一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞分离方法，尤其是一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，通过插管固定、灌注消化、细胞分散、小鼠肝星状细胞分离等步骤完成对小鼠肝星状细胞的分离。用上述方法得到了需要的小鼠肝星状细胞，质量很好，比传统大鼠的分离质量好很多，而且在整个过程比较便捷，在普通实验室就能完成，很稳定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的设备，降低了这种分离方法的成本，在得到高质量的小鼠肝星状细胞，为进一步深入研究小鼠肝星状细胞的生物学行为创造了条件。
【专利说明】一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞分离方法，尤其是一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法。
【背景技术】
[0002]肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型，激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
[0003]通常在通过大鼠的肝脏分离得到，但是这种方法成本很高，需要特殊的仪器，而且分离的质量一般，通过小鼠肝脏分离是比较理想的方法，但是目前没有一种小鼠肝星状细胞分离的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种分离质量高的小鼠肝星状细胞的改良分离方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:第一步:选取雄性BALB/c小鼠，体质量25~30g，普通饲料喂养，自由进食进饮，对其操作前禁食12h ；
[0006]第二步:将选取的小鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作台中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，将肠管推于左侧，充分暴露门静脉、下腔静脉、上腔静脉，在下腔`静脉、上腔静脉各预置I号缝线I根，暂不结扎，楔形剪开下腔静脉，插管，结扎固定，同时结扎上腔静脉，剪开门静脉；
[0007]第三步:采用37°C预热的D-HanK’ s液对门静脉进行灌注，速度为5~7mL/min，灌注7min后，观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后，开始灌注37°C预热含胶原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度为3~5mL/min，直至肝脏变软、变脆，压之凹陷不易恢复时，结束灌注；
[0008]第四步:取肝脏置于消毒平皿内，去除肝包膜、血管等纤维结缔组织，去除胆囊，充分细致剪碎肝组织，加入HBSS液20mL，于37°C进行震荡消化25min得到细胞悬液；
[0009]第五步:细胞悬液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL终止消化，经200目滤网过滤进入50mL聚丙烯离心管中，30Xg离心5min,取上清液,上清液450Xg离心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15 %的optiprep,充分混匀，在混合液上面加6mL的11.5 %的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, 1400Xg, 4?离心18min后，吸取界面层细胞。
[0010]上述方法中，第五步吸取界面层细胞，就得到了需要的小鼠肝星状细胞，利用这种方法得到的小鼠肝星状细胞质量很好，比传统大鼠的分离质量好很多，而且在整个过程比较便捷，在普通实验室就能完成，很稳定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的设备，降低了这种分离方法的成本，在得到高质量的小鼠肝星状细胞，为进一步深入研究小鼠肝星状细胞的生物学行为创造了条件。
【具体实施方式】
[0011]第一步:选取雄性BALB/c小鼠，体质量25~30g，普通饲料喂养，自由进食进饮，在操作前禁食12h。
[0012]
[0013]第二步:将小鼠用3%戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作台中，75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，将肠管推于左侧，充分暴露门静脉、下腔静脉、上腔静脉，在下腔静脉、上腔静脉各预置I号缝线I根，暂不结扎，楔形剪开下腔静脉，插管，结扎固定，同时结扎上腔静脉，剪开门静脉。
[0014]第三步:采用37°C预热的D-HanK’ s液对门静脉进行灌注，速度为6mL/min，灌注7min后，观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’ s液中无肉眼可见血液后，开始灌注37°C预热含胶原蛋白酶的HBSS溶液(0.3mg/mL的IV型胶原酶)，lOmin，速度为4mL/min，直至肝脏变软、变脆，压之凹陷不易恢复时，结束灌注。
[0015]第四步:剪断肝周韧带，取肝脏置于消毒平皿内，去除肝包膜、血管等纤维结缔组织，去除胆囊，充分细致剪碎肝组织，加入已配制好的HBSS液20mL (0.3mg/mL的IV型胶原酶、2 μ g/mDNA酶)，于37°C进行震荡消化25min得到细胞悬液。
[0016]第五步:细胞悬液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL终止消化，经200目滤网过滤后进入50mL聚丙烯离心管中，30Xg离心5min,弃沉淀,取上清液,450Xg离心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15% optiprep,充分混匀，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, HOOXgdO离心18min,吸取界面层细胞。
`[0017]取得小鼠肝星状细胞后可以加入5mL的GBSS悬浮后，450Xg，8min离心清洗后去上清，沉淀中加入DMEM培养液(含20% FBS及双抗)重悬，活细胞鉴定后，种瓶培养。
[0018]可以进一步活细胞鉴定、性质鉴定、原代培养等细胞研究。
【权利要求】
1.一种小鼠肝星状细胞的改良分离方法，其方法如下: 第一步:选取雄性BALB/c小鼠，体质量25~30g，普通饲料喂养，自由进食进饮，对其操作前禁食12h ； 第二步:将选取的小鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作台中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，将肠管推于左侧，充分暴露门静脉、下腔静脉、上腔静脉，在下腔静脉、上腔静脉各预置I号缝线I根，暂不结扎，楔形剪开下腔静脉，插管，结扎固定，同时结扎上腔静脉，剪开门静脉； 第三步:采用37°C预热的D-HanK’ s液对门静脉进行灌注，速度为5~7mL/min，灌注7min后，观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’ s液中无肉眼可见血液后，开始灌注37°C预热含胶原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度为3~5mL/min，直至肝脏变软、变脆，压之凹陷不易恢复时，结束灌注； 第四步:取肝脏置于消毒平皿内，去除肝包膜、血管等纤维结缔组织，去除胆囊，充分细致剪碎肝组织，加入HBSS液20mL，于37°C进行震荡消化25min得到细胞悬液； 第五步:细胞悬液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL终止消化，经200目滤网过滤进入50mL聚丙烯离心管中，30Xg离心5min,取上清液,上清液450Xg离心7min,去上清,取沉淀，加入6mL的15%的optiprep,充分混匀，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS，1400Xg，4°C离心18min后，吸取界面层细胞。
【文档编号】C12N5/071GK103805553SQ201210455728
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】俞富祥 申请人:温州医学院附属第一医院