族人群中的群体频率均在0.2W上，在中国主要民族中具有普 适性。
[0017 ]所述的富集引物混合物包含6对DNA引物，运6对DNA引物的核巧酸序列信息分别如 表2中沈Q ID NO: 1-12所示：
[0018] 表2富集引物序列
[0019]
[0020]进一步的，上述富集引物浓度的设定原则为:(1)富集引物混合物中各个引物的储 存浓度为具体工作浓度的10倍;间在工作浓度下，复合扩增时使得每一个目的片段都能被 完整扩增出；间在工作浓度下，复合扩增时使得每一个目的片段的产量在20~SOngAiL (4) 在工作浓度下，复合扩增时不能出现非特扩增条带。
[0021 ]上述6对富集引物优选的工作浓度如表3所示：
[0022] 表3富集引物的优选工作浓度
[0023]
[0024] 所述的单碱基延伸引物混合物包含上述21个线粒体SNP遗传标记的共计21条单碱 基延伸引物，运21条单碱基延伸引物的核巧酸序列分别如表4中SEQ ID NO:13-34所示：
[00巧]表4单碱基延伸引物序列 [0026]
[0027]
[0028] 进一步的，上述单碱基延伸引物浓度的设定原则为：(1)单碱基延伸引物混合物中 各个引物的储存浓度为具体工作浓度的10倍;间在工作浓度下，复合延伸时使得最终检测 结果的峰高在1000~7000之间；间在工作浓度下，复合扩延伸时不能出现非特异峰。
[0029] 上述21条单碱基延伸引物的优选的工作浓度如表5所示：
[0030] 表5单碱基延伸引物的优选工作浓度
[0031]
[0032] ~所述的阳性对照作为每次实验的质量控制，用于监控PCR扩增体系的正确性，排除I 假阴性；阴性对照用于控制配制体系过程的污染情况，排除假阳性。
[0033] 本发明要解决的另一个问题是提供利用上述试剂盒进行个体识别检测的使用方 法，所述的使用方法包括w下步骤：
[0034] (11.线粒体DNA提取:从待测生物检材中提取线粒体DNA;
[0035] 间.复合扩增反应:取步骤(1)所得的线粒体DNA作为复合扩增模版，加入富集引物 混合物和扩增试剂，进行单管内复合扩增反应，PCR扩增程序为:94°C预变性5min，94°C变性 15s，55°C退火5s，72°C延伸10s，共30个循环，最后72°C延伸2min，获得复合扩增产物；
[0036] 间.复合扩增产物纯化:用核酸纯化柱纯化步骤间所得的复合扩增产物；
[0037] (4).单碱基延伸反应:取步骤间所得的纯化后的复合扩增产物，加入单碱基延伸引 物混合物和挪aPshot反应混合液，进行单管内单碱基延伸反应，单碱基延伸反应程序为:96 °C 10s，50°C5s，60°C30s，共20个循环，获得单碱基延伸产物；
[003引间.电泳：取步骤(4)所得的单碱基延伸产物，加入化-D巧酷胺、GeneScan?Size Standards-120LIZ，混合均匀后，于95°C变性3min，4°C迅速冷却后进行巧光电泳检测和基 因型分析。
[0039] 所述的使用方法步骤(1)中生物检材的类型可W是包含DNA的血液、精斑、唾液、牙 齿、骨骼、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞W及屯、脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、膜腺、脑、肠和胆等 器官。
[0040] 所述的使用方法步骤(1)中所述的提取线粒体DNA的方法可W采用磁珠法、Chelex- 100提取法、酪-氯仿提取法或娃膜法等。
[0041] 所述的使用方法步骤(4)中所述的纯化后的复合扩增产物的加入量为1~5ng;优选 为0.5~4ng;进一步优选为0.5~化g;再一步优选为0.5~化邑。
[0042] 所述的使用方法步骤(4)中SNaPshot反应混合液的加入量为1~1.化L，优选为化L。
[0043] 所述的使用方法步骤(4)中单碱基延伸反应的总体积为化L。
[0044] 本发明的有益效果：
[0045] 本发明提供的试剂盒适用于中国主要人群的SNP检测，采用的SNP位点数量少，采 用的引物数量总计仅为33条，明显少于传统检测系统，降低了试剂盒的成本，间接降低了实 际检测成本。
