用于分离原代肝细胞的联合用试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物技术领域，具体涉及用于分离原代肝细胞的联合用试剂。
【背景技术】
[0002] 肝脏作为机体重要的代谢器官，在多种生理病理过程中发挥重要作用。肝细胞行 使了肝脏主要的功能，如清除毒素、参与生物合成和生物转化、代谢多种营养物质、储存葡 萄糖、分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等。机体内分离得到的原代肝细胞被应用于药 理毒理学、免疫学、细胞生物学等体外研宄，随着生物人工肝在治疗肝衰竭领域的应用，也 需要大量、高活性的原代肝细胞作为生物材料。因此，如何分离制备得到高产量、高纯度、高 存活率的原代肝细胞受到研宄者的广泛关注。
[0003]自1976年Seglen首次采用两步原位灌流法成功分离大鼠肝细胞以来，两步原位 灌流法被证明对分离多种动物肝细胞均有效，成为目前原代肝细胞分离制备的经典方法。 众多研宄者在该法的基础上，对肝细胞分离方法以及灌流液进行了改良，在一定程度上提 高了肝细胞的总量和活率，但还是不能满足实际应用的需要。
[0004] 例如：公开号为CN1632107A，发明名称为"生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方 法"的专利，报道了两种分离肝细胞的方法，一种是用四种试剂四步灌流，一种是用两种 试剂两步灌流，采用四步灌流时，获得的肝细胞活率和肝细胞总数较高，分别为90-99% 和6. 25 X 107个/克肝组织，但纯度较低，仅为90-95 %，且灌流用试剂多，成本高；而两步 灌流虽然用的试剂少，但是肝细胞活率、肝细胞总数和纯度均不理想，分别仅为80-90%、 1. 25 X 107个/克肝组织和80-90 %。
[0005] Zhang ZG etal.,An updated method for the isolation and culture of primary calf hepatocytes，Vet J，2012, 191:323-326 公开了用三种试剂三步灌流分离 肝细胞的方法，但是获得的肝细胞的总数、活率均较低，分别为1. 12X107个/克肝组织、 85. 7%〇
[0006] 因此，急需对原代肝细胞的分离用试剂进一步改进，以制备高产量、高纯度、高存 活率的原代肝细胞。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供用于高效分离原代肝细胞的联合用试剂。
[0008] 本发明提供了用于原代肝细胞分离的联合用试剂，它包括灌流液I、灌流液II、灌 流液III，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 2-2. 6克 HEPES，3. 5-4. 5 克 NAC, 0. 9-1. 1 克 EGTA,其余为去离子水；
[0009] 所述灌流液II每升含有如下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 2-2. 6克 HEPES，其余为去离子水；
[0010]所述灌流液III每升含有如下成分：3. 8-4克氯化钠，0.5克氯化钾，23-25克 HEPES，0. 07克二水氯化钙，3. 5-4. 5克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子 水。
[0011] HEPES :4_羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0012] NAC:N_acetylcysteine,N-乙酰基-L-半胱氨酸。
[0013] EGTA :乙二醇二乙醚二胺四乙酸。
[0014] WUnsch单位：是胶原酶专用的活性单位。
[0015] 进一步地，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 4克 HEPES，3. 5-4. 5 克 NAC, 0. 9-1. 1 克 EGTA,其余为去离子水；
[0016] 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2.4克HEPES，其余为 去离子水；
[0017] 灌流液III每升含有如下成分：3. 9克氯化钠，0. 5克氯化钾，24克HEPES，0. 07克 二水氯化钙，4克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水。
[0018] 更进一步地，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2.4 克HEPES，4克NAC，0. 95克EGTA，其余为去离子水；
[0019] 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2.4克HEPES，其余为 去离子水；
[0020] 灌流液III每升含有如下成分：3. 9克氯化钠，0. 5克氯化钾，24克HEPES，0. 07克 二水氯化妈，4克白蛋白，216WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水。
[0021] 其中，所述灌流液III中，胶原酶为胶原酶SERVA NB8或者胶原酶Roche Liberase?。
[0022] 本发明提供的用于原代肝细胞分离的联合用试剂，它还包括肝细胞洗涤液，所述 肝细胞洗涤液每升含有如下成分：9. 3-10. 8克Williams' Medium E粉末，2. 2克碳酸氢钠， 2. 4-2. 8克HEPES，0. 1克链霉素，100000单位青霉素，其余为去离子水。
[0023] 进一步地，所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成分：9. 3-10. 8克 Williams'Medium E粉末，2. 2克碳酸氢钠，2. 6克HEPES，0? 1克链霉素，100000单位青霉素， 其余为去离子水。
