-SH-结构部分，当与组分P2缩合时能够形成二硫键，所述直链或支链的亲水性聚合物链彼此独立地选自聚乙二醇(PEG)，聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱，聚(羟烷基L-天冬酰胺)，聚O-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱)，羟乙基淀粉或聚(羟烷基L-谷氨酰胺)，其中所述亲水性聚合物链具有约IkDa 至约IOOkDa的分子量，P2是阳离子或聚阳离子肽或蛋白，具有约3至约100个氨基酸的长度，或是阳离子或聚阳离子聚合物，具有约0. 5kDa至约30kDa的分子量， 每个P2具有至少两个-SH-结构部分，当与其它组分P2或组分P1和/或P3缩合时能够形成二硫键；-S-S-是(可逆的)二硫键；L是任选的配体，其可以存在或不存在，并且可以独立于其它选自RGD，转铁蛋白，叶酸，信号肽或信号序列，定位信号或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体，细胞穿透肽，TAT， 受体的配体，细胞因子，激素，生长因子，小分子，糖类，甘露糖，半乳糖，合成的配体，小分子激动剂，受体的抑制剂或拮抗剂，或RGD肽模拟类似物；和η是整数，其选自约1至50的范围，优选地在约1，2，3，4，或5至10的范围内，更优选地在约1，2，3，或4至9的范围内。
2.根据权利要求1所述的聚合载体分子，其中所述聚合载体分子另外包含氨基酸组分 (AA)x，其中χ是选自约1至100范围的整数。
3.根据权利要求2所述的聚合载体分子，其中所述氨基酸组分(AA)x包括芳香氨基酸组分，亲水氨基酸组分，亲脂氨基酸组分，弱碱性氨基酸组分，信号肽，定位信号或序列， 核定位信号或序列，细胞穿透肽，治疗活性蛋白或肽，抗原或抗原表位，肿瘤抗原，致病性抗原(动物抗原，病毒抗原，原生动物抗原，细菌抗原，变应性抗原)，自体免疫抗原，或其它抗原，变应原，抗体，免疫刺激性蛋白或肽，抗原特异性T-细胞受体，或适于特定(治疗性)应用的另一种蛋白或肽。
4.根据权利要求2或3任一项所述的聚合载体分子，其中所述氨基酸组分(AA)x作为混合的重复氨基酸组分[(AA)Jz存在，其中ζ是选自约1至30范围内的整数。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的聚合载体分子，其中式(I)按照式(Ia) L-P1-S- {[S-P2-S] a [S- (AA) X-S] J -S-P3-L 进行修饰，其中χ，z，S，L，AA, P1, P2和P3如前所定义，并且 a+b = η,其中η如前所定义，优选地在约1，2，3，4，或5至10的范围内；a是整数，其独立于整数b选自约1至50的范围内，优选地在约1，2，3，4，或5至10的范围内，并且b是整数，其独立于整数a选自约1至50的范围内，优选地在约1，2，3，4，或5至10的范围内，并且其中单个组分[S-P2-S]和[S-(AA)x-S]以任意顺序存在于分式{[S-P2-S] a [S-(AA)x-S] J 中。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合载体分子，其中组分P2是选自下列的阳离子或聚阳离子肽鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多肽， 聚精氨酸，细胞穿透肽(CPI3S),嵌合CPI3S, Transportan，或MPG肽，HIV-结合肽，Tat， HIV-ITat (HIV)，Tat-衍生肽，寡聚精氨酸，穿透肽家族成员，穿透肽，触角足-衍生肽(特别是来自 Drosophila antennapedia)，pAntp, plsl 等，抗微生物-衍生的 CPPs，Buforin-2, Bac715-24，SynB, SynB(I)，pVEC，hCT-衍生肽，SAP, MAP, KALA, PpTG20,富含脯氨酸的肽， Loligomere，富含精氨酸的肽，降钙素-肽，FGF，乳铁蛋白，组蛋白，VP22衍生的或类似物肽，HSV, VP22(单纯疱疹)，MAP, KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620,富含脯氨酸的肽， 富含赖氨酸的肽，Pep-1, L-寡聚物，降钙素肽。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的聚合载体分子，其中组分P2的-SH-结构部分由半胱氨酸提供。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的聚合载体分子，其中组分P2选自包含式(IIb)的阳离子肽的肽Cys{(Arg)χ ；(Lys)m；(His)n；(Orn)0 ；(Xaa) J Cys,其中1+m+n+o+x = 8-15，且 1，m，η 或 ο 彼此独立地可以是选自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10， 11，12，13，14或15的任意数字，条件是Arg，LyS，His和Orn的总含量占寡肽所有氨基酸的至少10% ；并且Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn外的天然或非天然氨基酸的任意氨基酸；并且χ可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14的任意数字，条件是fcia 的总含量不超过所述寡肽所有氨基酸的90%。
