专利名称：一种大鼠肝细胞分离培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法。
背景技术：
肝细胞在医学相关领域得到极为广泛的应用，长期以来，国内外众多学者对肝细胞分离 方法、培养条件进行了大量的研究，但要获得高活率、功能好的肝细胞，至今仍较困难。早 期主要用非酶法分离肝细胞，包括机械法(如匀浆法)及螯合法。但机械法对肝细胞损伤大， 细胞活率低；螯合法是用可结合Ca2+、 Mg^的螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞，但 螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括 胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法等。现在广泛使用的是两步原位灌流法，这是目前国际上流 行的肝细胞分离方法。先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离子，再换含 蛋白水解酶的溶液至组织软化。此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多， 活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。但该方法使用的胶原酶及灌流装置的价格昂贵，操 作环节多，技术要求高，所需时间长，易污染，限制了该方法在一般实验室的应用。
发明内容
本发明的目的再于针对现有肝细胞分离培养方法的不足，提供一种能够快速有效分离高 细胞活力的肝细胞，并提供合适的培养方法。
本发明所说的大鼠肝细胞分离培养方法，其步骤是
(1) 大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，用连接于输液器的留置针做门静脉插 管；
(2) 用D-Hank' s液开放灌流后，用含0.18%胰酶的D-Hank' s液继续灌流；待停止灌流 后取出肝脏，用含双抗的PBS清洗肝脏；
(3) 用含双抗、lXBSA的Hank's液终止消化反应，收集肝细胞悬液并用筛网过滤，离 心，弃上清，在沉淀中再加入r^BSA的Hank's液重悬，离心，弃上清；
(4)收集沉淀于Leibovitz，s-15 (L-15)完全培养基中，调整肝细胞密度为3 6X 105个 /ml接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37t:、 5%<:02环境中培养；4h细胞贴壁后换用L-15 完全培养基去除死亡及未贴壁细胞，再培养20h后细胞贴壁后变平变薄，双核细胞呈岛状连 接，形态良好。
上述方法中所说的Leibovitz's-15完全培养基，是在L-15培养基中加入青霉素100kU/L、链霉素100mg/L、胎牛血清10%、胰岛素0.8pM、地塞米松0.5pM配成的完全培养基，培养 基的pH为7.6。
相对于现有技术来说，本发明的分离培养方法中，使用输液器、动静脉留置针替代经典 的肝细胞原代分离培养中使用的灌流装置；选用胰酶代替胶原酶进行灌注；用含1XBSA的 Hank' s液终止胰酶消化反应(而不应是含血清的终止液)；选用Leibovitz's-15 (L-15)培养 基，在L"15培养基中加入青霉素U00kU/L)、链霉素(100mg/L)、胎牛血清(10%)、胰岛 素(0.8pM)、地塞米松(0.5pM)配成完全培养基方法；使用经过尾胶原处理过的培养板接 种肝细胞，细胞贴壁效果更好。因此本发明建立的大鼠原代肝细胞培养椟型简便易行、价格 低廉，且分离的肝细胞数量多，纯度高，接种后2 4h内即可呈单层紧密排列贴壁生长，并 在一定的体外培养条件下仍保留许多体内的细胞功能和活性，可用于药理及毒理试验并可在 一般实验室推广。
图l刚分离的大鼠肝细胞，ioox 图2培养24h的大鼠肝细胞，100X 图3台盼兰染色的肝细胞，100X 图4PAS染色的肝细胞，100 X
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理
解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本发明中所使用的百分浓度，除特别说明外，均指质量百分浓度。 实施例