[0024] 更进一步地，所述肝细胞洗绦液每升中含有如下成分：9. 5克Williams'MediumE 粉末，2. 2克碳酸氢钠，2. 6克HEPES，0. 1克链霉素，100000单位青霉素，其余为去离子水。
[0025] 本发明提供了上述联合用试剂的制备方法，步骤如下：
[0026] 称取灌流液I的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 4,得灌流液I ;
[0027] 称取灌流液II的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 4,得灌流液II ;
[0028] 称取灌流液III的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 6,得灌流液III。
[0029] 本发明提供的用于原代肝细胞分离的联合用试剂制备方法，在包括肝细胞洗涤液 时，步骤如下：
[0030] 称取灌流液I的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 4,得灌流液I ;
[0031] 称取灌流液II的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 4,得灌流液II ;
[0032] 称取灌流液III的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 6,得灌流液III ;
[0033] 称取肝细胞洗涤液的各组分，混匀溶解后，pH调节至7. 3,得肝细胞洗涤液。
[0034] 本发明还提供了上述联合用试剂在原代肝细胞分离中的用途。
[0035] 本发明的联合用试剂不仅可以用于猪肝脏，而且可以适用于各种与大型动物的肝 脏，如人、猪、狗、牛的肝脏，具有应用的广泛性。
[0036] 本发明联合用试剂，可以有效分离原代肝细胞，分离得到的肝细胞的数量多、活率 与纯度高，为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型 提供潜在的肝细胞资源，临床应用前景优良。
[0037] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0038] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0039] 本发明所用的实验仪器与试剂如下：
[0040] 纯水机（Millipore,德国）；电子分析天平（Sartorius，德国）；懦动泵 (MasterRex L/S，美国）；奥林巴斯生物显微镜（BHS型，日本）；二氧化碳细胞培养箱（SANYO MC0-17AI，日本）；超净工作台（NUAIRE-600E，美国）；颗粒计数仪（Multisizer 3 Beckman Coulter counter，德国）。
[0041] 氯胺酮、甲苯噻嘆、肝素钠注射液购自成都科伦制药；EGTA、Williams'Medium E 培养基粉末（简称 Williams'Medium E 粉末）、Pen_Strep100 X (Penicillin 10, 000U/ ml，Streptomycin 10, OOOug/ml)、NAC、台盼蓝细胞活性染色试剂、白蛋白购自美国 Sigma-Aldrich公司；胶原酶Liberase?购自Roche公司；胶原酶NB8购自德国SERVA公 司。
[0042] 实施例1本发明联合用试剂的制备
[0043]联合用试剂包括灌流液I、灌流液II、灌流液III、肝细胞洗涤液，制备方法如下：
[0044] 1.灌流液I:以配制1升试剂为例：
[0045] (1)取如下成分：氯化钠8. 3克、氯化钾0?5克、HEPES 2. 4克、NAC4克、EGTA0?95 克；
[0046] (2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至 1L，调节pH至7. 4,用0. 2微米滤膜过滤除菌，常温保存即可。使用时，预热至37°C。
[0047]2.灌流液II:以配制1升试剂为例：
[0048] (1)取如下成分：氯化钠8. 3克、氯化钾0?5克、HEPES 2. 4克；
[0049] (2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至 1L，调节pH至7. 4,用0. 2微米滤膜过滤除菌，常温保存即可。使用时，预热至37°C。
[0050]3.灌流液III:以配制1升试剂为例：
[0051] (1)取如下成分：氯化钠3. 9克、氯化钾0. 5克、HEPES24克、二水氯化钙 (CaCl2?2H20)0. 07克、白蛋白4克、胶原酶SERVANB8(lmg酶里面是1. 08个WUnsch单 位）200毫克（即216WUnsch单位）；
[0052] (2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至 1L，调节pH至7. 6,用0. 2微米滤膜过滤除菌，使用前15分钟配置，使用时，预热至37°C。
[0053] 4.肝细胞洗涤液：以配制1升试剂为例：
[0054] (1)取如下成分：Williams'Medium E 粉末 9. 5 克、碳酸氢钠 2. 2 克、HEPES 2. 6 克、 链霉素0. 1克、青霉素100000单位；
[0055] (2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至 1L，调节pH至7. 3,用0. 2微米滤膜过滤除菌，4°C保存和使用。
[0056] 实施例2本发明联合用试剂的制备
[0057] 联合用试剂包括灌流液I、灌流液II、灌流液III、肝细胞洗涤液，制备方法如下：
[0058] 1.灌流液I :以配制1升试剂为例：
[0059] (1)取如下成分：氯化钠8. 1克、氯化钾0. 5克、HEPES 2. 6克、NAC 4. 5克、EGTA 1. 1 克；
[0060] (2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，