[0046] 本发明提供的试剂盒，利用核酸纯化柱替代传统的核酸外切酶和邮碱性憐酸酶对 复合扩增产物进行纯化，将此步骤的操作时间由1.化左右缩短至5min左右;并且避免了引 入核酸外切酶和邮碱性憐酸酶，从而避免了由于运两种酶灭火不完全对后续检测结果的影 响。在对190例不同来源或类型的生物检材样本进行的检测中，利用核酸外切酶和邮碱性憐 酸酶对复合扩增产物进行纯化的试剂盒出现24例检测结果不准确;而利用本发明提供的试 剂盒进行检测，对190例生物检材均获得正确检测结果。
[0047] 本发明提供的试剂盒，采用单管内复合扩增，复合扩增技术可W在一个反应体系 中一次性地扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学鉴 定的实际需要。复合扩增中，引物的设计是该技术的关键和难点。本发明提供的6对富集引 物，用于复合扩增时引物之间的竞争小，不会出现某条扩增条带的丢失，也就是能够扩增出 包含所有21个SNP位点在内的DNA片段，并且扩增出的片段使用核酸纯化柱回收效率高，能 够达到95%的回收率。本发明提供的21条单碱基延伸引物在复合扩增时引物之间的竞争 小，能够扩增出全部21个SNP位点。本发明实现了21个SNP位点在同一管进行复合扩增与单 碱基延伸，即通过一管反应，即可获得准确的检测结果，简化了检测步骤并且降低了检测成 本。
[0048] 本发明提供的试剂盒，在复合扩增中，利用快速taq聚合酶替代普通Taq酶并采用 快速PCR程序，所提供的6对富集引物，在快速PCR中能够成功扩增出包含所有21个SNP位点 在内的DNA片段;并且使得复合扩增步骤的用时由120min左右缩短到30min左右。本发明提 供的试剂盒，在复合扩增的循环数缩短至30时，仍能获得正确检测结果，大大缩短了检测用 时。
[0049] 本发明提供的试剂盒将Snapshot反应液的用量减少至1~1.扣L，将Snapshot反应 体系的总体积降低至化L。不仅大大减少了Snapshot反应液的用量，降了低检测成本；同时 降低了 Snapshot反应液中的成分对后续巧光电泳检测的影响，并且意想不到地使得单碱基 延伸产物不需要经过邮碱性憐酸酶的处理就可直接进行巧光电泳检测，检测结果不受影 响，仍能获得正确的检测结果。采用已公开的利用Snapshot法建立起的线粒体SNP检测试剂 盒或系统对190例不同来源或类型的生物检材样本进行的检测中，如果不对单碱基延伸产 物进行邮碱性憐酸酶处理，直接进行检测，仅有91例能够获得正确的检测结果;而利用本发 明提供的试剂盒对同样的生物检材进行检测时，不对单碱基延伸产物进行邮碱性憐酸酶处 理，对190例检材均能获得完全正确的检测结果。
[0050] 本发明提供的试剂盒可W使用的生物检材类型多，可W是包含DNA的血液、精斑、 唾液、牙齿、骨骼、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞W及屯、脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、膜腺、脑、 肠、胆等器官。
[0051] 本发明提供的试剂盒，对低至〇.25pg的模板量仍能够获得正确的检测结果;对于 一些DNA提取量相对较少的检材，如毛发和牙齿等可W获得准确的检测结果。
[0052] 本发明提供的试剂盒，在进行SNP位点检测时具有严格的种属特异性和组织同一 性，在对分别来源于10个不同个体的190种类型的检材进行的检测中，同一个体来源的不同 类型的检材的检测结果完全一致。
[0053] 综上所述，利用本发明提供的基于线粒体SNP位点的法医学快速检测试剂盒进行 个体识别，相较于传统的检测试剂盒，成本低廉、操作简单、灵敏度高、检测结果准确、适用 性广，能够在1.5~2小时，通过单管反应即可获得检测结果，对人类生物检材进行个体识 另IJ，为案件破获争取宝贵时间，可W应用到大规模的案件排查、个体识别W及尸源认定中。
【附图说明】
[0054] 图1为使用