取禁食24h的SD大鼠以2X戊巴比妥钠(40mg/kg.b.w)腹腔注射麻醉，腹腔注射肝素 钠抗凝，固定于固定板上，腹部皮肤消毒，打开腹腔，分离并结扎门静脉和下腔静脉的远心 端及上腔静脉，用连接于输液器的留置针从门静脉插管，剪开下腔静脉近心端，结扎上腔静 脉，用37'C D-Hank's液以流速为25ml/min开放灌流约10min，待肝脏变为土黄色后，改用 37'C、含0.18%胰酶的D-Hank' s液以流速为25ml/min继续灌流10min (灌流过程中保持灌 流液的温度为37'C)。停止灌流取出肝脏，用含双抗(青霉素100kU/L、链霉素100mg/L)的 PBS清洗3次，含双抗、1 %BSA的Hank's液终止消化反应，去除肝包膜及血管等纤维结缔
4组织，收集肝细胞悬液，100目、200目的筛网过滤肝细胞悬液，700r/min离心5min，去除 上清液，在沉淀中加入BSA液重悬，500r/min离心5min，去上清，沉淀中加入L-15完全培 养基，500r/min离心5min。用L-15完全培养基调整肝细胞悬液的密度为3 6Xl()S个/ml， 接种于预先铺有尾胶原的培养板，37°C、 5%(^02条件下培养。4h细胞贴壁后换液，去除死亡 及未贴壁细胞，再培养20h后细胞变平变薄，双核细胞呈岛状连接，形态良好，可用于实验。 细胞分离后用倒置显微镜对分离纯化和接种的肝细胞进行形态学观察并计算细胞产量，并用 过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定肝细胞。
结果细胞分离后置于倒置显微镜下观察，低倍镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透光 度好，胞核清晰(图l)。培养24h后可见细胞拉平变薄，体积增大，多呈双核细胞，部分细 胞呈多边形展开，有些细胞开始呈岛状连接(图2)。平均每只大鼠肝获得2X1()S个肝细胞。 用新分离的肝细胞做台盼兰排斥试验，结果显示细胞活率大于90% (图3)， PAS染色后，高 倍镜下观察到新分离的肝细胞内由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色(图4)。
权利要求
1、一种大鼠肝细胞分离培养的方法，其步骤是(1)大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，用连接于输液器的留置针做门静脉插管；(2)用D-Hank’s液开放灌流后，用含0.18％胰酶的D-Hank’s液继续灌流；待停止灌流后取出肝脏，用含双抗的PBS清洗肝脏；(3)用含双抗、1％BSA的Hank’s液终止消化反应，收集肝细胞悬液并用筛网过滤，离心，弃上清，在沉淀中再加入1％BSA的Hank’s液重悬，离心，弃上清；(4)收集沉淀于Leibovitz’s-15完全培养基中，调整肝细胞密度为3～6×105个/ml接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5％CO2环境中培养；4h细胞贴壁后换用Leibovitz’s-15完全培养基去除死亡及未贴壁细胞，再培养20h后细胞贴壁后变平变薄，双核细胞呈岛状连接，形态良好。
2、 根据权利要求1所说的大鼠肝细胞分离培养的方法，其特征在于，其中所说的 Leibovitz's-15完全培养基，是在Leibovitz，s-15培养基中加入青霉素100kU/L、链霉素100mg/L、 胎牛血清10%、胰岛素0.8pM、地塞米松0.5nM配成的完全培养基，培养基的pH为7.6。
全文摘要
本发明提供了一种大鼠肝细胞分离培养的方法。大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，做门静脉插管，两步灌流法灌流，取下消化成熟肝脏，收集肝细胞于4℃含1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks液中，肝细胞悬液用筛网过滤，滤液离心、沉淀后，收集沉淀于Leibovitz’s-15(L-15)完全培养基中，调整肝细胞密度为3～6×10<sup>5</sup>个/ml接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5％CO<sub>2</sub>环境中培养。接种后4h换液去除未贴壁及死细胞，继续培养20h后可用于试验。本方法简便易行、价格低廉，稳定、高效，获得的肝细胞活力高，易贴壁，可用于药理及毒理试验并在一般实验室推广。
文档编号C12N5/06GK101538552SQ20091003102
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者刘学忠, 刘宗平, 卞建春, 汪纪仓, 燕 袁, 裔传卉 申请人:扬州大学