专利名称：人肝增殖素的制作方法
技术领域：
本发明涉及人肝增殖素cDNA的分离，核苷酸序列分析及生产其编码蛋白的方法和表达产物促肝细胞增殖活性鉴定等方面该基因表达产物有潜在的临床应用价值。
2/3肝部分切除PH大鼠血液经交叉循环可促进正常大鼠肝细胞增殖，受此启发，人们开始从PH后大鼠外周血发掘特异肝增殖刺激因子，并最终从中分离出一种能强列刺激肝细胞增殖的蛋白质，即肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，但进一步的研究表明该因子并非象人们所期望的那样具有肝特异性，肝细胞亦非其主要靶细胞LaBrecque等最早描述了存在于PH后大鼠肝组织中的一种特异性肝细胞刺激因子即肝脏刺激物(Hepatic Stimulator Substance，HSS)，随后，许多实验证实该物质广泛存在于哺乳动物新生肝，幼仔肝及再生肝组织中，但各家命名不一，因而显得十分混乱，从人胎肝、新生小牛肝及乳猪肝等提取的此类因子已广泛应用临床治疗重型病毒性肝炎，并取得较好疗效，但受其来源、种属差异及生化制剂本身的局限，这些产品的大规模生产及质量的提高受到较大限制，因此，国内、外多家致力于此类因子的分子克隆。
本发明的目的在于提供一种人肝增殖素。
八十年代末，我们率先在国内、外开展了人胎肝中促肝细胞增殖活性物质的研究，在对其生物活性进行深入研究，证明人胎肝组织中确含有一种新的促肝细胞增殖活性因子的基础上，利用超滤，DEAE-Cellulose，FPLC-monoQ，HPLC等对此活性因子进行纯化，其相对活性提高近5万倍，但由于该蛋白质氨基端的封闭，氨基酸序列测定未获成功。总的来说，该因子基本特性是分子量约1.4～2.0KDa，对蛋白酶敏感，耐热，可促进肝细胞增殖，其生物活性具有器官特异性，无种属特异性。从人胎肝中提取poly(A)+mRHA，在非洲爪蟾卵母细胞可翻译出此因子的活性，表明该因子是肝细胞基因表达产物。本发明利用功能表达筛选法，从人胎肝cDNA文库中筛选到编码促肝增殖蛋白质的cDNA，并对其表达产物的生物活性进行了研究。
从4月龄水囊引产人胎肝组织提取mRNA，以pcDNAI质粒为载体，构建表达型人胎肝cDNA文库，将文库进行矩阵排列后，通过功能表达筛选人肝增殖素全长cDNA，核苷酸序列测定表明该克隆含有375bp的读码框架(序列见
图1)，推导的氨基酸序列见图2，理论分子量为15KDa，与提纯蛋白质在变性条件下SDS-PAGE结果相符。通过原该、真核系统表达的产物具有促进肝细胞增殖及抗肝损伤的活性，因而有可能应用临床治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎等疾病。
本发明的实施方法如下图1为本发明核苷酸序列图。
图2为本发明氨基酸序列图。
图3为本发明的实施方法图。
图4为pcDNAI质粒的结构图。
图5为文库的矩阵排列示意图。
1.mRNA的提取在以前的研究中，我们证实4月龄人胎肝组织中特异活性最高，因此选择4月龄人胎肝组织为起始材料，利用总RNA提取，mRNA纯化试剂盒(Promcga公司)提取mRNA。甲醛变性凝胶电泳表明所提mRHA完整性良好。
2.cDNA文库的建取所提10ugmRNA，以5’-AATTCGCGGCCGC-(T)15为引物，Pharmacia公司cDNA合成试剂盒进行cDNA合成，(pcDNAI质粒购自Clontech公司，结构见图4)，进而利用EcoRI人工接头，将合成cDNA定向重组于pcDNAI质粒，转化大肠杆菌JM109，获107转化子，随机挑出转化子，经EcoRI、NotI酶切分析，4/7转化子含有外源插入片段，平均大小约1.5Kb，表明所建文库质量良好。