9.聚合载体货物复合物，其由根据权利要求1-8中任一项所述的聚合载体分子与核酸形成。
10.根据权利要求9所述的聚合载体货物复合物，其中所述核酸以约5至10000个本发明的聚合载体分子核酸的摩尔比率提供。
11.根据权利要求9或10所述的聚合载体货物复合物，其中所述核酸是DNA或RNA，编码核酸，编码DNA，编码RNA，编码mRNA，siRNA,免疫刺激性核酸，免疫刺激性CpG核酸，或免疫刺激性RNA(isRNA)。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的聚合载体货物复合物，其中所述核酸编码治疗活性蛋白或肽，抗原，包括肿瘤抗原，致病性抗原，动物抗原，病毒抗原，原生动物抗原，细菌抗原，变应性抗原，自体免疫抗原，变应原，抗体，免疫刺激性蛋白或肽，或抗原特异性T-细胞受体。
13.制备权利要求1-8中任一项所定义的聚合载体分子的方法，所述方法包括下述步骤a)提供至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽作为本文定义的组分P2和/或至少一种阳离子或聚阳离子聚合物作为权利要求1-8中任一项所定义的组分P2，和任选地至少一种其它组分(AA) x，将这些组分混合，优选在碱性环境中混合，优选在存在氧或导致轻度氧化条件的其它起始剂的条件下混合，并且由此缩合，并且因此以聚合缩合或缩聚通过二硫键将这些组分彼此聚合在一起，从而获得重复组分H- [S-P2-S] n_H或H {[S-P2-S] a [S- (AA) X_S] JH;b)提供如权利要求1-8中任一项定义的亲水性聚合物P1和/或P3，其任选地用如权利要求1-8中任一项定义的配体L和/或氨基酸组分(AA)x修饰；c)将根据步骤b)所述的亲水性聚合物P1和/或P3与根据步骤a)获得的重复组分 H-[S-P2-S]n-H或H{[S-P2-S]a[S-(AA)x-S]b}H以约2 1的比率混合，并且由此典型地终止聚合缩合或缩聚反应，并且获得根据式(I)或(Ia)的本发明的聚合载体分子；d)任选地纯化根据步骤c)获得的聚合载体分子；e)任选地，将本文定义的核酸添加到根据步骤c)或d)获得的聚合载体中，并且将所述核酸与根据步骤c)或d)获得的聚合载体复合，从而获得如权利要求9-12中任一项所定义的聚合载体货物复合物。
14.药物组合物或疫苗，其包含权利要求9-12中任一项所述的聚合载体货物复合物和任选的药用载体和/或赋形剂。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的聚合载体分子、或根据权利要求9-12中任一项所述的聚合载体货物复合物，其用作药物。
16.携带如权利要求9-12中任一项所定义的核酸的权利要求1-8中任一项所述的聚合载体分子，或权利要求9-12中任一项所述的聚合载体货物复合物，其用于预防、治疗和/或改善选自下列的疾病癌症或肿瘤疾病，传染病，优选(病毒、细菌或原生动物学)传染病， 自体免疫病，变态反应或变应性疾病，单基因病，即(遗传性)疾病，或一般的遗传病，具有基因遗传背景和典型地由确定的基因缺陷引起并且按照孟德尔法则遗传的疾病，心血管疾病，神经元疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病，皮肤疾病，肌骨骼病症，结缔组织病症，瘤， 免疫缺陷，内分泌、营养和代谢疾病，眼病和耳病。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的新型聚合载体分子及其变化形式，其允许在体内和体外将核酸有效地转染到细胞中，涉及由核酸和所述新型聚合载体分子形成的聚合载体货物复合物，还涉及制备所述新型聚合载体分子和所述新型聚合载体货物复合物的方法。本发明还提供所述新型聚合载体分子和新型聚合载体货物复合物作为用于治疗各种疾病的药物和在制备用于治疗此类疾病的药物组合物中的应用方法和用途。
文档编号A61P43/00GK102573919SQ201080039095
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者帕特里克·鲍姆霍夫, 托马斯·施拉克 申请人:库瑞瓦格有限责任公司