一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌发酵产过氧化氢酶的方法

专利名称：一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌发酵产过氧化氢酶的方法
技术领域：
一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌(5a"7/w sp.)WSHDZ-Ol发 酵产过氧化氢酶的方法。通过研究乙醇和过氧化氢对万""7/ws sp.WSHDZ-Ol产 酶的胁迫影响，达到过氧化氢酶高产的目的。属于微生物发酵产酶技术领域。
背景技术：
过氧化氢酶(Catalase，简称CAT)，是生物演化过程中建立起来的生物防御 系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢的分解，防止过氧化。 目前市售的过氧化氢酶来源有3个通过动物肝脏提取纯化而得，由黑曲霉在通 风搅拌等控制下培养而得，由小球菌经深层发酵提取精制而得。在国内，发酵法 提取过氧化氢酶仅处于实验室研究阶段，尚无工业化生产。本研究室在前期研 究中筛选得到一株枯草芽孢杆菌WSHDZ-Ol，所产的过氧化氢酶，具有耐碱、发 酵周期短、过氧化氢酶产量高等优点。 一定浓度的乙醇和/或11202的添加胁迫 5a"〃ws sp.WSHDZ國01产CAT。

发明内容
本发明的目的是提供一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌 5acz7/w sp.WSHDZ-Ol发酵产过氧化氢酶的方法。利用万acz'〃us sp.WSHDZ-Ol 发酵生产CAT，在发酵过程中添加适量的乙醇和/或过氧化氢胁迫菌体产酶，达 到高效合成CAT的目的。
本发明的技术方案 一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌^^z7/"s sp.WSHDZ-Ol发酵产过氧化氢酶的方法，利用Bacz'〃ws sp.WSHDZ-Ol为生产菌 株，通过在培养基中添加乙醇和过氧化氢，胁迫菌体产过氧化氢酶；添加方式 为
在发酵开始后0h、 12h、 36h分批添加培养基中体积浓度达1.0。/。的乙醇， 总酶活达15000 U'mU1; 3L罐上采取不同的乙醇添加策略使CAT酶活大幅提高 分阶段恒速流加体积浓度5%的乙醇，滴加速度为0-12h以4.13mL/h， 12-36h以 10.05mL/h， 36h至发酵结束以11.42mL/h滴加;或0 h、 12 h、 36 h分批添加培 养基中体积浓度达1.0 %的乙醇；或0 h—次性添加培养基中体积浓度达1.0 % 的乙醇；CAT最高酶活分别达28000 U'mL-1， 25000 U'mL-1和22000 UthL"。
或在发酵开始后12h在培养基中添加培养基中体积浓度达0.3 %的1^202，总 酶活达9200 U'mL"; 3 L罐上在发酵开始后12 h —次性添加培养基中体积浓度 达0.3%的11202，酶活可达21600 UtiiL"，或12h、 24 h分批添加培养基中体积浓度达0.15 %的H202，总酶活达23000 U'mL—、
或在3L罐上分阶段恒速流加体积浓度5。/。的乙醇，滴加速度为0-12h以 4.13mL/h， 12-36h以10.05mL/h,36h至发酵结束以11.42mL/h滴加和同时在12h、 16h、 20h、 24h、 2811分批添加培养基中体积浓度达0.06%的11202;总酶活达 19000 U.ml/1，其中胞外酶活达15700 U'ml/1，占总酶活的82.6%,发酵时间縮 短到42h。
1、 菌种
枯草芽孢杆菌(5a"7/ussp.)WSHDZ-01，已在微生物学通报2007.34(4).
p667公开，并由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M206062，已在中国专利200610040898.0，发明名称一种碱性过氧化氢酶 高产菌及用该菌株发酵生产碱性过氧化氢酶中公开，
公开日2007年5月23曰。
2、 培养基
种子培养基6。麦芽汁，pH7.5， 121。C灭菌15min。
发酵培养基(g'L"):葡萄糖10,NaNO35，MgSO4'7H2O0.5， Na2HP049.52， KH2P04 0.6， FeS04.7H20 0.0025， pH7.5， 121 。C灭菌15 min。
3、 培养方法
液体种子培养方法250 mL三角瓶装70 mL种子培养基，接种一环斜面 种子后在旋转式摇床上200 rmin" ， 37。C振荡培养12h。
发酵方法发酵培养基80mL盛于500mL三角瓶中，按6%的接种量接种 子培养基后在旋转式摇床上振荡培养，37°C、 200 rmin'1培养48 h，按实验要 求添加不同浓度的乙醇和/或过氧化氢。
4、 菌体干重测定
取20 mL发酵液于50 mL离心管中，10 000 r/min离心10 min，倾去上清液， 去离子水洗涤沉淀l次，105。C烘干至恒重后称重。
5、 酶液样品的制备及测定
取20mL发酵液于50mL离心管中，10000 r'mirf1、 4。C下离心10min，上清 液作为胞外过氧化氢酶测定样品，菌泥以50mMK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.0)洗涤沉淀2次，以相同体积的缓冲液重悬后置冰浴预冷；超声波破碎9min， 镜检破碎的效果；10000 rmin"离心15min，上清液即为胞内过氧化氢酶测定样 品。采用分光光度法在37t下测定。反应总体积为3mL，含O.lmL酶液样品 和2.9 mL含10mmol/L的50mmol/LKH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH7.0)， H202 的分解速率用UV-2450型紫外可见光分光光度计在240 nm下测定。
酶活定义为在37 "C下，分解H202 1 pmol，min"所需的酶量为一个酶活单位。 本发明的有益效果利用本发明提高Bfl"7/w sp.WSHDZ-Ol发酵产CAT的 能力，CAT产量从未胁迫前的6060 U'mL"提高到15000 U'mU1， 3L罐CAT产量达28000 U'mL—1。