3.文库的矩阵排列及表达筛选从所构建文库取约108重组子的细菌悬液，稀释于含氨苄青霉素、四环素的LB培养液，按每孔100μL约50个重组子克隆接种于96孔细胞培养板(各板留出第12列和第H行，供排列矩阵用)，培养板标记后于30℃培养过夜，次日按每行(列)从各孔分别取10u1细菌悬液接种于对应行或列空孔形成行池(pool)、列池(pool)(见图4)，这样文库被排列成210个小矩阵，约含210×77×50重组子。
文库排列完成后，以板为单位，从行池和列池取10ul细胞悬液，接种于20ml(含氨苄青霉素LB培养液，分别提取质粒，取约10ug质粒DNA，以标准DEAE-葡聚糖法转染cos-7细胞，转染前1天，按细胞密度4×105/60mm皿传代培养cos-7细胞，以含5％小牛血清的1640培养液培养24小时，DEAE-葡聚糖法转染cos-7细胞基本按Promega公司试剂盒进行，故为对照，同时将pcDNAI质粒转染入cos-7细胞，转染后4小时，以新鲜1640培养液轻轻洗涤细胞二次，并加入3ml不含血清的1640培养液，于37℃5％CO2条件下培养72小时后，收集培养上清和细胞，超声破碎后，65℃加热10分钟，72000g离心20分钟，收上清，以1/3肝部分切除模型进行活性检测，有活性的板行、列阳性池交叉孔细菌在含氨苄青霉素平板上涂板，挑出单个克隆进行矩阵排列，重复上述筛选过程，直至得到单一克隆。
4、生物活性检测，筛选结果及阳性克隆序列分析我们选择了国际上公认的模型之一——1/3肝部分切除模型观察表达产物的促肝细胞增殖活性。取200±10gWister大白鼠，按Higgens和Anderson介绍的方法行1/3肝部分切除，术后4小时腹腔注射表达产物1ml，同时设生理盐水及荷空质粒对照组，每组5只动物，20小时按100uci/kg体重腹腔注射3H-TdR，2小时后处死大鼠并于固定部位取肝组织，按Morley等介绍的方法进行DNA提取及8H-TdR掺入计数，结果以cpm/ug DNA计算。活性单位以刺激指数表示，刺激指数＝实验组cpm/对照组cpm值。经功能筛选第28板的G行池和8列池表达产物具有促肝增殖活性，经再一轮筛选得到单一阳性克隆，其表达产物具有促肝增殖活性(刺激指数＝3.2)并具有剂量一效应正相关。对此克隆以末端终止法进行核苷序列测定，表明含有375bp的读码框架(图1)，能编码125AA，分子量为15KDa的蛋白质(图2)。
5.原核表达生产肝增殖素按图1序列合成引物引物15′-CGGAATTCATGCGGACGCAGCAGAAGC-3′；引物25′-GCGGATCCCTAGTCACAGGAGCCATCC-3′；以阳性克隆cDNA为模板，在100ul含5mM引物1，引物2，50mMKCL，10mMTris-HCL(PH9.0)，0.1％TritonX-100，1.5mMMgCL2，200mMdNTP，2.0uTaq DNA聚合酶(Promega公司)体系进行PCR，其参数为95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，共35次循环，最后一次循环后72℃延伸7分钟；PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，并回收约390bp特异扩增片段，经纯化后，以EcoRI，BamHI酶切4h，并与以相应酶切的原核表达载体pBV-220(由中国病毒基因工程国家重点实验室候云德教授惠赠)连接，取约10ng连接产物，以标准实验过程转化氯化钙法制备的感受态E.coliJM109，转化产物在含氨苄青霉素LB平板上30℃培养过夜，挑出转化子于10ml含氨苄青霉素LB培养液培养，提取质粒，以EcoRI，BamHI酶切，三株克隆含有390bp的外源插入片段，末端终止法核苷酸序列测定结果同表1，且插入方向正确；将单个阳性转化子于10ml含氨苄青霉素LB培养液30℃培养过液，次日按2％于LB培养液30℃扩增培养至0D600≈0.4～0.5，迅速提高培养温度至42℃，继续培养5小时，离心收集细菌，SDS-PAGE检测，表明有特异蛋白表达带，分子量约15KDa，与理论值一致。表达产物同样具有促1/3肝部分切除大鼠肝细胞增殖的活性6.抗肝损伤活性经预试验，以死亡率，病理变化及肝功能为指标综合选定4ml/kgCCL4(1∶1 CCL4∶豆油)为最佳致死剂量。取雄性Wister大白鼠60只，体重200±15g，每只按4ml/kg一次性腹腔注射CCL4，4小时后，随机分成3组，每组20只大鼠，分别一次性腹腔注射阳性克隆转化cos-7细胞裂解液1ml，生理盐水1ml及荷空质粒转化cos-7细胞上清及裂解液1ml，逐日记录死亡动物，存活超过120h计为存活动物，结果两组对照组存活率均为15％，阳性克隆组存活率达40％，此外，我们还观察到重组肝增殖素具有降低中毒大鼠外周血转氨酶水平的作用，表明重组肝增殖素具有抗肝损伤的活性。
总之，本发明公开了一种人肝增殖素的核苷酸序列，并提供了表达产物的理化性质(如耐热、分子量为15KDa)及生物活性检测方法(如体内生物活性)。此序列可重组于任何表达载体，以进行原核、真核(如细菌、酵母、昆虫、高等值物，培养的哺乳细胞等)的表达。
本发明的cDNA及其编码的多肽产物可通过与可检测标记物(如32p-dATP、125I等)标记，而成为一种试剂，用于固定组织，液体样品的检测及DNA杂交以确定人肝增殖素基因定位和染色体图谱中相关基因的定位。
由于重组人肝增殖素具有促进肝细胞增殖及抗肝损伤的活性，因此本发明的重组多肽产品或配有稀释剂，辅剂等的制品可能应用临床治疗严重肝病(如重型病毒性肝炎)。
权利要求
1.一种编码人肝增殖素多肽的核苷酸序列，它具有附图1所列DNA序列。
2.根据权利要求1的所述核苷酸序列，它包括附图1中所列DNA序列的互补链，以及能编码人肝增殖素和其类似物的基因序列和人工合成DNA序列。
3.一种人肝增殖素，它能促进肝细胞增殖并且具有提高CCL4诱导肝功能衰竭大鼠存活率的作用，其分子量为15KDa，并且含有附图2所示氨基酸序列。
4.一种重组生产人肝增殖素的方法，其特征在于将权利要求1-2所述DNA序列置于合适载体中，转化原核或真核宿主细胞，在合适条件下培养转化细胞，得到人肝增殖素多肽
5.根据权利要求4所述方法，其中合适载体为原核表达载体，其中原核宿主为大肠杆菌。
6.根据权利要求4所述方法，其中真核宿主细胞为哺乳细胞。
全文摘要
利用功能筛选法分离到人的能编码一种新的促肝增殖物质—肝增殖素的全长cDNA，其中含有375bp，能编码125氨基酸组成蛋白的开放读码框架，理论推算此蛋白分子量为15KDa，与变性条件下SDS-PAGE结果相符；由原核或真核产生的重组肝增殖素具有促进40％肝部分切除大鼠肝细胞增殖及提高CCL4诱导肝功能衰竭大鼠存活率的作用，揭示重组肝增殖素有可能应用临床治疗重型肝炎，慢性活动性肝炎等严重肝病。
文档编号C12N15/85GK1158895SQ9610320
公开日1997年9月10日 申请日期1996年3月8日 优先权日1996年3月8日
发明者杨晓明, 贺福初, 邱兆华, 谢玲, 吴祖泽, 宫锋, 胡志远, 魏汉东, 何浩 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所