图1乙醇对CAT合成的影响
图2不同乙醇添加方式下CAT产量、糖耗曲线、菌体生长、和分批添加时 乙醇消耗速率
图3 &02对CAT合成的影响
图4不同过氧化氢添加方式下非胞外酶活、糖耗曲线、菌体生长、CAT产
图5混合添加乙醇和过氧化氢对CAT总产量、菌体生长、胞外酶活、非胞 外酶活的影响
具体实施例方式
实施例l:培养基中添加乙醇胁迫菌体产酶
按照图1所示，在培养基中分别添加不同浓度的乙醇，然后再在不同时间
添加最适量乙醇。0h在培养基中添加1。/。(v/v)乙醇时，CAT的产量最高可达到 13000U'mL-1。
实施例2: 3L罐上乙醇胁迫菌体产酶
按照图2所示，3L罐上采取不同的乙醇添加策略使CAT酶活大幅提高分 阶段恒速流加体积浓度5%的乙醇，滴加速度为0-12h以4.13mL/h， 12-36h以 10.05mL/h， 36h至发酵结束以11.42mL/h滴加；0 h、 12 h、 36 h分批添加培养 基中体积浓度达1.0%的乙醇； 一次性添加011添加培养基中体积浓度达1.0% 的乙醇；CAT最高酶活分别达28000 U'mL'1， 25000 U'mL"和22000 U'mL"。
实施例3:培养基中添加过氧化氢胁迫菌体产酶
按照图3所示，在培养基中分别添加不同浓度的过氧化氢，然后再在不同 时间添加最适量过氧化氢。12h在培养基中添加0.3。/。(v/v)过氧化氢时，CAT的 产量最高可达到9200U'mL'1。
实施例4: 3L罐上过氧化氢胁迫菌体产酶 按照图4所示，H202的添加能促进CAT酶活的提高 一次性添加的情况下酶活 可达21600 U.mU1，或12 h、 24 h分批添加培养基中体积浓度达0.15 %的H202 的情况下酶活可达23000 U'mL'1 。
实施例5: 3L罐上乙醇和过氧化氢共同胁迫菌体产酶
或在3L罐上分阶段恒速流加体积浓度5。/。的乙醇，滴加速度为0-12h以 4.13mL/h， 12-36h以10.05mL/h， 36h至发酵结束以11.42mL/h滴加和同时在12h、 16h、 20h、 24h、 2811分批添加培养基中体积浓度达0.06%的11202;总酶活达 19000 U'mL"，其中胞外酶活达157001>1111/1，占总酶活的82.6%，发酵时间縮 短到42h。
权利要求
1、一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌Bacillus sp.WSHDZ-01发酵产过氧化氢酶的方法，其特征是利用Bacillus sp.WSHDZ-01为生产菌株，通过在培养基中添加乙醇和/或过氧化氢，胁迫菌体产过氧化氢酶；添加方式为在发酵开始后0h、12h、36h分批添加培养基中体积浓度达1.0％的乙醇，总酶活达15000U·mL-1；3L罐上采取不同的乙醇添加策略使CAT酶活大幅提高分阶段恒速流加体积浓度5％的乙醇，滴加速度为0-12h以4.13mL/h，12-36h以10.05mL/h 36h至发酵结束以11.42mL/h滴加；或0h、12h、36h分批添加培养基中体积浓度达1.0％的乙醇；或0h一次性添加培养基中体积浓度达1.0％的乙醇；CAT最高酶活分别达28000U·mL-1，25000U·mL-1和22000U·mL-1；或在发酵开始后12h在培养基中添加培养基中体积浓度达0.3％的H2O2，总酶活达9200U·mL-1；3L罐上在发酵开始后12h一次性添加培养基中体积浓度达0.3％的H2O2，酶活可达21600U·mL-1，或12h、24h分批添加培养基中体积浓度达0.15％的H2O2，总酶活达23000U·mL-1；或在3L罐上分阶段恒速流加体积浓度5％的乙醇，滴加速度为0-12h以4.13mL/h，12-36h以10.05mL/h，36h至发酵结束以11.42mL/h滴加和同时在12h、16h、20h、24h、28h分批添加培养基中体积浓度达0.06％的H2O2；总酶活达19000U·mL-1，其中胞外酶活达15700U·mL-1，占总酶活的82.6％，发酵时间缩短到42h。
全文摘要
一种添加乙醇和/或过氧化氢胁迫枯草芽孢杆菌发酵产过氧化氢酶的方法，属于微生物发酵产酶技术领域。本发明利用枯草芽孢杆菌Bacillus sp.WSHDZ-01为生产菌株，通过在培养基中添加乙醇和/或过氧化氢，胁迫菌体产过氧化氢酶。过氧化氢酶产量从未胁迫前的6060U·ml^-1提高到15000U·ml^-1，3l罐过氧化氢酶产量达28000U·ml^-1。利用此方法生产的过氧化氢酶可应用于纺织前处理。
文档编号C12N9/08GK101525601SQ200910030830
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者华兆哲, 姚丹丹, 李江华, 坚 陈 申请人:江南大学